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Bioengineering

पर पल्स लेजर उत्तेजना सोने nanoparticle एकीकृत फोटो उत्तरदायी Liposomes और उनके microbubble Cavitation के मापन के संश्लेषण

Published: February 24, 2016 doi: 10.3791/53619
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

Summary

इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री के साथ एकीकृत तस्वीर उत्तरदायी liposomes सोने nanoparticle के लिए एक सरल तैयारी विधि का वर्णन है। यह भी पता चलता है स्पंदित लेजर के उपचार पर संश्लेषित liposomes की microbubble cavitation प्रक्रिया को मापने के लिए कैसे।

Introduction

संभावना अधिकतम विशिष्टता और कम से कम प्रतिकूल प्रभाव के साथ, spatial- temporal- और खुराक नियंत्रित फैशन में दवाओं देने के लिए बाहरी उत्तेजनाओं एक आकर्षक तरीके इस्तेमाल कर रहा है दवा रिहाई को ट्रिगर करने के लिए। बहिर्जात उत्तेजनाओं उत्तरदायी सिस्टम (प्रकाश, चुंबकीय क्षेत्र, अल्ट्रासाउंड, माइक्रोवेव विकिरण) की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच, प्रकाश ट्रिगर प्लेटफार्मों आकर्षक हैं, उनके गैर invasiveness, सादगी और क्लीनिकों में अनुकूलन क्षमता के कारण। पिछले एक दशक में 1 व्यापक अनुसंधान इस तरह के लगभग अवरक्त प्रकाश जिम्मेदार सोने के रूप में मंच प्रौद्योगिकियों की एक किस्म प्रदान की गई है (एयू) nanocages स्मार्ट पॉलिमर के साथ लेपित, 2 तस्वीर-अस्थिर, बहुलक नैनोकणों (एनपीएस) दवाओं, 3 और आत्म इकट्ठे porphysome nanovesicles के साथ संयुग्मित। हालांकि 4 इन प्रौद्योगिकियों के विकास के preclinical चरणों में अब भी कर रहे हैं, और शुरू करने तथा शेष भाग की प्रक्रिया में शामिल मानकों का एक स्पष्ट समझ और अनुकूलन की आवश्यकतादवा रिहाई रोलिंग।

एक ऐसी प्रणाली तैयार करने के लिए सरल और आसानी से सुलभ तरीकों में से एक thermally संवेदनशील liposomes 5,6, जो दोनों के बाजार में व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और बड़े पैमाने पर preclinical और यहां तक कि क्लिनिकल परीक्षण में जांच की गई है साथ Au एनपीएस को एकीकृत करने के लिए है। उनकी plasmonic तरंग दैर्ध्य में Au एनपीएस के गहरे ऊतक सक्रियण की सीमा है, जब लगभग अवरक्त सक्रिय Au nanostructures (जैसे, nanocages) की तुलना के बावजूद, इस प्रणाली अभी भी महान वादा रखती है जब छोटे जानवरों में या मानव में सामयिक प्रसव के लिए इस्तेमाल किया। 7 प्रकाश ट्रिगर रिहाई के लिए liposomes साथ Au एनपीएस के संयोजन में कुछ शुरुआती प्रयासों जबकि उनमें से ज्यादातर माल की नवीनता पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। 8-11, पहुंच और scalability मुद्दों को संबोधित करने की जरूरत है। इसके अलावा, इन nanocarriers का उपयोग कर रिहाई तंत्र पर रिपोर्ट अभी भी सीमित हैं।

इस के साथ साथ, के निर्माण के फोटो जिम्मेदारliposomes, इसके साथ ही दवाओं और हाइड्रोफिलिक Au एनपीएस के साथ भरी हुई वर्णित किया गया है। Calcein encapsulation दक्षता और प्रणाली की रिहाई प्रोफ़ाइल मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में यौगिक प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, इस प्रणाली में, Au एनपीएस द्वारा अवशोषित प्रकाश गर्मी के रूप में आसपास के microenvironment को dissipates, स्थानीय तापमान में वृद्धि हो जाती है। एयर सूक्ष्मबुद्बुद लेजर हीटिंग के दौरान उत्पन्न होता है और लिपिड (चित्रा 1) के यांत्रिक व्यवधान पैदा कर रहे हैं। microbubble cavitation की व्यवस्था हाइड्रोफ़ोन माप की पुष्टि की है।

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Protocol

1. तैयारी

  1. स्वच्छ 100 मिलीलीटर दौर नीचे बोतल एक्वा regia (केंद्रित नाइट्रिक एसिड के भाग 1 (HNO 3) और केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के 3 भागों) और डि पानी के साथ बोतल धोने का उपयोग कर। बोतल आटोक्लेव और 15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म हवा ओवन में उन्हें सूखी। लपेटें और उपयोग करें जब तक बाँझ बोतल की दुकान।
  2. हाथ से आयोजित मिनी बाहर निकालना 70% इथेनॉल का उपयोग कर सेट जीवाणुरहित।
  3. रोटरी बाष्पीकरण पर मुड़ें और क्रमश: 37 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी से स्नान और कूलिंग टॉवर का तापमान निर्धारित किया है।
  4. 0.1 मिमी की 10 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) (7.4 पीएच) में calcein की 374 मिलीग्राम भंग द्वारा 60 शेयर समाधान calcein मिमी तैयार करें। 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) समाधान का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें।

2. Liposomes के संश्लेषण

  1. (1,2-Dipalmitoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine लिपिड निकालें (DPPC), 1-palmitoyl-2-हाइड्रो- एस.एन. -glycero-3-phosphochoलाइन (MPPC) और 1, 2-distearoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanol-amine- एन - [carboxy (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -2000] (अमोनियम नमक) (डीएसपीई-PEG2000)) फ्रीजर से (-20 डिग्री सेल्सियस) और आरटी के लिए उन्हें पिघलना।
  2. 15.9 मिलीग्राम DPPC, 1.3 मिलीग्राम MPPC, और 2.8 मिलीग्राम डीएसपीई-PEG2000 वजन। 2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में उन्हें एक साथ भंग।
  3. बाँझ दौर नीचे फ्लास्क क्लोरोफॉर्म समाधान स्थानांतरण और कम दबाव के तहत रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर, एक पतली, सूखी लिपिड परत के रूप में विलायक लुप्त हो जाना।
  4. 1.95 मिलीग्राम 60 मिमी 1.4 चरण और 50 μl Au एनपीएस (3.36 × 10 16 कणों / एमएल) में तैयार calcein युक्त 30 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर जलीय समाधान के साथ 45 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड परत हाइड्रेट।
  5. 45 डिग्री सेल्सियस के लिए हीटिंग ब्लॉक पूर्व गर्मी। फिल्टर का समर्थन करता है जो 200 एनएम पॉली कार्बोनेट झिल्ली फिल्टर की जगह और मिनी बाहर निकालना सेट इकट्ठा। डि पानी के साथ संभावित रिसाव की जाँच करें।
  6. 2.4 कदम और extru से liposome समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ सीरिंज से एक भरेंडी इकट्ठा मिनी बाहर निकालना के दूसरे छोर पर सिरिंज का हल गुजर द्वारा नमूना। 11 बार दोहराएँ।
  7. एक पीडी -10 desalting स्तंभ के माध्यम से संश्लेषित liposomes भागो मुक्त Au एनपीएस, लिपिड और calcein पीबीएस निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार eluent के रूप में प्रयोग हटा दें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ ट्यूबों में नमूनों की दुकान और 2 दिनों में उपयोग करें।

हीटिंग के साथ Liposomes से 3. Calcein रिलीज

  1. 2.2 चरण में DPPC, MPPC, और डीएसपीई-PEG2000 के molarities को जोड़कर शेयर समाधान के लिपिड molarity गणना। 5 मिमी लिपिड 0.1 मिमी पीबीएस बफर (7.4 पीएच) का उपयोग करने के लिए एकाग्रता liposome शेयर समाधान पतला। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब (2 मिलीलीटर) के लिए नमूने स्थानांतरण।
  2. एक गर्म पानी से स्नान में ट्यूब रखें, और 25 से 70 डिग्री सेल्सियस के लिए धीरे-धीरे तापमान बढ़ा। 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की दर से यहां तापमान में वृद्धि।
  3. अलग तापमान अंक (27, 32, 37, 39, 41 पर aliquots (10 μl) लीजिए,43, 45, 52, 57, 62, 67 और 70 डिग्री सेल्सियस)।
  4. आरटी पर 10 मिनट के लिए liposomes को पचाने के लिए और calcein की पूरी रिहाई प्राप्त करने के लिए लिपोसोमल समाधान के 2% ट्राइटन X-100 के लिए 2 मिलीलीटर विभाज्य के 10 μl जोड़ें।
  5. 96 अच्छी तरह से microplate में एक अच्छी तरह से लिपोसोमल समाधान के 200 μl स्थानांतरण और एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग कर एकत्र नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने। calcein की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 480 और 515 एनएम क्रमशः रहे हैं।
  6. 100% रिलीज के रूप में ट्राइटन X-100 इलाज के नमूने के प्रतिदीप्ति तीव्रता लेते हुए, हर समय बिंदु पर जारी किया calcein के प्रतिशत की गणना सूत्र का उपयोग:
    फॉर्मूला 1
    Ft एक निश्चित समय बिंदु पर समाधान के प्रतिदीप्ति तीव्रता है। च मैं और एफ एक्स क्रमशः समाधान की सामान्यीकृत प्रारंभिक और अंतिम प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं।

4. Calcein पुनस्पंदित लेजर के साथ liposomes से पट्टे

  1. एक क्वार्ट्ज क्युवेट के लिए 100 μl liposome समाधान स्थानांतरण और एक क्युवेट धारक में जगह है। प्रकाश स्रोत के रूप में 532 एनएम तरंगदैर्ध्य पर 6 NSEC की एक नाड़ी की अवधि के साथ YAG लेजर: एक स्पंदित एन डी का प्रयोग करें। ; 1 हर्ट्ज: दोहराव दर - लेजर पैरामीटर निम्नलिखित का प्रयोग करें लेजर ऊर्जा घनत्व: 1 MJ / 2 सेमी; किरण व्यास: 0.5 मिमी।
  2. क्युवेट के माध्यम से collimated लेजर बीम गाइड ऐसी है कि प्रकाश liposome समाधान के माध्यम से गुजरता है और विभिन्न दालों के बाद aliquots इकट्ठा।
  3. आरटी पर 10 मिनट के लिए liposomes को पचाने के लिए और calcein की पूरी रिहाई प्राप्त करने के लिए लिपोसोमल समाधान के 2% ट्राइटन X-100 के लिए 2 मिलीलीटर विभाज्य के 10 μl जोड़ें।
  4. calcein ध्यान में रखते हुए प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और लेजर प्रयोग के दौरान प्रक्षालित किया जा सकता है, पूर्व मापने calcein समाधान पर स्पंदित लेजर के विरंजन प्रभाव liposome रिलीज से डेटा को सामान्य करने के लिए।
    1. विशेष रूप से, calcein समाधान (60 मिमी) स्पंदित लेजर वाई को बेनकाबपल्स संख्या (0, 25, 50 और 100) में परिवर्तन के लिए 1 हर्ट्ज की आवृत्ति वें। क्रमश: 480 और 515 एनएम का उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ calcein, पहले और लेजर प्रदर्शन के बाद की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने।
    2. विरंजन की राशि (पहले विशेष पल्स संख्या के बाद calcein की लेजर जोखिम / प्रतिदीप्ति तीव्रता calcein के प्रतिदीप्ति तीव्रता) की गणना। कारक के साथ liposomes की प्रतिदीप्ति तीव्रता गुणा करके मूल्यों liposome नमूनों से प्राप्त सामान्य करने के लिए इस पहलू का प्रयोग करें।
  5. एकत्र नमूना क्रमश: 480 और 515 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग करने का प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने।
  6. 100% रिलीज के रूप में ट्राइटन X-100 इलाज के नमूने के प्रतिदीप्ति तीव्रता ले रहा है, प्रत्येक नाड़ी नंबर पर रिहा कर calcein के प्रतिशत की गणना सूत्र का उपयोग:
    फॉर्मूला 1
    मैं और एफ एक्स क्रमशः समाधान की सामान्यीकृत प्रारंभिक और अंतिम प्रतिदीप्ति तीव्रता हैं।

दबाव आवेगों का मापन 5.

  1. एक सूक्ष्म स्लाइड पर नमूने के 100 μl की जगह और नमूना पर लेजर का ध्यान केंद्रित निर्धारित किया है।
  2. एक सुई हाइड्रोफ़ोन (1 मिमी व्यास और 450 NV / Pa संवेदनशीलता) समाधान में विसर्जित कर दिया।
    सावधानी: हाइड्रोफ़ोन लेजर प्रकाश से प्रकाशित नहीं किया जाना चाहिए नुकसान से बचने के लिए।
  3. बदलती पल्स संख्या (0-100) और पल्स ऊर्जा (20-160 μJ / नाड़ी) के साथ स्पंदित लेजर के साथ नमूना चमकाना।
  4. रिकॉर्ड एक डिजिटल आस्टसीलस्कप का उपयोग दबाव का संकेत है।

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Representative Results

10: 4 या 7.95: Liposomes 86 की एक दाढ़ अनुपात में DPPC, MPPC और डीएसपीई-PEG2000 के साथ एक पारंपरिक पतली फिल्म हाइड्रेशन तकनीक का उपयोग कर तैयार किए गए 0.65:। 1.39 मिलीग्राम / एमएल 12 Au एनपीएस के आकार प्रकाश निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है निम्नलिखित लेजर उत्तेजना प्रयोग के दौरान रूपांतरण दक्षता गर्मी। छोटे Au एनपीएस के आकार, उच्च दक्षता transducing। 13 इस प्रकार 5 एनएम Au एनपीएस, विक्रेता से छोटी से छोटी नमूने, encapsulation के लिए चुना गया है। संश्लेषण के दौरान, hydrating और मध्यम Au एनपीएस युक्त calcein बहु-परतदार पुटिकाओं, जो तब आकार बाहर निकालना और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के अधीन मुक्त Au एनपीएस और calcein दूर करने के लिए थे उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया है।

Calcein एक हाइड्रोफिलिक फ्लोरोसेंट रंजक 60 मिमी की एकाग्रता में liposomes की जलीय कोर के भीतर समझाया जाता है। इस तरह के उच्च सांद्रता में, सी के प्रतिदीप्तिalcein आत्म quenches। हालांकि, calcein के रूप में यह liposomes से जारी है, फिर से लाभ प्रतिदीप्ति के लिए अग्रणी पतला है, ट्रिगर दवा रिहाई का संकेत है। 14 calcein liposomes की इस संपत्ति पर निर्भर 5 मिमी पतला थे और तापमान परिवर्तन के लिए लिपोसोमल प्रणाली की प्रतिक्रिया थी मनाया। जैसा कि चित्र 2A में संकेत दिया है, Au एनपीएस की उपस्थिति के बावजूद, liposomes कम से कम 10% की एक रिसाव प्रतिशत के साथ शारीरिक तापमान (यानी, 37 डिग्री सेल्सियस) पर लगभग बरकरार थे। हालांकि, जब तापमान 42 डिग्री सेल्सियस (थोड़ा लिपिड के संक्रमण तापमान ऊपर), 60% करने के लिए उठाया गया था समझाया calcein के -80% 2 मिनट के भीतर liposomes से जारी है। रिहाई के प्रतिशत में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ और Au एनपीएस के बिना liposomes, जब रिलीज गर्मी का उपयोग शुरू हो रहा है भीतर मनाया जाता है। इस प्रणाली के चरण संक्रमण तापमान के कारण है। इसके अलावा, त्वरित और कुशल रिहाई prese की वजह से है10% की nce MPPC है, जो संक्रमण के तापमान पर liposome bilayer की पारगम्यता बढ़ाता है।

अगले, लेजर विकिरण पर liposomes से calcein रिलीज जांच की गई थी। लिपोसोमल समाधान के लिए एक क्वार्ट्ज क्युवेट जो एक क्युवेट धारक में रखा गया था में लिया गया था। 532 एनएम एन डी: 6 NSEC की एक नाड़ी की अवधि और १६६.६७ किलोवाट / 2 सेमी की एक तात्कालिक ऊर्जा घनत्व के साथ YAG लेजर पल्स लिपोसोमल समाधान पर ध्यान केंद्रित किया गया। नमूनों की aliquots बदलती पल्स संख्या (0, 25, 50, और 100), जिसमें पल्स आवृत्ति 1 हर्ट्ज पर तय की गई थी पर एकत्र किए गए थे। नमूने तुरंत एक microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरित और एक बर्फ स्नान में रखा गया था। इस calcein के किसी भी आगे रिलीज को रोकने के लिए है। लेजर बंद कर दिया गया था नमूने एकत्रित करते। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 2 बी, Au एनपीएस के साथ liposomes उत्तेजना पर समझाया calcein, जिसमें पल्स NUM के रूप में वृद्धि जारी किया calcein की राशि जारी कीसदस्यों की वृद्धि हुई।

अंतिम चरण हाइड्रोफ़ोन साथ liposomes से calcein रिहाई की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए किया गया था। चित्रा 3A ध्वनिक Au एनपीएस (लाल), Au एनपीएस (काला) और Au एनपीएस (नीला) के बिना liposomes साथ liposomes के लिए दर्ज संकेत है। Au एनपीएस और Au एनपीएस के साथ liposomes से पता चला है जबकि विशेषता दबाव लहर का संकेत है, कोई संकेत Au एनपीएस के बिना liposomes से मनाया गया। दबाव आवेग सकारात्मक और नकारात्मक दोनों चरणों (चित्रा 3 ए में इनसेट) शामिल हैं। यह पता चलता है कि सूक्ष्मबुद्बुद (सकारात्मक चरण) के रूप में और (नकारात्मक चरण) को बाधित समाधान में। अधिकतम और Au एनपी युक्त liposomes में दर्ज की चोटी की न्यूनतम मूल्यों .00093 और -०.०००७४ वी क्रमशः थे। अंत में, औसत Maxima और बढ़ती लेजर ऊर्जा के एक समारोह के रूप में दबाव आवेगों का न्यूनतम गणना की गई। जैसी कि उम्मीद थी, ध्वनिकी संकेत आयाम धीरे-धीरे बढ़ रही है लेजर के साथ वृद्धि हुईऊर्जा (चित्रा 3 बी)। यह कणों बाद थर्मामीटरों लोचदार विस्तार और संकुचन के हवाले से दोलन की वृद्धि की तीव्रता के कारण होना चाहिए। 15,16

आकृति 1
चित्रा 1. फोटो उत्तरदायी liposomes की प्रस्तावित दवा रिलीज तंत्र:। Au एनपीएस (लाल डॉट्स) जब किरणित जा रहा है, सूक्ष्मबुद्बुद कि liposome झिल्ली को बाधित और इस प्रकार ट्रिगर calcein रिहाई Calcein, आत्म-शमन liposomes के भीतर (दिखाया गया है), fluoresces उत्पन्न के रूप में आसपास के लिए जारी किया जा रहा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 <strong> गर्मी और स्पंदित लेजर liposomes से calcein की रिहाई शुरू हो (ए) के साथ या Au एनपीएस, जो 2 मिनट के लिए विभिन्न तापमान के साथ नहाने के पानी में रखा गया था बिना liposomes से रिहा calcein का प्रतिशत। (बी) Au एनपीएस, जो स्पंदित लेजर के साथ इलाज किया गया साथ liposomes से रिहा calcein का प्रतिशत (पल्स अवधि = 6 NSEC, शक्ति घनत्व ~ 12 मेगावाट / 2 सेमी)। त्रुटि सलाखों तीन स्वतंत्र तीन प्रतियों में प्रदर्शन प्रयोगों के मानक विचलन (एसडी) ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. (क) ध्वनिक संकेतों Au एनपीएस (लाल), एक बिना Au एनपीएस (काला) और liposomes साथ liposomes के लिए एक प्रणाली का उपयोग मापा हाइड्रोफ़ोनयू एनपीएस (नीला)। Au एनपीएस और Au एनपीएस के साथ liposomes से पता चला है जबकि विशेषता दबाव लहर का संकेत है, कोई संकेत Au एनपीएस के बिना liposomes से मनाया गया। इनसेट तस्वीर उत्तरदायी liposomes की ध्वनिक संकेतों के एक बढ़े हुए दृश्य दिखाता है। (बी) के अधिकतम और लेजर शक्ति को बढ़ाने के एक समारोह के रूप में दबाव आवेगों की न्यूनतम शिखर मूल्य। ध्वनिकी संकेत आयाम धीरे-धीरे बढ़ रही है लेजर ऊर्जा के साथ बढ़ जाती है। त्रुटि सलाखों ± तीन स्वतंत्र दस रन में प्रदर्शन प्रयोगों के एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पतली फिल्म हाइड्रेशन liposomes की तैयारी के लिए पारंपरिक विधि है। कार्बनिक सॉल्वैंट्स (इस मामले में क्लोरोफॉर्म) पहली कुप्पी पर एक लिपिड पतली फिल्म उत्पन्न करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लिपिड भंग करने के लिए इस्तेमाल किया गया और फिर एक रोटरी बाष्पीकरण में हटा दिया। इस लिपिड फिल्म 60 मिमी calcein और 5 एनएम Au एनपीएस युक्त जलीय समाधान के साथ हाइड्रेटेड किया गया था। हाइड्रेशन प्रक्रिया के दौरान, तापमान लगभग 50 डिग्री सेल्सियस बनाए रखा गया था और कुप्पी लगातार कुप्पी घूर्णन द्वारा उत्तेजित था। इस चरण में कुंजी तापमान जिस पर वाष्पीकरण और हाइड्रेशन क्रमशः बाहर किए गए की पसंद है। DPPC, liposome के प्रमुख घटक, के चरण संक्रमण तापमान (टी एम) 41 डिग्री सेल्सियस है। लिपिड के गठन के दौरान लगता है कि फिल्म, तापमान सूखे लिपिड के एकत्रित झुरमुटों के गठन को रोकने के लिए 41 डिग्री सेल्सियस से नीचे होना चाहिए। हाइड्रेशन के दौरान, टी एम तुलना में एक उच्च तापमान को फॉस्फोलिपिड ड्राइव करने के लिए चुना गया थागोलाकार multilamellar संरचनाओं में स्वयं को इकट्ठा। हालांकि पतली फिल्म हाइड्रेशन विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है, यह calcein और Au एनपीएस जलीय घोल में encapsulation के गरीब दक्षता (<1%) द्वारा सीमित है। भविष्य में, encapsulation फ्रीज पिघलना चक्र के माध्यम से सुधार किया जा सकता है।

इसके बाद आकार बाहर निकालना एक हाथ पकड़ा मिनी बाहर निकालना मशीन, एक हीटिंग ब्लॉक पर रखा उपयोग किया गया था। 1 मिलीलीटर समाधान की एक अधिकतम इस सेट अप है, जो प्रयोगशाला में एक छोटे पैमाने पर तैयारी के लिए आदर्श है का उपयोग कर निकाला जा सकता है। इस चरण में कुंजी अभी भी तापमान, जो liposomes की चरण संक्रमण तापमान ऊपर होना चाहिए। 50 डिग्री सेल्सियस पर बाहर निकालना सौंपने करके, liposomes का आकार 200 एनएम pores के साथ झिल्ली के माध्यम से बाहर निकालना के 10 चक्र के बाद वर्दी बन गया। इस चरण में गति धीमी और कोमल होना चाहिए के रूप में बाहर निकालना के भीतर दबाव बड़ा है, जबकि झिल्ली नाजुक है।

एक बार अनदेखी लेकिन महत्वपूर्ण काएंदवा युक्त liposomes के संश्लेषण के दौरान पी शुद्धि या संयुक्त राष्ट्र समझाया दवाओं (यानी, calcein और Au एनपीएस यहाँ) को हटाने की है। इस जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा किया गया था। यह महत्वपूर्ण शोधकर्ता नोटिस करने के लिए है कि पीडी -10 इस अध्ययन में इस्तेमाल स्तंभ प्रसंस्करण <2 मिलीलीटर समाधान के लिए ही उपयुक्त है। बड़ी मात्रा के साथ नमूने कई कॉलम का उपयोग करके कार्रवाई की जा सकती है।

के रूप में पतला liposome से calcein रिहाई के अध्ययन के उच्च सांद्रता में calcein और फिर से प्रतिदीप्ति के आत्म-शमन पर निर्भर करता है। नमूने क्रमशः थर्मल या लेजर उपचार के लिए गर्मी या प्रकाश के संपर्क में थे, नमूनों की aliquots लगातार बदलती तापमान अंक या नाड़ी संख्या को वापस ले लिया और अलग शीशियों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया। शीशियों तुरंत सटीक मापन के लिए, calcein के संभावित आगे रिलीज को रोकने के लिए एक बर्फ स्नान में रखा जाना चाहिए। नोटिस के लिए एक और बात यह है कि calcein प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैऔर इसलिए लेजर प्रयोग के दौरान प्रक्षालित किया जा सकता है। इस पर काबू पाने के लिए, calcein समाधान पर एक स्पंदित लेजर के विरंजन प्रभाव को मापा जाना चाहिए और liposome रिलीज से डेटा तदनुसार सामान्यीकृत।

प्रोटोकॉल के साथ साथ प्रकाश के प्रति संवेदनशील liposomes के लिए एक सतही तैयारी विधि का वर्णन है। थर्मल रिहाई पहला तापमान फॉस्फोलिपिड के उत्तरदायी शोषण से प्रदर्शन किया है। लेजर की स्थापना की सचित्र है और प्रकाश रिहाई शुरू हो रहा स्पंदित लेजर द्वारा हासिल की है। प्रकाश की व्यवस्था शुरू हो रहा रिलीज भी पता लगाया है और microbubble cavitation द्वारा व्यवधान झिल्ली की वजह से हो पाया है।

सभी रिपोर्ट प्रोटोकॉल से अलग है, इस प्रोटोकॉल सामग्री (यानी, लिपिड और Au एनपीएस) की है कि अक्सर नैदानिक ​​परीक्षणों में प्रयोग किया जाता है और बाजार में व्यापक रूप से उपलब्ध किया गया चुनता है। आसानी से सुलभ सामग्री का उपयोग, किसी को भी खुद के द्वारा इस तरह के प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रणाली तैयार करने के लिए अनुमति देता है ne बिनाएड तकनीकी मदद लेने के लिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल liposomes तैयार करने के लिए पतली फिल्म हाइड्रेशन का उपयोग करता है, जो दोनों लागत प्रभावी और आसानी से स्केलेबल है।

इस सरल लेकिन शक्तिशाली प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं और चिकित्सकों जो त्वचा की तरह सतही ऊतकों को नियंत्रित दवा वितरण को प्राप्त करने में रुचि रखते हैं, लाभ होगा। एक संभावित आवेदन सनस्क्रीन के भीतर इस प्रणाली को शामिल करके विरोधी धूप की कालिमा एजेंटों को वितरित करने के लिए किया जाएगा।

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा कर रहे हैं।

Acknowledgments

इस काम आंशिक शिक्षा के सिंगापुर मंत्रालय (CX के लिए आरजी 64/12) और Nanomedicine के एनटीयू-नॉर्थवेस्टर्न संस्थान द्वारा टीयर -1 शैक्षिक अनुसंधान धन के द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 850355P Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 855675P Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 880120P Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles Sigma Aldrich 752568-100mL 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein Sigma Aldrich C0875-10g 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493 0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100   Sigma, Life Sciences X-100 To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor   Buchi (Switzerland) R 210 Used for Lipososme preparation
Heating bath Buchi (Switzerland) B 491 Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller   Buchi (Switzerland) V-850 Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump Buchi (Switzerland) V-700 Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller Polyscience Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block  Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610000 Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610017 Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm Whatmann 800281 Used for extrusion of liposomes
Filter Support Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610014 Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium GE Healthcare, Life sciences 17-0851-01 Used to purify the liposomes
Centrifuge   Sigma Laboratory Centrifuges 3K30 Used to concentrate the liposomal solution 
Rotor Sigma 19777-H Used to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer   Nano ZS Malvern Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-2450 Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer   Molecular Devices SpectraMax M5 Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser NewWave Research 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone ONDA HNR-1000 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope LECORY - Wave Runner 64Xi-A Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

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References

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796 (2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104 (2010).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 108 exogenous उत्तेजनाओं उत्तरदायी नैनोकणों प्रकाश उत्तरदायी liposomes सोने के नैनोकणों दवा वितरण नियंत्रित रिलीज microbubble cavitation
पर पल्स लेजर उत्तेजना सोने nanoparticle एकीकृत फोटो उत्तरदायी Liposomes और उनके microbubble Cavitation के मापन के संश्लेषण
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Mathiyazhakan, M., Chan, W., Ohl, C. … More

Mathiyazhakan, M., Chan, W., Ohl, C. D., Xu, C. Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation. J. Vis. Exp. (108), e53619, doi:10.3791/53619 (2016).

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