Summary
この原稿は、同時に腸球菌属を定量することができる二重デジタルPCRアッセイ。レクリエーション水域における一般的な人間と関連糞便汚染の指標としてHF183遺伝子マーカーを説明しています。
Abstract
この原稿は、 エンテロコッカス属の同時定量。と人間の糞便関連HF183のマーカーのための二重デジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）について説明します。 EntHF183二重DPCR（ここに至ってEntHF183 DPCRと呼ぶ）アッセイは、その公開された個々の定量的PCR（定量PCR）カウンターパートと同じプライマーおよびプローブ配列を使用しています。同様に、前のqPCRに実行されるように、同じ水のろ過とDNA抽出手順はDPCRを実行する前に続いています。しかし、二重DPCRアッセイは定量PCRアッセイを上回るいくつかの利点を有します。最も重要なことは、DPCRアッセイは、そのターゲットの直接定量することにより、それ故に関連するバイアスとばらつきを標準曲線を実行しているとする必要がなくなります。定量PCR（ すなわち同時定量） エンテロコッカスとHF183を二重化しながら加えて、多くの場合、試料中にあまり豊富で、ターゲットの深刻な過小評価につながる、DPCRは、両方のターゲットの一貫性の定量化を提供し、研ぎます彼女は同じ反応で個別にまたは同時に定量しました。 DPCRアッセイはまた、qPCRにより許容されるものよりも1〜2桁であるPCRの阻害剤濃度を許容することができます。それは、同時に2つの別々のqPCRアッセイを実行するために必要とせずに、一般的および環境水における人間関連糞便汚染の両方で、正確で再現性の情報を提供するため、これらの利点は、EntHF183 DPCRアッセイは特に魅力的です。定量PCRを超えるその利点にもかかわらず、現在利用可能な機器とDPCRアッセイの上部定量限界は、定量PCRによって達成可能なものよりも大きさの約4桁低いです。このため、希釈は、通常、汚水の流出後に観察されるような標的生物の高濃度の測定のために必要とされます。
Introduction
それらは伝統的な培養ベースの方法に比べてより速く、より柔軟かつ特異的であるため、定量的PCR（定量PCR）法が広く娯楽水質監視及び微生物源追跡用途に使用されてきました。その結果、定量PCRは、 エンテロコッカス属などの一般的な糞便指標の急速な水のモニタリング結果を達成するために推奨されている。改訂USEPAレクリエーション水質基準1で。多くのqPCRアッセイはまた、環境水2に糞便汚染の発生源を特定するために開発および検証されてきました。これらの中でも、HF183マーカーアッセイは、最も頻繁に人間関連糞便汚染3を識別するために使用される一つです。
彼らは定量化のための標準曲線に依存しているためしかし、定量PCRの結果は、多くの場合、バイアスすることができます。定量PCRはスタンから、その定量化サイクル（CQ）を補間することによって、サンプル中の標的の未知の濃度を定量化CQと直列に希釈した標準のセットの対数量との間の線形関係を記述する準の曲線。信頼性と一貫性標準物質の欠如は、したがって、大幅に定量PCRの結果にバイアスをかけることができます。研究は、定量PCRの結果は、異なるベンダー4と同じベンダ5から規格の異なるバッチを使用して、2倍から標準を使用して約半分のログによって異なっていることを示しました。
デジタルPCR（DPCR）技術は、均一なナノリットルまたはピコリットルの反応6の数千または数百万へのバルク定量PCRを分割することによって生成されたミニチュアPCRの大量に陽性の頻度をカウントすることにより、未知試料を定量化します。パーティションは油中水型液滴（ すなわち 、この記事）、またはチップ上の小室であるかどうかは、それぞれ（ すなわち 、この記事）液滴デジタルPCRまたはチャンバデジタルPCR、と呼ばれています。より高い試料濃度は、標的DNAの存在をもたらしますパーティションの高い割合で（したがって、正PCR）、ポアソン分布で近似関係。このように、バイナリ結果（正または負PCR）が記録され、正の液滴の周波数は、定量PCRのような標準曲線のための必要性を排除し、直接ポアソン近似を介して未知試料の濃度を計算するために使用されます。
デジタルPCR定量のこのバイナリ性質は定量PCR 7の上に付加的な利点を提供します。遅延増幅がまだ正のPCRを得ることができるので、DPCR定量は、増幅効率を低下させる阻害に対してよりロバストです。定量PCR 8-10と比較して、DPCRの高精度化につながる、定量PCRである同様に、DPCRの定量化は、Cqの値の変動による影響を受けません。
また、分割処理を効果的amplificatio中（基質競合を最小化する、各小滴中の標的DNAの存在の非常に少量を保証します定量PCR（ すなわちアッセイは、同時に2つのDNA標的を測定）の二重化を実現するための共通の障害となっている別のDNA標的）のn個。このように、二重またはシンプレックスで実行が（ つまり、一つのターゲットは、単一のアッセイで測定された）かどうかDPCRは、両方のターゲット7,11のほとんど区別できなく定量化を生成します。
この記事で説明したデジタルPCRアッセイ（EntHF183 DPCR）の目標は、一般的な糞便指標腸球菌属の同時直接定量を得ることである。そして改善された精度、再現性および阻害に対するロバスト性を有するヒト、糞便関連HF183マーカーは、その定量PCRと比較します対応。このアッセイは、正常な環境淡水、海水、および種々の糞便物質7の糞便汚染を定量するために使用されているだけでなく、水と廃水の任意の他のタイプに適用することができます。このアッセイは、原因それに堆積物や土壌を分析するための非常に有望ですsの阻害に対する高い耐性が、は更なる試験があるため、サンプルのこれらのタイプの中の阻害剤混合物の複雑さが要求されます。
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Protocol
1.アッセイ混合物の準備
- TE pH8の緩衝液中の全ての分子グレードの水でプライマーおよびプローブ[エンテロF1A、エンテロR1、GPL813TQ 12のために100マイクロモル/ Lのストック濃度を作ります。 HF183-1、BthetR1、BthetP1 3]。
注：2のターゲットのためのプローブは、蛍光材料/機器のリストに示されているように異なる蛍光体7で標識されています。 - 反応計画ごとに、混合することにより、マスターミックスを調製する、12μlのデジタルPCRミックス（2回の在庫、材料/機器のリストを参照してください）、0.216μlの各フォワードおよびリバースプライマー、0.06各蛍光プローブ、および5.016μlのヌクレアーゼを含まない水μL（最終濃度：900 nMの各プライマー、250nMの各プローブ）。上下ピペット少なくとも10倍溶液に気泡を導入しない注意しながら混合します。
- 6μlのDNAテンプレートに混合正規のPCRチューブあるいはプレートにピペット（ステップ1.2から）18μlのマスターミックスは、（説明previouとして抽出しますずるい13）の液滴生成のためのアッセイ混合物を作るために。重複してサンプルを実行している場合は、ピペットマスターミックス36μlの各ウェルに12μlのDNAテンプレート。プレート上の対応する複製ウェルは空のままにしておきます。ポジティブコントロール（ マテリアル/機器のリストを参照）、鋳型なしのコントロール（NTC）（ すなわち 、テンプレートとして使用される分子グレードの水で）が挙げられます。
注：ポジティブコントロールは、アッセイが正しく実行されており、NTCは、プレート内には汚染がないことを確認し、データ分析の後の蛍光ベースラインを設定する必要があることを確認する必要があります。初めてのユーザーは、希釈されていないと希釈された両方のDNAサンプルを使用することをお勧めします。
2.液滴の生成およびPCRプレートのセットアップ
- マルチチャンネルピペットを用いてダウンし、約15回ピペッティングすることによりアッセイ混合物を混ぜます。ピペットチップは、混合物内の余分な泡を避けるために液体内に留まることを確認してください。
- イン（8ウエルを含む）ERTカートリッジ1白カートリッジホルダへとカートリッジホルダシャットをクリックします。カートリッジ1は、しっかりと所定の位置になりましたし、液滴を発生させながらホルダーから外れることはできません。マルチチャンネルピペットを用いて、穏やかに気泡を導入することなく、「サンプル」とマークカートリッジの中間位置にアッセイ混合物の20μLを移します。
- ピペットは、カートリッジの左側面に液滴生成油の70μl中（ '・オイル "と記されました）。
- ガスケットはガスケットがフラットと4によって均等に保持されることを確認することでカバーカートリッジは、カートリッジの縁に向かって刻み。カートリッジを開き、配置する液滴発生器の緑色の点灯ボタンを押します。ジェネレータを閉じるために、再度緑色の点灯ボタンを押します。
注：ドアが閉じると、ボタンが淡色表示され、ドアを再び開くことはできませんし、液滴の生成は、すぐに約1分間継続を開始します。 - 8つ以上の反応をしている場合は、2番目にカートリッジ2を配置白色カートリッジホルダ液滴発生が全セットアップ時間を節約するために進行中にカートリッジ1と同様に調製。
- 薄暗い点灯ボタンは、液滴の生成が完了したことを示す緑色に点灯したときに液滴発生器のドアを開きます。 、カートリッジ1を含む白色カートリッジホルダを取り外して脇に置き、及び液滴発生器にカートリッジ2を配置します。
- カートリッジ1からガスケットを取り外し、廃棄します。静かに熱サイクル用（室温に保持）最終PCRプレートにカートリッジ（ 'ドロップレット "と記された）の第3列から生成された液滴の総容量（約40μl）を転送します。
注意：新しく生成された液滴を破損する可能性がアクションとして白カートリッジホルダをunclickないでください。液滴が最終プレートに転送された後にのみ、カートリッジホルダを開きます。 - 繰り返して、追加のサンプルについての2.1から2.7を繰り返します。
- 全ての液滴が最終PCRプレートにあるとき、穿孔を配置箔は、プレートの上部にカバーし、プレートシーラーの上に置きます。シーラーで180℃、プレス「プレイ」にシーラーを設定し、10秒間のシールをしましょう。
3.サーマルサイクリングと液滴読書
- サーマルサイクラーに密封されたプレートを置き、ステップ2.7で使用される最終的なPCRプレート、および2.0℃/秒の温度ランピング速度と互換性1。
- 次のように熱プログラムを実行します：10分保持に続いて94℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で10分間、および60℃で60秒、オプションの98°C（で：最終保持を4でか15゜C）。
- サイクルの完了時に、各ウェル中の各液滴の蛍光を自動測定する液滴リーダーにプレートを転送します。また、液滴の読み取り前まで4℃で3日間プレートを保存。液滴が読書を進める前に、室温であることを確認します。
- セットアップに液滴読みを添付ソフトウェアを開きます。に「サンプル、 ''アッセイ1 'と'アッセイ2」：空の96ウェルプレートの概略を含むデフォルトの「セットアップ」メニューには、二重の3セクションを含むメニューを開くために十分A1をクリックしました
- 「サンプル」セクションで、「名前」を押して入力するか、またはマークされた右側のボックスチェックラベルされたボックスにサンプルIDを入力し、[適用を」。次に、「実験」の標識ドロップダウンメニューをクリックして、「RED」（まれなイベント検出）を選択し、[Enter]をクリックします。
- 「検定1」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば 、 腸球菌）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル不明1 'を選択し、[Enter]をクリックします。
- 「検定2」表記のセクションに移動します「名前」セクションでは、アッセイ（ 例えば HF183）を記入し、[Enter]をクリックします。ラベル「タイプ」の下にあるボックスにメニューANドロップダウンをクリックします「チャンネル2不明」を選択し、[Enter]をクリックしますdが。 3.3.4へのステップ3.3.2からすべての情報は今もA1に存在しています。
- 液滴を含む後続のすべてのウェルに名前を付けます。合計セットアップ時間を節約するために、同時に複数のウェルを選択するには、「Shiftキー」や「Ctrlキーを、]をクリックします。
- ときプレートのデジタル描写はメニューの右下の物理的なプレートは、を押して「OK」を反映しています。プレートの概略図の上部に表示される新しいメニューで、[テンプレート]セクションの下の[名前を付けて保存」と名前を選択し、プレートを保存します。
- 画面の左側には「ファイル名を指定して実行」をクリックし、ポップアウト」実行オプション」ウィンドウで、適切な色素セットを選択します。データ収集が開始し、ソフトウェアでリアルタイムに表示されます。
4.データ分析とレポーティング
- リーダーが終了し、ボックスには、「完全なファイル名を指定して実行」を知らせる表示された場合、「OK」をクリックします。
注意：ソフトウェアは、ソフトウェアの「分析」セクションの下に、最終的なデータファイルが表示されます。このビューでは、ソフトウェアは、「2D振幅」のデータプロットに選択したすべてのプレートのウェルとデフォルト値を持っています。 - 正と負の液滴間の分離を確認してください。 NTCウェル内のすべての液滴中の蛍光がベースライン近くにあることを確認してください。
- ラベルの付いたボタンをクリックして「イベント」。提示されたヒストグラムの右側にある「合計」という名前のボックスとウェルあたりに受け入れ液滴の合計数を表示するには、一番下にある「シングル」という名前のボックスをクリックします。 Ctrlキーを押しながら除外されるだけでなく（複数可）をクリックして、<万液滴7を含む任意のウェルを除外します。
- 両方のターゲットのNTCウェルにおける負の液滴の上に約1標準偏差（500から700蛍光単位）で蛍光しきい値を設定するには、「1D振幅」と表記ボタンをクリックします。画面アンの非常に左に2つの閾値のボタンを示す「自動分析」DER、それを介して実行しているピンク色の固体の水平ラインを持って右側にあるアイコンを選択します。
- 振幅の各グラフの下の「設定されたしきい値」の左にあるボックスをクリックし、適切な蛍光閾値の値を入力します。 μlの反応あたりのコピーで標的濃度は、その後、自動的に計算されます。
注意：しきい値が異なるターゲットのために同一である必要はありません。 - 1D振幅画面上の左上隅にある[エクスポート]ボタンをクリックして、.csvファイルに結果をエクスポートします。 .csvファイルでは、μlのDNA鋳型あたりのターゲットのコピーにμlの反応ごとターゲットのコピー（ エンテロコッカス属の23S遺伝子。またはHF183マーカー）からそれを変換するために、4によってエクスポートされた目標濃度を掛けます。
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Representative Results
良いEntHF183二重DPCRランが受け入れ滴（ 約 10,000-17,000）と負と正の液滴7用の蛍光値との間に比較的大きな差（ 約 5000）の比較的多数をもたらすべきです。液滴の異常に低い数は、可能性が高い液滴生成過程での問題を示しており、万液滴のカットオフは、この記事で使用した液滴DPCRシステムからの経験的データに基づいて提案されています。正と負の液滴間の弱い分離（ すなわち小さい蛍光の差）が抑制または分解プローブ7を示すことができます。
全体的に、定量PCRが規格に関連するバイアスを補正した場合EntHF183二重DPCRアッセイは、シンプレックスのqPCRからのものに非常に匹敵する結果を生じ、全く阻害7はありません。 EntHF183二重DPCRアッセイおよびCORからの結果応答シンプレックスDPCRアッセイは、次の2つの形式7（ 図1）との間に非常に一貫性があり、多くの場合、区別することはできません。また、DPCRのアッセイはまた、阻害剤濃度の定量PCRの対応7（ 図2）によって許容よりも高い1〜2桁を許容することができます。
図1：左と右のパネルEntHF183二重DPCRアッセイおよび対応するシンプレックスDPCRアッセイにより糞便や水のサンプルの定量化は、二重とシンプレックス結果間の対応する相関係数（P <0.001）で、それぞれ、 エンテロコッカスおよびHF183の定量を表示します。実線は、回帰直線を示し、グレーの陰影は、対応する標準誤差を示します。シンボルは、サンプルの種類を示す（丸、三角 sおよび十字は糞便、淡水、海洋水のサンプル、それぞれ）を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：シンプレックス定量PCRときれいな下水DNAでHF183マーカーのDPCRの定量化を二重鎖は、PCR阻害物質（フミン酸）の濃度の増加でスパイク三角形とx十字それぞれ、DPCRと定量PCR定量化を示します。阻害剤の非存在下で予想されるHF183定量は、（2つの水平の点線の間、 すなわち ）の95％信頼区間として定義されます。 「-1」の結果は、非検出を示す。 エンテロコッカス定量は、対応する定量PCRアッセイ7によってよりEntHF183二重DPCRアッセイによる阻害剤と同様に高い耐性を示しています。= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。マスターミックスは、従来の定量PCRマスターミックスよりも粘性であるため、まず、アッセイ混合物の混合が困難な場合があります。単純なボルテックスは、次に、アッセイ混合物中で、その後、液滴にDNA鋳型の不均一な分布をもたらす不十分な混合をもたらすことができます。プロトコールに記載ミキシング・バイ・ピペット操作技術は、正確なDPCRの定量化を確実にするために従わなければなりません。第二に、液滴が均一な形状及びサイズで生成されることを保証することが重要です。 1つのカートリッジの液滴の生成を完了する液滴発生器にかかる時間が通常よりも短い場合の機会に留意すること。これは、次善の液滴の生成を指示することができます。必要に応じて、各カートリッジの液滴発生時間は、トラブルシューティングのために記録することができます。第三に、せん断することなく、最終的なPCRプレートにカートリッジから生成された液滴の全体の40μLを転送することが重要です液滴および定量化のための十分な液滴を持っていない避けます。以下の技術は、転送のために使用することができる：1）40μlにマルチチャンネルピペットを設定し、45°の角度で「ドロップレット」とマークカートリッジ（）の右側のセクションにヒントを挿入します。 2）ピペットでゆっくり滴アウトし、すべての液滴がピペッティングされていることを確認（任意の液滴が残されている場合は注意して取り、第二ラウンドのためにピペッティングする必要があります）。液滴が除去されたら3）、約半分の方法ダウンだけでなく壁にピペットチップを置くことによって、最終的なプレートに転送し、ゆっくり滴を追い出します。
EntHF183二重DPCRアッセイは、同じ検体に対する既存の個々のqPCRアッセイを超える大きな利点があります。まず、二重DPCRアッセイは、それによって基準7の変動に関連した定量PCR定量化バイアスを排除し、未知数を定量するための標準曲線を必要としません。第二に、二重DPCRアッセイは禁止に耐えることができますまたは対応する定量PCRアッセイ7によって許容よりも高い1〜2桁な濃度。この機能は、多くの場合、PCRの阻害物質が含まれている環境試料（ 例えば雨水サンプル）を分析するための二重DPCRアッセイは非常に魅力的です。第三に、容量が同時にあるエンテロコッカス属及び（2のqPCRアッセイでそれらを別々に定量化するために持つ対）1デュプレックスDPCRアッセイでHF183マーカーの両方を定量化するために、より費用対効果の高い7とは関連付けられている累積ピペッティングの変動を回避することによってデータ量を向上させます二つの別々のアッセイ（対1デュプレックスDPCRアッセイ）を行います。第四に、二重DPCRのアッセイはまた、比較研究7の元良い代替を作り、対応する定量PCRアッセイと比較して、より高い精度と再現性を実証しました。
それにもかかわらず、制限がこの方法のために存在する（利点と限界について詳細に説明します他の場所7）。まず、反応あたり受け入れ滴数はDPCRの上部定量限界（UQL）を決定します。この作業で使用DPCR機器は反応あたり10 5コピーのUQLを有することが報告されている（材料/機器のリストを参照してください）。これは、100から（ すなわち、DNA抽出の間に溶出段階当たり）DNA抽出プロトコールが続いて、100μlのDNAが得られる記載5×10 5 エンテロコッカス細胞および以前に7を想定水100mlあたり2×10 6 HF183コピーに対応します前のDPCR 7のサンプルの処理中に損失することなく水のミリリットル。環境水は、一般的に腸球菌とHF183のような濃度を超えないようにしてください。しかし、サンプル希釈は、汚水流出事故の直後に収集し、動物の糞、未処理下水や水のサンプルのような高濃度サンプルのために考慮されるべきです。第二に、全DNAの高濃度（includingの標的と非標的DNA）の両方が、液滴分割プロセスを妨害することができます。 7を制限酵素により前処理なし以上66 ngの全DNAを使用することをお勧めされていません。 EntHF183二重DPCRアッセイは、定量PCRよりも抑制に対してかなりより堅牢であるが、深刻な阻害が起こるのPCR増幅できない場合第三に、このアッセイは、まだ偽陰性の結果を得ることができます。抑制対策は、したがって、まだ実装する必要があります。標準添加または希釈方法前述のように抑制7を評価することができます。最後に、二重アッセイは、一つだけDPCRプラットフォーム上で検証されている、と分析法バリデーションは、使用前に他のデジタルPCRプラットフォーム上で行われるべきです。
これは同時に、広く受け入れられている水質の指標と糞便汚染7に人気のホスト関連マーカーを定量化する最初の公開二重デジタルPCRアッセイです。実証の利点微生物源の追跡、病原体および抗生物質耐性遺伝子の検出におけるデジタルPCR技術の他の有用な用途EntHF183二重DPCRアッセイ約束の。例えば、一般的な糞便指標（ エンテロコッカス属、大腸菌、一般Bacteroidales）とホスト関連の糞便マーカー（HF183、HumM2、CowM2、LeeSeagull）2は中（EntHF183二重DPCRアッセイのように）同様にペアリングすることができますより費用対効果や一般およびホスト関連の糞便汚染の正確な定量化のための二重DPCRアッセイ。同じソース（または異なるソース）を標的微生物源追跡マーカーはまた、糞便ソースを検出する際の信頼性を高める（または同時に複数の糞便のソースに関する情報を得る）ために二重DPCRアッセイでペアリングすることができました。 PCR阻害剤に対する高い許容度も高いサンプル量の分析は、低感染性用量を有するがENVIRにのみ存在する病原体を検出する確率を高めるために可能性があります低濃度でonmental水。定量PCRを介してデジタルPCRの同様の方法論的な利点は、抗生物質耐性遺伝子の定量化のためのデジタルPCRアッセイの開発に適用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
- Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/ (2012).
- Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
- Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
- Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
- Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
- Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
- Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
- Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
- Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
- Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
- Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).
