Summary
Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.
Abstract
Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digitais duplex (EntHF183 dPCR) para a quantificação simultânea de Enterococcus spp. E o marcador HF183 fecal-associado humana. O EntHF183 duplex dPCR (referido como EntHF183 dPCR hereon) ensaio utiliza as mesmas sequências de Iniciador e Sonda como as suas congéneres PCR quantitativo (qPCR) individuais publicados. Da mesma forma, os mesmos procedimentos de filtragem de água e extração de DNA como realizados antes da qPCR são seguidos antes de executar dPCR. No entanto, o ensaio dPCR duplex tem várias vantagens sobre os ensaios de qPCR. Mais importante, o ensaio dPCR elimina a necessidade de execução de uma curva padrão e, por conseguinte, a polarização e variabilidade associada, por quantificação directa dos seus alvos. Além disso, embora a impressão duplex (isto é quantificação simultânea) Enterococcus e HF183 em qPCR muitas vezes leva a subestimação grave do alvo menos abundantes em uma amostra, dPCR fornece quantificação consistente de ambos os alvos, aguçarela quantificada individualmente ou simultaneamente na mesma reacção. O ensaio dPCR também é capaz de tolerar concentrações de inibidor de PCR que são uma a duas ordens de magnitude maior do que as toleradas por qPCR. Estas vantagens tornam o ensaio EntHF183 dPCR particularmente atraente porque fornece simultaneamente informações precisas e repetíveis em ambos contaminação geral e associada humano-fecal em águas ambientais, sem a necessidade de executar dois ensaios qPCR separadas. Apesar das suas vantagens sobre qPCR, o limite de quantificação do ensaio superior dPCR com instrumentação actualmente disponível é aproximadamente quatro ordens de grandeza menor do que a alcançável por qPCR. Por conseguinte, a diluição é necessário para a medição de concentrações elevadas de organismos alvo, tais como aqueles tipicamente observado após a derrames de esgoto.
Introduction
Os métodos quantitativos de PCR (qPCR) têm sido amplamente utilizados para a monitorização da qualidade da água de recreio e aplicações de monitorização de origem microbiana, porque eles são mais rápidos, mais flexível e específica em comparação com os métodos baseados em cultura tradicionais. Consequentemente, qPCR é recomendado para a obtenção de resultados de monitorização das águas rápidas para os indicadores fecais gerais, tais como Enterococcus spp. Nos critérios de qualidade revistos USEPA águas de recreio 1. Muitos ensaios qPCR também têm sido desenvolvidos e validados para a identificação de fontes de contaminação fecal em águas ambientais 2. Entre estes, os ensaios HF183 marcadores estão entre os mais utilizados para identificar a contaminação fecal associada a 3 humano.
No entanto, os resultados qPCR muitas vezes pode ser tendenciosa, porque dependem de curvas padrão para a quantificação. qPCR quantifica concentrações desconhecidas do alvo em amostras por interpolação seu ciclo de quantificação (CQ) de um standard curva que descreve uma relação linear entre a quantidade Cq e logarítmica de um conjunto de padrões diluído seriadamente. Falta de material de referência confiável e consistente pode, portanto, viés bastante resultados qPCR. Estudos mostraram que os resultados qPCR diferiram em aproximadamente metade de um log usando padrões de diferentes fornecedores 4 e por 2 vezes utilizando diferentes lotes de padrões do mesmo fornecedor 5.
A tecnologia digital PCR (dPCR) quantifica uma amostra desconhecida, contando a frequência de positivos em grande número de PCRs em miniatura que são gerados pelo particionamento de um qPCR em massa para milhares ou milhões de nanoliter uniforme ou reações picolitros 6. É referido como PCR gota digitais (isto é, neste artigo) ou PCR câmara digital de, respectivamente, se as divisórias são água-em-óleo de gotículas (isto é, neste artigo) ou pequenas câmaras sobre um chip. A concentração da amostra mais elevada resultará na presença de ADN alvo(PCR daí positiva), numa proporção superior das divisórias, uma relação aproximada pela distribuição de Poisson. Como tal, os resultados binários (PCR positiva ou negativa) são registados e a frequência de gotículas de positivos é usado para calcular as concentrações das amostras desconhecidas directamente através de Poisson aproximação, eliminando a necessidade de uma curva padrão como no qPCR.
Esta natureza binária de quantificação PCR digital proporciona vantagens adicionais sobre qPCR 7. Uma vez que a amplificação atrasada pode ainda produzir um PCR positivo, dPCR quantificação seja mais robusto contra inibição que reduz a eficiência de amplificação. Da mesma forma, dPCR quantificação não é afectado pela variabilidade em valores Cq como é qPCR, levando a uma maior precisão da dPCR em comparação com 8-10 qPCR.
Além disso, o processo de particionamento garante uma muito pequena quantidade de ADN presente alvo em cada gotícula, minimizando eficazmente competição pelo substrato (durante amplification de alvos diferentes de DNA) que são obstáculos comuns para alcançar duplex (ou seja, um ensaio mede simultaneamente dois alvos de ADN) em qPCR. Como tal, se executado em duplex ou simplex (ou seja, um alvo é medido em um único ensaio) dPCR produz quantificação quase indistinguível de ambos os alvos 7,11.
O objetivo do ensaio de PCR digitais (EntHF183 dPCR) descrito neste artigo é a obtenção de quantificação direta simultânea do indicador fecal geral Enterococcus spp. E o marcador HF183 humano-fecal associada a uma melhor precisão, reprodutibilidade e robustez contra a inibição em comparação com seu qPCR homólogos. Este ensaio tem sido usado com sucesso para quantificar a contaminação fecal no ambiente de água doce, água do mar, e vários material fecal 7, mas também pode ser aplicado a quaisquer outros tipos de águas e águas residuais. Este ensaio é uma grande promessa para a análise de sedimentos ou solos devido a eles elevada tolerância à inibição, mas mais testes é necessária devido às complexidades de inibidor mistura nestes tipos de amostras.
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Protocol
1. Ensaio da preparação da mistura
- Faça concentrações 100 mmol / L de ações para todos os iniciadores em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3].
Nota: Sondas para os dois alvos são fluorescente etiquetado com diferentes fluoróforos 7 como indicados na Lista de materiais / equipamentos. - Prepare mistura principal misturando, por reacção planejado, 12 ul digital de mistura de PCR (2x de ações, ver Lista de materiais / equipamentos), 0,216 mL cada um para a frente e primer, 0,06 mL cada sonda fluorescente reversa e 5.016 mL de água livre de nuclease (concentração final : 900 nm cada iniciador, 250 nM cada sonda). Pipeta cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar ao tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
- Pipeta de 18 mL mix master (a partir do passo 1.2) para um tubo de PCR regular ou placa, misturando no modelo de DNA 6 ul (extraído como descrito Previously 13) para fazer mistura de ensaio para a geração de gotículas. Se a execução de amostras em duplicado, pipeta 36 ul de mistura principal e 12 molde de ADN em cada poço. Deixe os poços em duplicado correspondentes vazio sobre o prato. Incluir controlos positivos (ver lista de materiais / equipamentos) e não há controles de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usado como modelo).
Nota: O controlo positivo é necessário para assegurar que o ensaio é executado correctamente e o CNT é necessário para assegurar que não há contaminação dentro do prato e para definir a linha de base fluorescente mais tarde na análise de dados. usuários de primeira vez são recomendados para usar ambas as amostras de DNA não diluídas e diluídas.
2. Geração Gota e configuração da placa PCR
- Misture as misturas de ensaio pipetando cima para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permanece dentro líquido para evitar que bolhas em excesso dentro da mistura.
- inscartucho de ert 1 (contendo 8 poços) em um suporte de cartucho branco e clique no suporte do cartucho fechada. Cartucho 1 é agora firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto que a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, gentilmente transferir 20 l de mistura de ensaio para a posição do meio do cartucho marcado "amostra" sem a introdução de bolhas de ar.
- Pipetar em 70 ul de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado "Óleo").
- cartucho de tampa com uma junta de vedação para garantir que a junta de vedação é realizada de forma uniforme e plana por a quatro carraças na direcção da extremidade do cartucho. Pressione o botão de luz verde sobre o gerador de gotículas de abrir e coloque o cartucho. Pressione o botão verde iluminado novamente para fechar o gerador.
Nota: Uma vez que a porta se fecha, o botão fica esmaecido, a porta não pode ser reaberto e geração de gota começa imediatamente continuando por cerca de 1 min. - Se fazendo mais de 8 reações, lugar de cartuchos 2 em um segundoo suporte do cartucho e branco preparar da mesma maneira como um cartucho enquanto a geração de gotículas está em andamento para economizar tempo total de instalação.
- Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão dim iluminada fica verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Retire o suporte do branco cartucho contendo cartucho 1, posta de lado, eo cartucho de lugar 2 para o gerador de gota.
- Remova a junta de cartucho 1 e descarte. Suavemente transferir o volume total (aproximadamente 40 ul) de gotículas geradas a partir da terceira coluna do cartucho (marcado 'Gotas') para uma placa de PCR final (mantido à temperatura ambiente) durante o ciclo térmico.
Nota: Não desmarque suporte do cartucho de branco como a ação pode quebrar as gotículas recém-gerados; abrir apenas o suporte do cartucho após as gotículas de ter sido transferido para a placa de final. - Repita os passos de 2,1-2,7 para amostras adicionais.
- Quando todas as gotículas são na placa de PCR final, colocar uma perfurávelcobertura de alumínio em cima do prato e coloque-o sobre o selador de placa. Definir o cimento a 180 ° C, prima 'Play' no selador e deixe selo para 10 seg.
3. ciclos térmicos e Leitura Gota
- Colocar a placa selada no termociclador, um compatível com a placa de PCR final utilizada no passo 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg.
- Executar programa térmico como se segue: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 94 ° C e 60 segundos a 60 ° C, seguido de 10 minutos de espera em 98 ° C (opcional: preensão final em 4 ou 15 ° C).
- Após a conclusão dos ciclos, transferir a placa para um leitor de gota para a medição automática da fluorescência em cada gota em cada poço. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 3 dias antes da leitura das gotículas. Certifique-se as gotas são à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura.
- Abra o software que acompanha a configuração da leitura gota. Dentroo menu padrão 'Setup' contendo um esquema de uma placa de 96 poços vazios, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções: "amostra", "Ensaio 1 'e' Ensaio 2. '
- Na seção 'Sample' digite o ID da amostra na caixa chamada "Nome" e pressione enter ou marque a caixa à direita marcado "Aplicar". Em seguida, clique no menu drop-down rotulados 'Experiment' e escolha 'RED' (detecção evento raro) e clique em entrar.
- Mover para a seção indicada "Ensaio 1. ' Na seção 'Nome' preencher o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em entrar. Na caixa abaixo 'Tipo' rotulado clique no menu drop-down e escolha "Canal 1 Desconhecido" e clique em entrar.
- Mover para a seção indicada "Ensaio 2. ' Na seção 'Nome' preencher o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em entrar. Na caixa abaixo rotulados 'Tipo', clique no menu suspenso um menud Escolha 'Canal 2 Desconhecido "e clique em entrar. Toda a informação de Passos 3.3.2 a 3.3.4 está presente em bem A1.
- Nome todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar tempo total de instalação, clique em "Shift" ou "Ctrl", para escolher vários poços simultaneamente.
- Quando a representação digital do prato espelha a placa física, pressione "OK" na parte inferior direita do menu. No novo menu que aparece no topo do esquema placa, na seção 'Modelo' escolha 'Salvar como' e o nome e salvar o prato.
- À esquerda da tela, clique em "Executar" e escolha apropriada Set Dye em pop-out janela "Opções de Execução" o. A recolha de dados inicia e é exibida em tempo real no software.
4. Análise de Dados e Relatórios
- Quando o leitor está terminada e uma caixa será exibida informando 'Run Complete', clique em 'OK'.
Nota: O softWare exibe o arquivo de dados final na seção "Analisar" do software. Neste ponto de vista, o software tem todos os poços na placa selecionados e padrões para trama de dados do '2D Amplitude'. - Verifique a separação entre as gotículas positivos e negativos. Assegure-se que a fluorescência em todas as gotículas nos poços NTC estão perto da linha de base.
- Clique no botão 'Eventos'. À direita do histograma apresentado clique na caixa chamada "Total" ea caixa com o nome "único" na parte inferior para exibir o número total de gotículas aceites por poço. Excluir quaisquer poços contendo <10.000 gotículas 7, mantendo a tecla Ctrl e clicando sobre o bem (s) a ser excluído.
- Clique no botão indicado como '1D Amplitude' para definir o limiar de fluorescência a cerca de um desvio padrão (500-700 unidades de fluorescência) acima das gotas negativos em poços NTC para ambas as metas. No lado esquerdo do ecrã under "Analisar Auto 'o que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que tem uma linha horizontal rosa contínuo que passa por ele.
- Clique na caixa à esquerda de "Threshold Definir 'no âmbito de cada um dos gráficos de amplitude e digite os valores de limite de fluorescência apropriados. As concentrações de alvo em cópia por reacção uL são então calculados automaticamente.
Nota: Os limiares não precisam ser idênticas para os diferentes alvos. - Exportar os resultados em um arquivo .csv, clicando no botão "Exportar" no canto superior esquerdo na tela do 1D Amplitude. No arquivo .csv, multiplicar a concentração alvo exportados por 4 a convertê-lo de cópia do alvo (23S gene de Enterococcus spp., Ou o marcador HF183) por reacção ul para copiar da meta per l modelo de DNA.
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Representative Results
Um bom EntHF183 duplex dPCR execução deve resultar em número relativamente elevado de gotículas aceites (cerca de 10,000-17,000) e diferença relativamente grande (cerca de 5,000) entre os valores de fluorescência para gotas negativos e positivos 7. Invulgarmente baixo número de gotículas provavelmente indica problemas no processo de geração de gotículas, e um limite de exclusão de 10.000 gotículas é sugerida com base em dados empíricos do sistema dPCR gotícula usado neste artigo. Uma separação mais fraco (ou seja, menor diferença de fluorescência) entre gotículas positivas e negativas pode indicar inibição ou sondas degradadas 7.
Em geral, o ensaio EntHF183 duplex dPCR produz resultados altamente comparável ao que a partir de qPCR simplex quando qPCR é corrigido para desvios associados com as normas e não há nenhuma inibição 7. Os resultados do ensaio EntHF183 duplex dPCR e do CRrespondem ensaios simplex dPCR são altamente consistente e frequentemente indistinguíveis entre os dois formatos de 7 (Figura 1). Além disso, o ensaio de dPCR também podem tolerar concentrações de inibidor de uma a duas ordens de grandeza maior do que a tolerada pelos seus homólogos qPCR 7 (Figura 2).
Figura 1:. Quantificação de amostras de fezes e água, o ensaio EntHF183 duplex dPCR e ensaios dPCR simplex correspondente esquerda e painéis da direita exibir Enterococcus e quantificação HF183, respectivamente, com os coeficientes de correlação correspondentes (p <0,001) entre duplex e os resultados simplex. As linhas contínuas indicam as linhas de regressão e o sombreado cinza indica os correspondentes erros padrão. Os símbolos indicam diferentes tipos de amostras (círculos, triângulo s e cruzes denotam fecal, de água doce, e as amostras de água marinha, respectivamente). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Simplex qPCR e duplex dPCR quantificação do marcador no DNA HF183 esgoto limpo cravado com concentrações crescentes de inibidores de PCR (ácido húmico) Triângulos e X-cruzes indicam dPCR qPCR e quantificação, respectivamente.. A quantificação HF183 esperado na ausência de inibidores é definido como um intervalo de confiança de 95% (isto é, entre as duas linhas tracejadas horizontais). Um "1" indica resultado não-detecção. Enterococcus quantificação mostra de forma semelhante, maior tolerância a inibidores de pelo ensaio EntHF183 duplex dPCR de pelo ensaio qPCR correspondente 7.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53611/53611fig2large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, a mistura das misturas de ensaio pode ser difícil, porque a mistura principal é mais viscoso do que misturas principais qPCR convencionais. vórtex simples pode levar a uma mistura insuficiente, o que conduz por sua vez à distribuição não uniforme de moldes de ADN nas misturas de ensaio e posteriormente nas gotículas. A técnica de mistura-por-pipetagem descrito no protocolo deve ser seguido para garantir a quantificação precisa dPCR. Em segundo lugar, é importante garantir que as gotas são gerados a uma forma e tamanho uniforme. Ser consciente de ocasiões em que o tempo, o gerador gota leva para completar a geração de gota em um cartucho é mais curto do que o habitual. Isso pode indicar geração de gotículas abaixo do ideal. Se necessário, o tempo de geração gota em cada cartucho pode ser gravado para solução de problemas. Em terceiro lugar, é importante para transferir toda a 40 ul de gotículas geradas a partir do cartucho para a placa de PCR final sem cisalhamento dagotículas e evitar para não ter gotículas suficientes para quantificação. As técnicas seguintes podem ser utilizados para a transferência: 1) Coloque a pipeta multicanal para 40 uL e inserir as pontas para a secção direita do cartucho (marcado 'Gotas') a um ângulo de 45 °; 2) Pipetar as gotas lentamente e garantir que todas as gotículas são pipetados para cima (tomar nota, se as gotas são deixados para trás e precisam ser pipetados-se para uma segunda rodada); 3) Uma vez que as gotículas são removidos, transferi-los para a placa final pelo colocando a ponta da pipeta contra a parede do poço, aproximadamente, a meio caminho para baixo e expelir as gotículas lentamente.
O ensaio EntHF183 duplex dPCR tem grandes vantagens sobre os ensaios de qPCR individuais existentes para os mesmos analitos. Em primeiro lugar, o ensaio dPCR duplex não precisa de curvas padrão para quantificar incógnitas, eliminando preconceitos quantificação qPCR associados à variabilidade nos padrões 7. Em segundo lugar, o ensaio dPCR duplex pode tolerar inibemou concentrações que são uma a duas ordens de grandeza maior do que a tolerada pelos ensaios qPCR 7 correspondentes. Esta característica faz com que o ensaio dPCR duplex muito atraente para a análise de amostras ambientais (por exemplo, amostras de águas pluviais) que muitas vezes contêm substâncias inibidoras de PCR. Em terceiro lugar, a capacidade de quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E o marcador HF183 em um ensaio dPCR duplex (comparada com a quantificar os separadamente em dois ensaios qPCR) é mais rentável 7 e melhora a quantidade de dados, evitando a variabilidade associada com pipetagem acumulativo realização de dois ensaios separados (vs. um duplex ensaio dPCR). Em quarto lugar, o ensaio dPCR duplex também demonstraram uma maior precisão e repetibilidade em comparação com os ensaios de qPCR correspondentes, fazendo com que o primeiro uma boa alternativa em estudos comparativos 7.
No entanto, existem limitações para este método (vantagens e limitações descritos em detalheoutras posições 7). Em primeiro lugar, o número de gotículas aceites por reacção determina o limite de quantificação superior (UQL) de dPCR. O instrumento dPCR usado neste trabalho (consulte a lista de materiais / equipamentos) foi relatado para ter um UQL de 10 5 cópias por reacção. Isto corresponde a 5 x 10 5 células de Enterococcus e 2 x 10 6 HF183 cópias por 100 ml de água, assumindo a anteriormente 7 descritos protocolo de extracção de DNA é seguido e 100 ADN ul é obtida (isto é, por o passo de eluição durante a extracção de ADN) a partir de 100 ml de água sem qualquer perda durante o processamento da amostra antes da dPCR 7. Águas ambientais geralmente não ultrapassam essas concentrações de Enterococcus e HF183. No entanto, a diluição da amostra deve ser considerada para amostras de concentração elevada, como fezes de animais, esgoto e amostras de água coletadas imediatamente após um vazamento de esgoto. Em segundo lugar, as altas concentrações de ADN total (includitanto ng de ADN alvo e não-alvo) pode interferir com o processo de particionamento gota. Não é aconselhável usar mais do que 66 ng DNA total sem pré-tratamento por enzimas de restrição 7. Em terceiro lugar, embora o ensaio EntHF183 duplex dPCR é significativamente mais robusta contra a inibição de qPCR, este ensaio pode ainda produzir resultados falsos negativos se a inibição grave impede que a amplificação por PCR ocorra. medidas de controle de inibição, portanto, ainda devem ser implementadas. Métodos de adição ou de diluições do padrão, tal como descrito anteriormente podem ser utilizados para avaliar a inibição 7. Última, o ensaio duplex só foi validado em uma plataforma dPCR e validação do método deve ser realizada em outras plataformas digitais de PCR antes do uso.
Este é o primeiro ensaio digitais duplex publicada PCR que quantifica simultaneamente um indicador de qualidade da água amplamente aceito e um marcador associado-host popular para a contaminação fecal 7. As vantagens demonstradasdo EntHF183 duplex dPCR ensaio promessa outras aplicações úteis da tecnologia PCR digitais em rastreamento de origem microbiana, a detecção de patógenos e genes de resistência a antibióticos. Por exemplo, um indicador geral de fezes (Enterococcus spp., E. coli, Bacteroidales geral) e um marcador fecal associada-hospedeiro (HF183, HumM2, CowM2, LeeSeagull) 2 pode ser emparelhado semelhante (como no ensaio EntHF183 duplex dPCR) em um ensaio dPCR duplex por mais rentável e quantificação precisa de contaminação fecal geral e associada ao host. Microbianas marcadores de rastreamento de fonte de segmentação da mesma fonte (ou fontes diferentes) também pode ser emparelhado no ensaio dPCR duplex para aumentar a confiança na detecção da origem fecal (ou obter informações sobre várias fontes fecais simultaneamente). O maior tolerância contra inibidores da PCR também pode permitir a análise do volume de amostra mais alta para aumentar a probabilidade de detecção de patógenos que têm doses infectantes baixos, mas só estão presentes em environmental água em concentrações baixas. vantagens metodológicas semelhantes de PCR digital sobre qPCR poderia também se aplicam para o desenvolvimento de ensaios de PCR digitais para quantificação de genes de resistência a antibióticos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20 μl pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200 μl pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E. faecalis genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalis and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
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