Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة

Published: February 24, 2016 doi: 10.3791/53619
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 2Division of Physics, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تحضير بسيط للجسيمات متناهية الصغر من الذهب متكاملة الجسيمات الشحمية-صور متجاوبة مع المواد المتاحة تجاريا. كما يبين كيفية قياس عملية التجويف microbubble من الجسيمات الشحمية توليفها على علاج ليزر نابض.

Introduction

إمكانية لتحريك الافراج عن المخدرات باستخدام مؤثرات الخارجية هو وسيلة جذابة لتقديم الأدوية في الموضات spatial-، temporal- والتي تسيطر عليها الجرعة مع خصوصية مكبر والآثار السلبية الحد الأدنى. من بين مجموعة واسعة من أنظمة خارجية-المحفزات التي تستجيب (ضوء، المجال المغناطيسي والموجات فوق الصوتية، أشعة الميكروويف)، منصات أثار ضوئية جذابة، بسبب من غير الغازية، والبساطة والقدرة على التكيف في العيادات. 1 بحوث مستفيضة في العقد الماضي قدمت مجموعة متنوعة من التقنيات منصة، مثل الذهب مسؤولة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، الضوء (الاتحاد الافريقي) قفص نانوي المغلفة مع البوليمرات الذكية، 2-صورة عطوب، النانوية البوليمرية (NPS) مترافق مع الأدوية و 3 و nanovesicles porphysome الذاتي تجميعها. 4 ولكن ، هذه التقنيات لا تزال في مراحل ما قبل السريرية للتنمية، وتتطلب فهم واضح والتحسين من المعلمات المشاركين في عملية بدء وتابعالمتداول الافراج عن المخدرات.

واحد من أبسط ويمكن الوصول إليها بسهولة طرق لإعداد مثل هذا النظام هو دمج الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية حراريا الحساسة 5،6، متاحة على نطاق واسع في السوق وكلاهما وتم التحقيق فيها على نطاق واسع في التجارب قبل السريرية والسريرية حتى. وعلى الرغم من القيود المفروضة على تنشيط الأنسجة العميق من الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية في الطول الموجي من plasmonic، بالمقارنة مع النانو الاتحاد الافريقي الأشعة تحت الحمراء القريبة تنشيط (على سبيل المثال، قفص نانوي)، وهذا النظام لا يزال يحمل وعودا كبيرة عند استخدامها في الحيوانات الصغيرة أو للتسليم الموضعي في البشر. 7 هناك بعض الجهود المبكرة في الجمع بين الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية لإطلاق أثار خفيفة 8-11 في حين أن معظمهم من التركيز على الجدة من المواد، وتحتاج إلى معالجة المسائل المتعلقة بإمكانية الوصول وتطويره. وعلاوة على ذلك، تقارير عن آليات الإفراج استخدام هذه nanocarriers لا تزال محدودة.

هنا، وتلفيق الصور تستجيبوقد وصفت الجسيمات الشحمية، تحميل في وقت واحد مع المخدرات ومصادر القدرة النووية الاتحاد الافريقي ماء. يستخدم Calcein كمركب نموذج لتقييم كفاءة التغليف والتعريف الافراج عن النظام. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا النظام، وعلى ضوء استيعابها من قبل الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية تبدد إلى المكروية المحيطة بها في شكل حرارة، مما أدى إلى زيادة في درجة الحرارة المحلية. يتم إنشاء microbubbles الهواء أثناء التسخين ليزر ويسبب اضطراب الميكانيكية من الجسيمات الشحمية (الشكل 1). وأكد آلية التجويف microbubble بواسطة القياسات مائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد

  1. نظيفة 100 مل جولة قوارير السفلية باستخدام الماء الملكي (1 جزء من حمض النتريك (HNO 3) و 3 أجزاء من حامض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك)) وغسل القوارير بالماء DI. الأوتوكلاف قوارير وتجفيفها في فرن الهواء الساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التفاف وتخزين قوارير معقمة حتى الاستخدام.
  2. تعقيم مجموعة مصغرة الطارد باليد باستخدام الايثانول 70٪.
  3. بدوره على المبخر الدوار وضبط درجة الحرارة في حمام الماء الساخن وبرج التبريد عند 37 درجة مئوية و 4 درجات مئوية على التوالي.
  4. إعداد 60 ملي calcein حل الأسهم عن طريق إذابة 374 ملغ من calcein في 10 مل من 0.1 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل.

2. تجميع الليبوزومات

  1. إزالة الدهون (1،2-Dipalmitoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DPPC)، 1-بالميتويل-2-هيدروكسي التعطيل -glycero-3-phosphochoخط (MPPC) و 1، 2-distearoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [كربوكسي (البولي ايثيلين جلايكول) -2000] (ملح النشادر) (DSPE-PEG2000)) من الثلاجة (-20 درجة مئوية) وذوبان الجليد لهم RT.
  2. تزن 15.9 ملغ DPPC، 1.3 ملغ MPPC، و 2.8 ملغ DSPE-PEG2000. حل لهم معا في 2 مل الكلوروفورم.
  3. نقل الحل الكلوروفورم إلى الجولة معقمة قارورة أسفل وتتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار تحت ضغط منخفض، لتشكيل طبقة رقيقة من المادة الدهنية الجافة.
  4. ترطيب طبقة الدهون عند 45 درجة مئوية مع 2 مل من محلول مائي لمدة 30 دقيقة تحتوي على 1.95 مل 60 ملي calcein أعدت في الخطوة 1.4 و 50 ميكرولتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (3.36 × 10 16 الجسيمات / مل).
  5. قبل تسخين كتلة التدفئة إلى 45 درجة مئوية. وضع 200 نانومتر مرشح غشاء البولي بين دعامات تصفية وتجميع مجموعة مصغرة الطارد. فحص التسرب المحتمل بالماء DI.
  6. ملء واحدة من الحقن مع 1 مل من محلول الحويصلية من الخطوة 2.4 و extruدي العينة عن طريق تمرير الحل لحقنة في الطرف الآخر من تجميع مصغرة الطارد. كرر 11 مرة.
  7. تشغيل الجسيمات الشحمية توليفها من خلال عمود تحلية PD-10 لإزالة الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية حرة والدهون وcalcein باستخدام برنامج تلفزيوني كما شاطف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تخزين العينات في أنابيب معقمة في 4 درجات مئوية واستخدامها في 2 يوما.

3. Calcein بيان من الليبوزومات تدفئة

  1. حساب المولية الدهون من محلول المخزون بجمع molarities من DPPC، MPPC، وDSPE-PEG2000 في الخطوة 2.2. تمييع الحل الأسهم الحويصلية إلى 5 ملي تركيز الدهون باستخدام 0.1 عازلة ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). نقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي (2 مل).
  2. وضع الأنبوب في حمام الماء الساخن، ورفع درجة الحرارة تدريجيا 25-70 درجة مئوية. زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة هنا.
  3. جمع قسامات (10 ميكرولتر) في نقاط مختلفة في درجة الحرارة (27، 32، 37، 39، 41،43، 45، 52، 57، 62، 67 و 70 درجة مئوية).
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  5. نقل 200 ميكرولتر من الحل liposomal إلى كل بئر في صفيحة 96 جيدا وقياس كثافة مضان من العينات التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة. الإثارة وانبعاث موجات من calcein هي 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    فورمولا 1
    قدم هو كثافة مضان من الحل في نقطة زمنية معينة. ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

4. Calcein إعادةتأجير من الليبوزومات مع ليزر نابض

  1. نقل 100 ميكرولتر حل الحويصلية إلى كفيت الكوارتز ووضعه في حامل كوفيت. استخدام نابض الثانية: YAG الليزر مع مدة نبضة من 6 NSEC في 532 الطول الموجي نانومتر كمصدر للضوء. استخدم ما يلي المعلمات ليزر - معدل التكرار: 1 هرتز؛ كثافة طاقة الليزر: 1 ميغا جول / سم 2. شعاع قطره: 0.5 مم.
  2. توجيه شعاع ليزر موازى من خلال كفيت بحيث يمر الضوء من خلال حل الحويصلية وجمع قسامات بعد مختلف البقول.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  4. النظر calcein حساس للضوء، ويمكن أن يكون ابيض خلال التجربة الليزر، قبل قياس تأثير تبييض ليزر نابض على حل calcein لتطبيع البيانات من الإفراج الحويصلية.
    1. على وجه التحديد، فضح حل calcein (60 ملم) إلى واي ليزر نابضتردد التاسع من 1 هرتز لمدة متفاوتة نبض الأرقام (0، 25، 50 و 100). قياس كثافة مضان من calcein مع الإثارة وانبعاث موجات من 480 و 515 نانومتر على التوالي، وذلك قبل وبعد التعرض لليزر.
    2. حساب كمية تبيض (كثافة مضان من calcein قبل كثافة الليزر التعرض / مضان من calcein بعد عدد معين النبض). استخدام هذا العامل لتطبيع القيم التي تم الحصول عليها من عينات الحويصلية بضرب كثافة مضان من الجسيمات الشحمية مع عامل.
  5. قياس كثافة مضان من العينة التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة في الإثارة وانبعاث موجات في 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل عدد النبض، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    فورمولا 1
    ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

5. قياس النبضات الضغط

  1. وضع 100 ميكرولتر من العينة على شريحة مجهرية وتعيين تركيز الليزر على العينة.
  2. تزج مائي إبرة (قطر 1 ملم و 450 حساسية نيفادا / باسكال) إلى الحل.
    تحذير: يجب ألا تكون مضيئة ومائي بواسطة ضوء الليزر لتجنب الضرر.
  3. أشرق العينة مع ليزر نابض مع اختلاف الأرقام النبض (0-100) والطاقة النبض (20-160 μJ / نبض).
  4. تسجيل إشارات الضغط باستخدام الذبذبات الرقمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إعداد الجسيمات الشحمية باستخدام تقنية رقيقة فيلم الترطيب التقليدية مع DPPC، MPPC وDSPE-PEG2000 في نسبة المولي من 86: 10: 4 أو 7.95: 0.65: 1.39 ملغ / مل 12 حجم الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية أمر بالغ الأهمية لتحديد الضوء للحرارة كفاءة التحويل خلال التجربة الإثارة ليزر التالية. أصغر حجم من الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، العالي كفاءة transducing. وقد تم اختيار 13 وهكذا 5 نانومتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، أصغر عينات من البائع، لتغليف. خلال التوليف، وأضيف ترطيب المتوسط ​​تحتوي على الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية وcalcein لتوليد الحويصلات المتعددة رقائقي، التي كانت آنذاك خاضعة لقذف حجم واللوني هلام الترشيح لإزالة الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية حرة وcalcein.

Calcein هو يتم تغليف صبغة الفلورسنت ماء داخل نواة مائي من الجسيمات الشحمية بتركيز 60 ملي. في مثل هذه التركيزات العالية، ومضان جalcein-يروي النفس. ومع ذلك، يتم تخفيف calcein كما يتم تحريرها من الجسيمات الشحمية، مما يؤدي إلى مضان إعادة كسب، مشيرا إلى إطلاق سراح المخدرات تشغيلها. 14 الاعتماد على هذه الخاصية من الجسيمات الشحمية calcein تم تخفيفه إلى 5 ملم وكان رد النظام liposomal إلى التغير في درجة الحرارة لوحظ. كما هو مبين في الشكل 2A، بغض النظر عن وجود الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، كانت الجسيمات الشحمية سليمة تقريبا في درجة حرارة الفسيولوجية (أي 37 درجة مئوية) مع نسبة التسرب من أقل من 10٪. ومع ذلك، عندما تم رفع درجة الحرارة إلى 42 درجة مئوية (أعلى قليلا من درجة حرارة التحول من الدهون)، 60٪ يتم تحريرها -80٪ ​​من calcein مغلفة من الجسيمات الشحمية في 2 دقيقة. ويلاحظ وجود اختلاف كبير في نسبة الافراج داخل الجسيمات الشحمية مع وبدون الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، عندما الافراج يتم تشغيل باستخدام الحرارة. ويرجع ذلك إلى درجة حرارة مرحلة الانتقال من نظام هذا. وعلاوة على ذلك، هو الإصدار سريعة وفعالة يرجع ذلك إلى بريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من 10٪ MPPC، مما يعزز نفاذية طبقة ثنائية الحويصلية في درجة حرارة التحول.

بعد ذلك، تم فحص الإفراج calcein من الجسيمات الشحمية على أشعة الليزر. وقد اتخذ هذا الحل liposomal في كوفيت الكوارتز التي وضعت في حامل كوفيت. وتركز YAG نبضة ليزر مع مدة نبضة من 6 NSEC وكثافة الطاقة لحظية من 166.67 كيلو وات / سم 2 على حل liposomal: 532 نانومتر بدون تاريخ. تم جمع أجزاء مأخوذة من عينات متفاوتة في أعداد نبض (0، 25، 50، و 100) التي تم فيها تثبيت وتيرة النبض في 1 هرتز. تم نقل عينات على الفور إلى أنبوب microcentrifuge وتوضع في حمام الثلج. وهذا لمنع أي إطلاق مزيد من calcein. تم تحويل الليزر قبالة حين جمع العينات. كما هو مبين في الشكل 2B، الجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية أفرجت calcein مغلفة على الإثارة، حيث كمية calcein صدر زاد كما الأسطوانات النبضزيادة اأفراد.

وكانت الخطوة الأخيرة لدراسة آلية الافراج calcein من الجسيمات الشحمية مع مائي الشكل 3A هو إشارة صوتية مسجلة ل Au مصادر القدرة النووية (الحمراء)، الجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (أسود) والجسيمات الشحمية دون الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (الأزرق). في حين أظهرت الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية والجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية إشارات موجة ضغط مميزة، وقد لوحظ عدم وجود إشارة من الجسيمات الشحمية دون الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية. الدافع ضغط يحتوي على مراحل الإيجابية والسلبية على حد سواء (أقحم في الشكل 3A). وتقترح أن microbubbles تشكل (مرحلة ايجابية) وتعطيل (المرحلة السلبية) في الحل. وكان الحد الأقصى والحد الأدنى من قيم الذروة المسجلة في الجسيمات الشحمية الاتحاد الافريقي NP-تحتوي على 0.00093 و-0،00074 الخامس على التوالي. وأخيرا، تم حساب متوسط ​​القيم العظمى والصغرى للنبضات الضغط بوصفها وظيفة من زيادة طاقة الليزر. كما هو متوقع، إشارة السعة الصوتيات تدريجيا مع الليزر زيادةالطاقة (الشكل 3B). وهذا ينبغي أن يكون راجعا إلى زيادة شدة التذبذب من الجسيمات ينسبون الى التوسع اللاحق الحرارية المرنة والانكماش. 15،16

الشكل 1
الشكل 1. اقترح آلية الافراج المخدرات من الجسيمات الشحمية-صور متجاوبة: الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (النقاط الحمراء) عندما يجري المشع، وتوليد microbubbles التي تعطل الغشاء الحويصلية وبالتالي يؤدي الافراج calcein Calcein، داخل الجسيمات الشحمية (كما هو موضح)، التبريد الذاتي، تتفلور. كما أن يطلق سراحه إلى المحيطة بها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. <أثارت قوية> الحرارة والليزر النبضي الإفراج عن calcein من الجسيمات الشحمية (أ) النسبة المئوية من calcein صدر من الجسيمات الشحمية مع أو بدون الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، التي تم وضعها في حمام مائي مع درجات حرارة مختلفة لمدة 2 دقيقة؛ (ب) النسبة المئوية من calcein صدر من الجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية، والتي تم علاجها بالليزر النبضي (مدة النبضة = 6 NSEC، كثافة الطاقة ~ 12 ميغاواط / سم 2). أشرطة الخطأ تمثل يعني ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. (أ) الإشارات الصوتية قياس باستخدام نظام مائي ل Au مصادر القدرة النووية (الحمراء)، الجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (أسود) والجسيمات الشحمية دونش مصادر القدرة النووية (الأزرق). في حين أظهرت الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية والجسيمات الشحمية مع الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية إشارات موجة ضغط مميزة، وقد لوحظ عدم وجود إشارة من الجسيمات الشحمية دون الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية. يظهر أقحم موسع للرأي الإشارات الصوتية من الجسيمات الشحمية-صور استجابة. (ب) الحد الأقصى والحد الأدنى للقيمة ذروة نبضات الضغط بوصفها وظيفة من زيادة قوة الليزر. إشارة السعة الصوتيات يزيد تدريجيا مع زيادة طاقة الليزر. أشرطة الخطأ تمثل يعني ± SD من ثلاث تجارب مستقلة أجريت في عشرة أشواط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

رقيقة ترطيب الفيلم هو الأسلوب التقليدي لإعداد الجسيمات الشحمية. استخدمت المذيبات العضوية (كلوروفورم في هذه الحالة) أولا بحل الدهون ومن ثم إزالتها في المبخر الدوار عند 37 درجة مئوية لتوليد طبقة رقيقة الدهون في القارورة. كان رطب هذا الفيلم الدهون مع محلول مائي يحتوي على 60 ملي calcein و 5 نانومتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية. أثناء عملية الترطيب، والحفاظ على درجة الحرارة حوالي 50 درجة مئوية، وكانت قارورة تحريكها باستمرار عن طريق تدوير القارورة. المفتاح في هذه الخطوة هو اختيار درجات الحرارة التي أجريت على التبخر والماء خارج على التوالي. درجة الحرارة المرحلة الانتقالية (T م) من DPPC، الرئيسية المكونة من الجسيمات الشحمية، هي 41 درجة مئوية. خلال تشكيل الدهون يعتقدون الفيلم، يجب أن تكون درجة حرارة أقل من 41 درجة مئوية إلى منع تشكيل كتل مجمعة من الدهون المجففة. خلال الماء، وقد تم اختيار درجة حرارة أعلى من T م لطرد الدهون الفوسفاتية لالتجمع الذاتي في الهياكل الصفاحات كروية. على الرغم من أن رقيقة طريقة فيلم الماء من السهل القيام بها، يحده ضعف كفاءة التغليف (<1٪) من calcein والاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية في محلول مائي. في المستقبل، يمكن أن تحسن التغليف من خلال دورات تجميد ذوبان الجليد.

وقد تم لاحقا حجم قذف باستخدام اليد التي عقدت الطارد صغيرة، وضعت على كتلة التدفئة. بحد أقصى 1 مل من محلول يمكن مقذوف باستخدام هذا الإعداد، والذي يعتبر مثاليا لإعداد نطاق صغير في المختبر. المفتاح في هذه الخطوة لا تزال درجة الحرارة، والتي ينبغي أن تكون أعلى من درجة الحرارة المرحلة الانتقالية من الجسيمات الشحمية. بتسليم قذف عند 50 درجة مئوية، وحجم الجسيمات الشحمية أصبحت موحدة بعد 10 دورات من قذف عبر الغشاء مع 200 نانومتر المسام. يجب أن تكون الحركة في هذه الخطوة بطيئة ورقيقة مثل الضغط داخل الطارد كبير في حين أن غشاء هش.

واحد كثيرا ما يغفل لكن الظريف المهمص خلال تركيب الجسيمات الشحمية المخدرات التي تحتوي هو تنقية أو إزالة أدوية مغلفة الامم المتحدة (أي calcein والاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية هنا). وقد تم ذلك من قبل اللوني هلام الترشيح. فمن الأهمية بمكان للباحث أن ينتبهوا إلى أن العمود PD-10 المستخدمة في هذه الدراسة هو فقط مناسبة لمعالجة <2 مل من محلول. يمكن معالجة العينات مع حجم أكبر باستخدام أعمدة متعددة.

دراسة الإفراج calcein من الجسيمات الشحمية تعتمد على التبريد الذاتي من calcein بتركيزات أعلى وإعادة مضان كما المخفف. عندما عرضت عينات للحرارة أو ضوء لمعالجة حرارية أو ليزر على التوالي، تم سحب aliquots من عينات باستمرار في متفاوتة نقطة درجة الحرارة أو أرقام النبض ونقل إلى قارورة منفصلة. قارورة يجب أن توضع فورا في حمام الثلج لمنع المزيد من احتمال إطلاق calcein، لقياسات دقيقة. شيء آخر لاحظت أن calcein حساس للضوءوبالتالي يمكن أن يكون ابيض خلال التجربة الليزر. للتغلب على هذا، يجب قياس تأثير التبييض ليزر نابض على حل calcein والبيانات من الإفراج الحويصلية تطبيع وفقا لذلك.

يصف بروتوكول هنا طريقة إعداد سطحي لالجسيمات الشحمية الحساسة للضوء. وأظهرت الإفراج الحراري لأول مرة من خلال استغلال الحرارة استجابة من الدهون الفوسفاتية. ويتضح الليزر إعداد وأدى ضوء الإفراج يتحقق عن طريق الليزر نابض. وأثارت آلية الضوء استكشاف الإصدار أيضا وجدت أن ذلك يعود إلى غشاء تعطيل من قبل التجويف microbubble.

تختلف عن كل البروتوكولات عنها، يختار هذا البروتوكول المواد (أي الدهون والاتحاد الافريقي NPS) التي استخدمت في كثير من الأحيان في التجارب السريرية ومتاحة على نطاق واسع في السوق. استخدام المواد يمكن الوصول إليها بسهولة يسمح لأي شخص أن يعد هذا النظام الحساسة للضوء في حد ذاتها، دون نيإد لطلب المساعدة التقنية. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول يجعل من استخدام الماء رقيقة لإعداد الجسيمات الشحمية، التي هي على حد سواء فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير بسهولة.

وهذا البروتوكول بسيطة ولكنها قوية يستفيد الباحثون والأطباء الذين يرغبون في تحقيق تسليم المخدرات تسيطر على الأنسجة السطحية مثل الجلد. يمكن للمرء أن التطبيق المحتمل أن يكون لتوصيل الأدوية المضادة للحروق الشمس من خلال دمج هذا النظام داخل واقية من الشمس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بحوث العلمية الشق 1 من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (RG 64/12 إلى CX) ومعهد جامعة تايوان الوطنية-نورث وسترن من النانوي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 850355P Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 855675P Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 880120P Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles Sigma Aldrich 752568-100mL 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein Sigma Aldrich C0875-10g 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493 0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100   Sigma, Life Sciences X-100 To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor   Buchi (Switzerland) R 210 Used for Lipososme preparation
Heating bath Buchi (Switzerland) B 491 Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller   Buchi (Switzerland) V-850 Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump Buchi (Switzerland) V-700 Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller Polyscience Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block  Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610000 Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610017 Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm Whatmann 800281 Used for extrusion of liposomes
Filter Support Avanti Polar Lipids (Alabama, US) 610014 Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium GE Healthcare, Life sciences 17-0851-01 Used to purify the liposomes
Centrifuge   Sigma Laboratory Centrifuges 3K30 Used to concentrate the liposomal solution 
Rotor Sigma 19777-H Used to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer   Nano ZS Malvern Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer Shimadzu UV-2450 Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer   Molecular Devices SpectraMax M5 Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser NewWave Research 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone ONDA HNR-1000 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope LECORY - Wave Runner 64Xi-A Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796 (2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104 (2010).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 108، منبهات متجاوبة خارجية المنشأ النانوية، الجسيمات الشحمية ضوء الاستجابة، والجسيمات النانوية الذهبية، وتسليم المخدرات، وإطلاق سراح رقابة، التجويف microbubble
توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathiyazhakan, M., Chan, W., Ohl, C. … More

Mathiyazhakan, M., Chan, W., Ohl, C. D., Xu, C. Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation. J. Vis. Exp. (108), e53619, doi:10.3791/53619 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter