Summary
このプロトコルは、市販の材料で光応答性リポソームを統合し、金ナノ粒子のための簡単な製造方法を説明します。また、パルスレーザーの治療の際に合成されたリポソームのマイクロバブルキャビテーションプロセスを測定する方法を示しています。
Introduction
外部刺激を用いた薬物放出をトリガーする可能性が最大化された特異性と最小限の副作用で、spatial- temporal-および用量制御ファッションで薬物を送達するための魅力的な方法です。外因性の刺激応答システム（光、磁場、超音波、マイクロ波放射）の広い範囲の中で、光トリガ型プラットフォームは、診療所での非侵襲性、シンプルさと適応性に起因して、魅力的である。過去10年間に1広範な研究薬、3および自己組織porphysomeのnanovesiclesと結合したスマートポリマー、2光不安定性、ポリマーナノ粒子（NPS）で被覆された近赤外光を担当する金（Au）などのプラットフォーム技術、ナノケージのさまざまなを提供してきました。4しかし、 、これらの技術は、開発の前臨床段階にまだある、と開始および続きのプロセスに関与するパラメータの明確な理解と最適化が必要薬物放出をローリング。
このようなシステムを製造するための最も簡単かつ容易にアクセスできる方法の一つは、市場で広く入手可能であり、広範囲に前臨床、さらには臨床試験で研究されてきたどちらも熱感受性リポソーム5,6と金のNPを統合することです。近赤外活性化のAuナノ構造体（ 例えば、ナノケージ）と比較すると小さな動物またはヒトにおける局所送達のために使用される場合、それらのプラズモン波長でのAu NPの深部組織の活性化の限界にもかかわらず、このシステムは、依然として非常に有望です。 7光点弧のリリースのためにリポソームとのAuのNPを組み合わせることでいくつかの初期の努力があります。8月11日に 、それらのほとんどは材料の新規性に焦点を当てながら、アクセシビリティとスケーラビリティの問題に対処する必要があります。また、これらのナノキャリアを使用して、放出機構に関する報告はまだ限られています。
ここで、光応答性の製作同時に薬物や親水性のAuのNPが装填されたリポソームは、記載されています。カルセインは、カプセル化効率及びシステムの放出プロフィールを評価するために、モデル化合物として使用されます。また、このシステムでは、金のNPによって吸収された光は、局所的な温度の上昇をもたらす、熱の形で周囲の微小環境に消散します。空気の微小気泡は、レーザー加熱時に生成されたリポソーム（ 図1）の機械的破壊を引き起こしています。マイクロバブルキャビテーションのメカニズムは、ハイドロホンの測定によって確認されます。
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Protocol
1.準備
- 王水（濃硝酸（HNO 3）を1部、濃縮塩酸（HCl）の3部）を使用してクリーンな100mlの丸底フラスコに、DI水でフラスコを洗浄します。フラスコをオートクレーブし、15分間100℃の熱風オーブン中でそれらを乾燥させます。ラップし、使用するまで無菌フラスコを格納します。
- 70％エタノールを用いてハンドヘルドミニ押出機のセットを滅菌します。
- 回転蒸発器をオンにして、それぞれ37℃と4℃の湯浴と冷却塔の温度を設定します。
- 10 mlの0.1 mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）中のカルセインの374ミリグラムを溶解することによって原液をカルセイン60mMのを準備します。 1 M水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を用いてpHを7.4に調整します。
リポソームの2.合成
- 脂質を除去（1,2- Dipalmitoyl- のsn -glycero-3ホスホコリン（DPPC）、1-パルミトイル-2-ヒドロキシSN -glycero-3-phosphochoライン（MPPC）及び1、2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol -アミンN - [カルボキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（DSPE-PEG2000））冷凍庫から（-20°C）そしてRTにそれらを解凍。
- 15.9 mgのDPPC、1.3 mgのMPPC、および2.8 mgのDSPE-PEG2000を秤量します。 2ミリリットルのクロロホルムにそれらを一緒に溶かします。
- 滅菌した丸底フラスコにクロロホルム溶液を移し、薄い、乾燥した脂質層を形成するために、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて溶媒を蒸発させます。
- 2ミリリットルでステップ1.4および50μlの金のNP（3.36×10 16粒子/ ml）で調製した1.95ミリリットルの60mMカルセインを含む30分間の水溶液を45℃での脂質層を水和。
- 45°Cに加熱ブロックを予熱。フィルタ支持体間200nmのポリカーボネートメンブレンフィルターを置き、ミニ押出機のセットを組み立てます。 DI水との潜在的な漏れをチェックします。
- ステップ2.4とextruからリポソーム溶液1ミリリットルと注射器のいずれかを記入組み立てミニ押出機のもう一方の端にシリンジに溶液を通過させることにより、サンプルド。 11回繰り返します。
- 製造業者のプロトコルに従って溶離液としてPBSを使用して自由にAuのNP、脂質およびカルセインを除去するために、PD-10脱塩カラムを経て合成リポソームを実行します。
- 4℃で滅菌チューブ内のサンプルを保管し、2日後に使用します。
ヒーターを有するリポソームから3カルセインリリース
- ステップ2.2でDPPC、MPPC、およびDSPE-PEG2000のモル濃度を追加することにより、原液の脂質モル濃度を計算します。 0.1 mMのPBS緩衝液（pH7.4）を使用して、5 mMの脂質濃度にリポソーム原液を希釈します。遠心管（2ミリリットル）にサンプルを転送します。
- 湯浴中でチューブを置き、25から70℃まで徐々に温度を上昇させます。ここでは1℃/分の速度で温度を上げます。
- 異なる温度点（27、32、37、39、41でアリコート（10μl）を収集し、43、45、52、57、62、67及び70℃）。
- RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
- 96ウェルマイクロプレートの各ウェルにリポソーム溶液200μlを移し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて収集されたサンプルの蛍光強度を測定します。カルセインの励起および発光波長は、それぞれ480および515 nmです。
- 100％放出としてトリトンX-100処理されたサンプルの蛍光強度を取って、数式を使用して、各時点で放出されたカルセインの割合を計算します。
FTは、所与の時点での溶液の蛍光強度です。 F iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。
4.カルセイン再パルスレーザーを用いたリポソームからリース
- 石英キュベットに100μlのリポソーム溶液を移し、キュベットホルダーに入れてください。光源として波長532nmでの6ナノ秒のパルス持続時間を持つ：YAGレーザーパルスのNdを使用してください。次のレーザーパラメータを使用してください - 繰り返しレート：1 Hzの。レーザーエネルギー密度：1ミリジュール/ cm 2で、ビーム径0.5 mmです。
- 光はリポソーム溶液を通過するように、キュベットを介して平行レーザビームを案内し、様々なパルスの後に一定分量を収集します。
- RTで10分間リポソームを消化し、カルセインの完全な放出を達成するためにリポソーム溶液の2％トリトンX-100〜2ミリリットルのアリコート10μlのを追加します。
- カルセインを考慮すると、光に敏感であり、レーザー実験中に漂白することができ、リポソームのリリースからデータを正規化するために、カルセイン液にパルスレーザーの漂白効果を事前に測定します。
- 具体的には、カルセイン溶液（60 mM）のパルスレーザのwiへを公開パルス数（0、25、50および100）を変化させるための1ヘルツの番目の周波数。前とレーザー露光した後、それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長のカルセインの蛍光強度を測定します。
- 漂白の量（レーザー露光/特定のパルス数の後にカルセインの蛍光強度の前にカルセインの蛍光強度）を計算します。因子を有するリポソームの蛍光強度を乗算することにより、リポソーム試料から得られた値を正規化するためにこの係数を使用。
- それぞれ480および515 nmでの励起および発光波長で蛍光マイクロプレートリーダーを使用して採取された試料の蛍光強度を測定します。
- 100％放出としてトリトンX-100で処理した試料の蛍光強度を取って、それぞれのパルス数で放出カルセインの割合を計算し、式を用いて。
iとF xは、それぞれ溶液の正規化された最初と最後の蛍光強度です。
圧力インパルスの5測定
- 顕微鏡スライド上に100μlの試料を置き、サンプルにレーザの焦点を設定します。
- 溶液中に針ハイドロホン（直径1mmおよび450はnV / Paの感度）を浸し。
注意：ハイドロホンは、損傷を避けるために、レーザー光を照射することはできません。 - 様々なパルス数（0-100）とパルスエネルギー（20から160μJ/パルス）でパルスレーザーを試料に照射します。
- デジタルオシロスコープを使用して圧力信号を記録します。
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Representative Results
10：4または7.95：リポソームは86のモル比でDPPC、MPPCおよびDSPE-PEG2000を有する従来の薄膜水和法を用いて調製した0.65：1.39 mg / mlで12のAu NPのサイズは、光を決定することが重要です以下のレーザー励起実験中の変換効率を加熱します。金NPのサイズ、より高いが、変換効率である。13したがって5nmの金のNP小さく、ベンダーからの最小のサンプルは、カプセル化のために選択しました。合成の間、金のNPおよびカルセインを含む水和培地は、その後自由にAuのNPとカルセインを除去するためにサイズの押出およびゲルろ過クロマトグラフィーに供したマルチラメラ小胞を、生成するために追加されました。
カルセインは、親水性の蛍光色素が60 mMの濃度でリポソームの水性コア内にカプセル化されています。 Cのような高濃度では、蛍光自己クエンチをalcein。それは、リポソームから放出されるが、カルセインがトリガ薬物放出を示す、蛍光の再獲得につながる、希釈する。14カルセインリポソームのこの性質に依存するの5mMに希釈し、温度変化にリポソームシステムの応答がありました観察しました。 図2Aに示されるようにかかわらず、金NPの存在下での、リポソームは、10％未満の漏れ率を有する生理的温度（ すなわち、37℃）で、ほとんど無傷でした。温度が42°C（少し脂質の転移温度以上）に上昇させたときしかし、カプセル化されたカルセインの60％-80％は、2分以内にリポソームから放出されます。リリース率の有意差はリリースが熱を用いてトリガされたときに、金のNPととせずにリポソーム内に観察されません。これは、システムの相転移温度に起因します。また、迅速かつ効率的な放出はpresaの複数形に起因しています遷移温度で、リポソーム二重層の透過性を高める10％MPPCのNCE。
次に、レーザ照射によりリポソームからのカルセインの放出を調べました。リポソーム溶液をキュベットホルダーに入れた石英キュベットに入れました。 532nmでのNd：6ナノ秒のパルス持続時間を有するYAGパルスレーザ及び166.67キロワット/ cm 2の瞬時出力密度は、リポソーム溶液に集光しました。サンプルのアリコートを、パルス周波数が1Hzで固定された変化するパルス数（0、25、50、100）で収集しました。サンプルは直ちにマイクロ遠心管に移し、氷浴中に置きました。これは、カルセインのさらなる放出を防止することです。サンプルを収集しながら、レーザーがオフになりました。 図2Bに示すように、金NPを有するリポソームが放出カルセインの量はパルスNUMに増加する、励起時にカプセル化されたカルセインの放出しましたBERが増加しました。
最後のステップは、ハイドロフォンとリポソームからのカルセインの放出のメカニズムを研究することであった。 図3（a）は、金のNP（赤）のために記録された音響信号であり、金のNP（黒）とAuのNPのないリポソーム（青）を有するリポソーム。金のNPのAuのNPおよびリポソーム特性圧力波シグナルを示したが、無信号は、Au NPをなしのリポソームから観察されませんでした。圧力インパルスは（ 図3A内のイラスト）正と負の両方のフェーズが含まれています。これは、マイクロバブルが（正相）を形成し、溶液中で（逆相）を破壊することを示唆しています。最大とAu NP含有リポソームで記録されたピークの最小値は、それぞれ0.00093と-0.00074 Vでした。最後に、増加するレーザーエネルギーの関数としての圧力インパルスの平均最大値及び最小値を算出しました。予想されるように、音響信号の振幅が徐々に増加するレーザーとともに増加エネルギー（ 図3B）。これは、その後の熱弾性伸縮に帰属粒子の振動の強度が増大によるものであるべきである。15,16
光応答性リポソームの提案薬剤放出機構 1 図 ： 金のNP（赤い点）照射され、リポソーム膜を破壊マイクロバブルを発生させるため、カルセイン放出を誘発カルセイン、リポソーム内自己消光（示すように）、蛍光を発します。周囲に放出されているとおりである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. <強い>熱とパルスレーザは、リポソームからのカルセインの放出を誘発し、2分間、種々の温度で水浴中に入れたAu NPを伴うまたは伴わないリポソームから放出されたカルセインの（A）の割合。 （B）パルスレーザー（パルス持続時間= 6ナノ秒;出力密度〜12ミリワット/ cm 2）を用いて処理した金NPを有するリポソームから放出されたカルセインの割合。エラーバーは三連で実施した3つの独立した実験の平均値±標準偏差（SD）を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3（A）音響信号は、Au NPを（赤）、AなしのAu NPを（黒）とリポソームとリポソームのためのハイドロフォンシステムを用いて測定UのNP（青）。金のNPのAuのNPおよびリポソーム特性圧力波シグナルを示したが、無信号は、Au NPをなしのリポソームから観察されませんでした。挿入図は、光応答性リポソームの音響信号の拡大図を示します。 （B）最大レーザパワーを増大させる関数として圧力インパルスの最小ピーク値。音響信号の振幅が徐々に増加するレーザーエネルギーと共に増加します。エラーバーは、10の実行で行われ、3つの独立した実験の平均±SDを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
薄膜水和は、リポソームを調製するための従来の方法です。有機溶媒（この場合はクロロホルム）まず、脂質を溶解するために使用し、次いでフラスコに脂質薄膜を生成するために、37℃でロータリーエバポレーターで除去しました。この脂質膜は、60mMのカルセインと5nmの金のNPを含有する水溶液で水和しました。水和プロセスの間、温度を約50℃に維持し、フラスコを常にフラスコを回転させて撹拌しました。この段階で鍵が蒸発し、水和がそれぞれ行われた時に温度の選択です。 DPPCリポソームの主成分の相転移温度（T m）は、41°Cです。脂質の形成時にフィルム、温度は乾燥した脂質の凝集した塊の形成を防止するために、41℃以下であるべきだと思います。水和中、T mより高い温度は、リン脂質を駆動するために選択されました球状の多層構造に自己集合します。薄膜水和法を実行するのは簡単であるが、それは、水溶液中のカルセイン及びAu NPの乏しいカプセル化効率（<1％）によって制限されます。将来的には、カプセル化は、凍結融解サイクルにより改善される可能性があります。
後続のサイズの押出は、加熱ブロック上に配置されたハンドヘルドミニ押出機を用いて行きました。 1ミリリットルの溶液の最大値は、実験室での小規模製造のための理想的である、このセットアップを使用して押し出すことができます。この段階でキーがまだリポソームの相転移温度以上でなければならない温度です。 50℃で押し出しを渡すことにより、リポソームの大きさは、200ナノメートルの孔を有する膜を通して押し出しの10サイクル後に均一になりました。膜は壊れやすいながら押出機内の圧力が大きいように、この段階での動きが遅く、穏やかでなければなりません。
Oneしばしば見落とさしかし重要なSTE薬物含有リポソームの合成中pは精製または未カプセル化された薬（ここではすなわち、カルセインとAuのNP）の除去です。これは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行いました。研究者は、この研究で使用したPD-10カラム<2 mlの溶液を処理するためにのみ適していることを確認することが重要です。大きな体積を有するサンプルは、複数の列を使用して処理することができます。
希釈して、リポソームからのカルセインの放出の研究では、高濃度でカルセインと再蛍光の自己消光に依存しています。サンプルは、それぞれ、熱またはレーザー治療のための熱または光に暴露したときに、サンプルのアリコートを、絶えず変化する温度点またはパルス数で取り出し、別々のバイアルに移しました。バイアルは直ちに正確な測定のために、カルセインの潜在的なさらなる放出を防止するために氷浴に配置する必要があります。注意すべきもう一つは、カルセインは光に敏感であるということです従って、レーザー実験中に漂白することができました。これを克服するために、カルセイン液にパルスレーザーの漂白効果が測定されるべきであり、リポソームのリリースからのデータは、それに応じて正規化。
プロトコルは、ここに光感受性リポソームのための容易な製造方法を説明します。熱放出は、第一のリン脂質の応答温度を利用することによって実証されます。セットアップレーザーが示されており、光がパルスレーザーによって達成される放出がトリガされます。光のメカニズムは、リリースをトリガーも模索されており、マイクロバブルのキャビテーションにより、膜の破壊があることが判明しました。
すべての報告されたプロトコルとは異なり、このプロトコルは、しばしば市場での臨床試験、広く利用可能で使用されている物質（ すなわち、脂質及びAuのNP）を選択します。容易にアクセス可能な材料の使用は、NEせず、誰もが自分でこのような光に敏感なシステムを準備することができます技術的な助けを求めるためにエド。また、このプロトコルは、両方の費用対効果の高い、簡単にスケーラブルである、リポソームを調製するために、薄膜水和を利用します。
このシンプルでありながら強力なプロトコルは、皮膚のような表面的な組織への制御された薬物送達を達成することに興味がある研究者や臨床医の利益になります。一つの潜在的なアプリケーションは、日焼け止めの中に、このシステムを組み込むことによって、日焼け止め剤を送達することであろう。
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Disclosures
利害の競合が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、部分的に教育のシンガポール省（CXへRG 12分の64）とナノメディシンのNTU-北西部研究所がティア1学術研究資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 850355P | Powder, Store at -20 °C |
| 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 855675P | Powder, Store at -20 °C |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000) | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 880120P | Powder, Store at -20 °C |
| Gold Nanoparticles | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH) |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM, pH 7.4 |
| Double distilled water | Millipore Milli-DI water purification system | ||
| Triton X100 | Sigma, Life Sciences | X-100 | To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation |
| Rotavapor | Buchi (Switzerland) | R 210 | Used for Lipososme preparation |
| Heating bath | Buchi (Switzerland) | B 491 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Controller | Buchi (Switzerland) | V-850 | Used for Lipososme preparation |
| Vacuum Pump | Buchi (Switzerland) | V-700 | Used for Lipososme preparation |
| Recirculation bath with temperature controller | Polyscience | Used for Lipososme preparation | |
| Mini-extruder assembly with heating block | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610000 | Used for extrusion of liposomes |
| Syringes, 1,000 μl | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610017 | Used for extrusion of liposomes |
| Polycarbonate filter membrane, 200 nm | Whatmann | 800281 | Used for extrusion of liposomes |
| Filter Support | Avanti Polar Lipids (Alabama, US) | 610014 | Used for extrusion of liposomes |
| PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium | GE Healthcare, Life sciences | 17-0851-01 | Used to purify the liposomes |
| Centrifuge | Sigma Laboratory Centrifuges | 3K30 | Used to concentrate the liposomal solution |
| Rotor | Sigma | 19777-H | Used to concentrate the liposomal solution |
| Zetasizer | Nano ZS Malvern | Used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| UV-Visible Spectrophotometer | Shimadzu | UV-2450 | Used to measure the absorbance of the samples |
| Fluorescent Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Used to measure the fluorescence emission of the samples |
| Nd:YAG Laser | NewWave Research | 532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation | |
| HNR Hydrophone | ONDA | HNR-1000 | 1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals |
| Digital Osciloscope | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals |
References
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