Summary
Questo protocollo descrive un metodo di preparazione semplice per nanoparticelle di oro integrato liposomi foto-reattivo con i materiali disponibili commercialmente. Viene inoltre illustrato come misurare il processo di cavitazione di microbolle dei liposomi sintetizzati sul trattamento di laser pulsato.
Introduction
La possibilità di innescare il rilascio del farmaco utilizzando stimoli esterni è un modo interessante per consegnare la droga a mode spazio-, temporo e dosaggio controllato con specificità massimizzata e minimi effetti avversi. Tra una vasta gamma di sistemi esogeni stimoli-reattiva (luce, campo magnetico, ultrasuoni, radiazioni a microonde), piattaforme di luce-triggered sono attraenti, a causa della loro non invasività, semplicità e adattabilità negli ambulatori. 1 Ricerche approfondite negli ultimi dieci anni ha fornito una varietà di tecnologie di piattaforma, come l'oro responsabile nel vicino infrarosso-luce (Au) nanocages rivestiti con polimeri intelligenti, 2 foto-labile, nanoparticelle polimeriche (NP) coniugati con farmaci, 3 e nanovesicles porphysome auto-assemblati. 4 Tuttavia , queste tecnologie sono ancora in fase di sviluppo preclinico, e richiedono una comprensione chiara e ottimizzazione dei parametri legati al processo di avvio e controtolare il rilascio del farmaco.
Uno dei metodi più semplici e facilmente accessibili per la preparazione di un tale sistema è quello di integrare le Au NP con liposomi termicamente sensibili 5,6, entrambi i quali sono ampiamente disponibili sul mercato e sono stati ampiamente studiati in studi preclinici e clinici, anche. Nonostante la limitazione dell'attivazione del tessuto profondo di Au NP alla loro lunghezza d'onda plasmonica, se confrontato con nanostrutture vicino infrarosso attivato Au (ad esempio, nanocages), questo sistema mantiene ancora una grande promessa se usato nei piccoli animali o per la consegna di attualità negli esseri umani. 7 ci sono alcuni primi sforzi in combinando Au NP con liposomi per il rilascio di luce-attivato. 8-11 Mentre la maggior parte di essi riguardano sulla novità dei materiali, problemi di accessibilità e scalabilità devono essere affrontati. Inoltre, i rapporti sui meccanismi di rilascio che utilizzano questi nanovettori sono ancora limitate.
Qui, la fabbricazione di foto-sensibileliposomi, allo stesso tempo carichi di farmaci e idrofili Au NP è stata descritta. Calceina viene utilizzato come composto modello per valutare l'efficienza di incapsulamento e il profilo di rilascio del sistema. Inoltre, in questo sistema, luce assorbita da Au NP dissipa il microambiente circostante sotto forma di calore, con conseguente aumento della temperatura locale. Microbolle d'aria vengono generati durante il riscaldamento laser e causano distruzione meccanica dei liposomi (Figura 1). Il meccanismo della cavitazione microbolle è confermato da misurazioni idrofoni.
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Protocol
1. Preparazione
- Clean 100 ml rotonde palloni a fondo con acqua regia (1 parte di acido nitrico concentrato (HNO 3) e 3 parti di acido cloridrico concentrato (HCl)) e lavare i flaconi con acqua deionizzata. Autoclavare beute e asciugare in un forno ad aria calda a 100 ° C per 15 min. Avvolgere e conservare i flaconi sterili fino al momento dell'uso.
- Sterilizzare il set di mini-estrusore portatile utilizzando il 70% di etanolo.
- Accendere l'evaporatore rotante e impostare la temperatura del bagno di acqua calda e la torre di raffreddamento a 37 ° C e 4 ° C rispettivamente.
- Preparare 60 mM calceina soluzione madre sciogliendo 374 mg di calceina in 10 ml di 0,1 mM tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Regolare il pH a 7,4 con 1 M di idrossido di sodio (NaOH).
2. Sintesi di liposomi
- Rimuovere i lipidi (1,2-Dipalmitoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoil-2-idrossi-SN -glycero-3-phosphochoLinea (MPPC) e 1, 2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanol-quali ammine N - [carbossi (polietilene glicole) -2000] (sale di ammonio) (DSPE-PEG2000)) dal congelatore (-20 ° C) e li scongelare a temperatura ambiente.
- Pesare 15,9 mg DPPC, 1,3 mg MPPC, e 2,8 mg di DSPE-PEG2000. li Sciogliere insieme in 2 ml di cloroformio.
- Trasferire la soluzione cloroformica al pallone a fondo rotondo sterile ed evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a pressione ridotta, per formare un sottile strato lipidico secca,.
- Idratare lo strato lipidico a 45 ° C con 2 ml di soluzione acquosa per 30 minuti contenente 1,95 ml 60 mM calceina preparato al punto 1.4 e 50 microlitri Au NPs (3,36 × 10 16 particelle / ml).
- Preriscaldare il blocco di riscaldamento a 45 ° C. Mettere un filtro a membrana di policarbonato 200 nm tra i supporti del filtro e montare il set di mini-estrusore. Controllare la potenziale fuoriuscita con acqua deionizzata.
- Riempire una delle siringhe con 1 ml di soluzione di liposomi dal punto 2.4 e Extrude l'esempio facendo passare la soluzione alla siringa all'altra estremità del assemblare mini-estrusore. Ripetere 11 volte.
- Eseguire i liposomi sintetizzati attraverso una colonna di dissalazione PD-10 per rimuovere le libere Au NP, lipidi e calceina con PBS come eluente secondo il protocollo del produttore.
- Conservare i campioni in provette sterili a 4 ° C e utilizzare in 2 giorni.
3. Calceina uscita da liposomi con riscaldamento
- Calcolare la molarità lipidico della soluzione di riserva sommando le molarità di DPPC, MPPC, e DSPE-PEG2000 al punto 2.2. Diluire la soluzione di liposomi magazzino di 5 concentrazione di lipidi mm con 0,1 mM tampone PBS (pH 7,4). Trasferire i campioni in una provetta da centrifuga (2 ml).
- Collocare la provetta in un bagno di acqua calda, e aumentare gradualmente la temperatura da 25 a 70 ° C. Aumentare la temperatura ad una velocità di 1 ° C / min qui.
- Raccogliere aliquote (10 microlitri) in diversi punti di temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 e 70 ° C).
- Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
- Trasferire 200 microlitri della soluzione liposomiale per ciascun pozzetto della micropiastra a 96 pozzetti e misurare l'intensità di fluorescenza dei campioni raccolti utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre. I eccitazione e di emissione di calceina sono rispettivamente 480 e 515 nm.
- Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni punto temporale, utilizzando la formula:
Ft è l'intensità di fluorescenza della soluzione in un determinato punto nel tempo. F i e F X Le normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.
4. Calceina Relocazione da liposomi con laser pulsato
- Trasferire soluzione liposomi 100 ml di una cuvetta di quarzo e collocarlo in un supporto cuvetta. Utilizzare un Nd: YAG con durata dell'impulso di 6 nsec a 532 nm di lunghezza d'onda come fonte di luce. Utilizzare i seguenti parametri Laser - Frequenza di ripetizione: 1 Hz; Densità di energia del laser: 1 mJ / cm 2; Diametro del fascio: 0,5 mm.
- Guida il fascio laser collimato attraverso la cuvetta in modo che la luce passa attraverso la soluzione di liposomi e raccogliere aliquote dopo vari impulsi.
- Aggiungere 10 ml di 2% Triton X-100 a 2 ml aliquota della soluzione liposomiale per digerire i liposomi per 10 minuti a RT e realizzare la completa liberazione di calceina.
- Considerando calceina è sensibile alla luce e potrebbe essere sbiancato durante l'esperimento laser, pre-misurare l'effetto sbiancante del laser impulsato in soluzione calceina per normalizzare i dati dal rilascio liposoma.
- In particolare, esporre soluzione calceina (60 mm) a impulsi laser with frequenza di 1 Hz per variare i numeri di impulsi (0, 25, 50 e 100). Misurare l'intensità di fluorescenza della calceina con eccitazione e di emissione di 480 nm e 515, rispettivamente, prima e dopo l'esposizione laser.
- Calcolare la quantità di sbiancamento (intensità di fluorescenza di calceina prima di intensità di esposizione del laser / fluorescenza della calceina dopo il numero di impulsi specifico). Utilizzare questo fattore di normalizzazione dei valori ottenuti da campioni di liposomi moltiplicando l'intensità di fluorescenza dei liposomi con il fattore.
- Misurare l'intensità di fluorescenza del campione raccolto utilizzando un lettore di fluorescenza per micropiastre alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione a 480 e 515 nm, rispettivamente.
- Prendendo l'intensità di fluorescenza dei campioni Triton X-100 trattate come rilascio 100%, calcolare la percentuale di calceina rilasciato ad ogni numero di impulsi, utilizzando la formula:
i e F X Le normalizzati intensità di fluorescenza iniziale e finale della soluzione, rispettivamente.
5. Determinazione degli impulsi di pressione
- Mettere 100 ml di campione su un vetrino microscopico e impostare la messa a fuoco del laser sul campione.
- Immergere un idrofono ago (1 mm di diametro e 450 sensibilità nV / Pa) nella soluzione.
Attenzione: L'idrofono non deve essere illuminata dalla luce laser per evitare il danno. - Irradiare il campione con il laser pulsato con numero variabile di impulsi (0-100) e l'energia di impulso (20-160 μJ / impulso).
- Registrare i segnali di pressione utilizzando un oscilloscopio digitale.
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Representative Results
I liposomi sono stati preparati utilizzando una tecnica film sottile idratazione convenzionale con DPPC, MPPC e DSPE-PEG2000 in un rapporto molare di 86: 10: 4 o 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml 12 Le dimensioni Au NP è critica per determinare la luce per riscaldare l'efficienza di conversione durante il seguente esperimento eccitazione laser. Minore è la dimensione di Au NP, maggiore è l'efficienza di trasduzione. 13 Così 5 nm Au NP, i più piccoli campioni da parte del fornitore, sono stati scelti per l'incapsulamento. Durante la sintesi, medio idratante che contiene Au NP e calceina è stato aggiunto per generare vescicole multi-lamellari, che sono stati poi oggetto di estrusione dimensioni e cromatografia gel filtrazione per rimuovere le libere Au NP e calceina.
Calceina è un colorante fluorescente idrofilo viene incapsulato all'interno del nucleo acquosa di liposomi ad una concentrazione di 60 mM. A queste concentrazioni elevate, la fluorescenza di calcein auto-disseta. Tuttavia, calceina è diluita come viene rilasciato dai liposomi, portando a fluorescenza ri-gain, indicando rilascio del farmaco attivato. 14 Basandosi su questa proprietà di liposomi calceina stato diluito al 5 mM e la risposta del sistema liposomiale al cambiamento di temperatura era osservato. Come indicato nella figura 2A, indipendentemente dalla presenza di Au NP, i liposomi erano quasi intatti alla temperatura fisiologica (cioè, 37 ° C) con una percentuale di perdite inferiore a 10%. Tuttavia, quando la temperatura viene portata a 42 ° C (leggermente al di sopra della temperatura di transizione dei lipidi), 60% -80% del calceina incapsulato viene rilasciato dal liposomi entro 2 min. Nessuna differenza significativa nella percentuale di rilascio si osserva all'interno dei liposomi con e senza Au NP, quando il rilascio viene attivato utilizzando il calore. Ciò è dovuto alla temperatura di transizione di fase del sistema. Inoltre, il rilascio rapido ed efficiente è dovuto al PreseSNO del 10% MPPC, che aumenta la permeabilità del liposoma bistrato alla temperatura di transizione.
Successivamente, il rilascio calceina da liposomi su radiazione laser è stato esaminato. La soluzione liposomiale è stata presa in una cuvetta di quarzo che è stato posto in un supporto cuvetta. 532 nm laser Nd: YAG impulsi con durata dell'impulso di 6 nsec ed una densità di potenza istantanea di 166.67 kW / cm 2 si è focalizzata sulla soluzione liposomiale. Aliquote di campioni sono stati raccolti in un numero variabile di impulsi (0, 25, 50 e 100), in cui la frequenza degli impulsi è fissato a 1 Hz. I campioni sono stati immediatamente trasferiti in una provetta e posto in un bagno di ghiaccio. Questo per evitare qualsiasi ulteriore rilascio di calceina. Il laser è stato spento, mentre la raccolta dei campioni. Come mostrato nella Figura 2B, liposomi con Au NP rilasciato il calceina incapsulato su di eccitazione, in cui la quantità di calceina rilasciato aumentato come il num impulsobri aumentato.
L'ultimo passo è stato quello di studiare il meccanismo di rilascio calceina dai liposomi con idrofono. Figura 3A è il segnale acustico registrato per Au NP (rosso), liposomi con Au NP (nero) e liposomi senza Au NP (blu). Mentre Au NP e liposomi con Au NP ha mostrato segnali di onde di pressione caratteristici, nessun segnale è stato osservato da liposomi senza Au NP. L'impulso di pressione contiene fasi positivi e negativi (inserto nella Figura 3A). Si suggerisce che microbolle formano (fase positiva) e perturbano (fase negativa) nella soluzione. La i valori minimi del picco registrato nei liposomi Au NP-contenenti al massimo e sono stati, rispettivamente, 0,00,093 mila e -,00074 V. Infine, sono stati calcolati i valori massimi e minimi media degli impulsi di pressione in funzione di aumentare l'energia laser. Come previsto, l'ampiezza del segnale acustico gradualmente aumentata con l'aumento laserl'energia (Figura 3B). Questo dovrebbe essere dovuto alla maggiore intensità dell'oscillazione delle particelle attribuiscono alla successiva espansione termoelastico e contrazione. 15,16
Figura 1. Il meccanismo di rilascio del farmaco proposto di liposomi foto-reattivo: Au NP (punti rossi) quando viene irradiato, generano microbolle che inficiano la membrana liposomi e quindi innescano il rilascio calceina Calceina, auto-spegnimento all'interno di liposomi (come indicato), fluorescente. come essere rilasciato al circostante. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. <strong> Calore e laser pulsato innescato rilascio di calceina da liposomi (A) Percentuale di calceina rilasciato da liposomi con o senza Au NP, che sono stati collocati in bagno d'acqua con diverse temperature di 2 min.; (B) Percentuale di calceina rilasciato da liposomi con Au NP, che sono stati trattati con laser pulsato (durata dell'impulso = 6 ns; densità di potenza ~ 12 mW / cm 2). Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti condotti in triplice copia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. (A) I segnali acustici misurati utilizzando un sistema idrofono per Au NP (rosso), liposomi con Au NP (nero) e liposomi senzau NP (blu). Mentre Au NP e liposomi con Au NP ha mostrato segnali di onde di pressione caratteristici, nessun segnale è stato osservato da liposomi senza Au NP. L'inserto mostra una vista ingrandita di segnali acustici di liposomi foto-sensibile. (B) e massimo valore di picco minimo di impulsi di pressione in funzione della crescente potenza del laser. L'ampiezza del segnale acustico aumenta gradualmente con l'energia laser crescente. Le barre di errore rappresentano la media ± SD di tre esperimenti indipendenti condotti in dieci corse. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
idratazione film sottile è il metodo convenzionale per la preparazione di liposomi. Solventi organici (cloroformio in questo caso) sono stati usati per primo dissolvere i lipidi e poi rimosso in un evaporatore rotante a 37 ° C per generare un sottile film lipidico sul pallone. Questo film lipidico venne idratato con la soluzione acquosa contenente 60 mM calceina e 5 nm Au NP. Durante il processo di idratazione, la temperatura è stata mantenuta a circa 50 ° C e il pallone viene agitato costantemente ruotando il pallone. La chiave in questa fase è la scelta di temperature a cui sono state effettuate rispettivamente l'evaporazione e l'idratazione. La temperatura di transizione di fase (Tm) di DPPC, il principale costituente del liposomi, è 41 ° C. Durante la formazione del lipide pensa film, la temperatura deve essere inferiore a 41 ° C per evitare la formazione di grumi di aggregati secchi lipidi. Durante l'idratazione, una temperatura superiore a T m è stato scelto per guidare i fosfolipidiauto-assemblano in strutture multilamellari sferiche. Sebbene sottile pellicola metodo idratazione è facile da eseguire, è limitata dalla scarsa efficienza di incapsulamento (<1%) del calceina e Au NP nella soluzione acquosa. In futuro, l'incapsulamento potrebbe essere migliorata attraverso cicli di gelo-disgelo.
Successivamente size-estrusione è stata fatta usando un tenuto in mano mini estrusore, posta su un blocco riscaldante. Un massimo di 1 ml di soluzione può essere estruso utilizzando questo set-up, che è ideale per una piccola scala preparato in laboratorio. La chiave in questa fase è ancora la temperatura, che dovrebbe essere al di sopra della temperatura di transizione di fase di liposomi. Consegnando l'estrusione a 50 ° C, la dimensione dei liposomi è diventata uniforme dopo 10 cicli di estrusione attraverso la membrana con pori 200 nm. Il movimento in questa fase deve essere lento e dolce come la pressione all'interno dell'estrusore è grande, mentre la membrana è fragile.
Un spesso trascurato ma importante step durante la sintesi del farmaco contenente liposomi è la purificazione o la rimozione dei farmaci non-incapsulati (ad esempio, calceina e Au NP qui). Ciò è stato fatto mediante cromatografia per gel filtrazione. È fondamentale che il ricercatore notare che la colonna PD-10 utilizzato in questo studio è adatto solo per l'elaborazione <2 ml di soluzione. I campioni con volume maggiore potranno essere trattati utilizzando più colonne.
Lo studio del rilascio calceina dal liposoma basa sulla autotempra di calceina a concentrazioni più elevate e ri-fluorescenza diluito. Quando i campioni sono stati esposti a calore o luce per il trattamento termico o laser, rispettivamente, aliquote di campioni sono stati costantemente ritirate in punti di temperatura variabile o numeri di impulsi e trasferite in fiale separate. Le fiale devono essere immediatamente posti in un bagno di ghiaccio per evitare il potenziale ulteriore rilascio di calceina, per misurazioni accurate. Un'altra cosa da notare è che calceina è sensibile alla lucee quindi potrebbe essere candeggiato durante l'esperimento laser. Per superare questo, l'effetto sbiancante di un laser pulsato sulla soluzione calceina dovrebbe essere misurata ei dati liberatoria liposoma normalizzata conseguenza.
Il protocollo descrive qui un metodo di preparazione facile per liposomi fotosensibili. rilascio termico è prima dimostrazione sfruttando la temperatura sensibile dei fosfolipidi. Il laser set up viene illustrato e luce innescato rilascio si ottiene con laser pulsato. Il meccanismo della luce innescato rilascio è anche esplorato ed è risultato essere dovuta alla membrana interruzione dalla cavitazione microbolle.
Diverso da tutti i protocolli riportati, questo protocollo sceglie materiali (ad esempio, lipidi e Au NP) che sono stati frequentemente utilizzati negli studi clinici e ampiamente disponibili sul mercato. L'uso di materiali facilmente accessibili permette a chiunque di preparare tale sistema fotosensibile da soli, senza neEd a chiedere aiuto tecnico. Inoltre, questo protocollo fa uso di sottili pellicole idratazione per preparare liposomi, che è sia conveniente e facilmente scalabile.
Questo protocollo semplice ma potente beneficerà ricercatori e clinici che sono interessati a raggiungere rilascio controllato di farmaci ai tessuti superficiali come la pelle. Una potenziale applicazione potrebbe essere quella di fornire agenti anti-scottature incorporando questo sistema all'interno di protezione solare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interesse sono dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dagli accademici fondi Tier-1 ricerca per Singapore Ministero della Pubblica Istruzione (RG 64/12 di CX) e NTU-Northwestern Istituto di nanomedicina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH) |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1,000 μl | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200 nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV-Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
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