Summary
We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.
Abstract
Het glycoproteïne familie van collageen vormt de belangrijkste structurele eiwitten in het menselijk lichaam en zijn belangrijke componenten van biomaterialen gebruikt in de moderne tissue engineering. Een technische knelpunt de afzetting van collageen in vitro, aangezien het berucht traag, resulterend in suboptimale vorming van bindweefsel en daaropvolgende weefsel samenhang name huidmodellen. Hier beschrijven we een werkwijze die de toevoeging van verschillend formaat sucrose copolymeren huid kweken omvat macromoleculaire crowding (MMC), wat resulteert in een dramatische verbetering van collageenafzetting genereren. Bijzonder dermale fibroblasten afgezet een aanzienlijke hoeveelheid collageen I / IV / VII en fibronectine onder MMC in vergelijking met controles.
Het protocol beschrijft ook een werkwijze te druk cellagen decellularize aanzienlijke hoeveelheden extracellulaire matrix (ECM) die werden vastgehouden op het kweekoppervlak bloot blijkens immunocytochemistry. Total matrix massa en distributie patroon werd bestudeerd met behulp van interferentie reflectie microscopie. Interessant, fibroblasten, keratinocyten en co-kweken geproduceerde cellen afgeleide matrices (CDM) variërende samenstelling en morfologie. CDM kunnen worden gebruikt als "bio-scaffolds" voor secundaire cel enten, waarbij het huidige gebruik van coatings of steigers, meestal van xenogene dierlijke bronnen, kunnen worden vermeden, waardoor een bijsturing naar klinisch relevante toepassingen.
Daarnaast heeft dit protocol beschrijft de toepassing van MMC in de ondergedompelde fase van een 3D-organotypische skin co-kweekmodel dat voldoende ECM afzetting te verbeteren in de dermo-epidermale junctie (DEV), in het bijzonder was, collageen VII, de hoofdcomponent van ankerfibrillen. Elektronenmicroscopie bevestigde de aanwezigheid van ankerfibrillen in kweken ontwikkeld met MMC, in vergelijking met controles. Dit is belangrijk omdat ankerfibrillen tether de dermis op de epidermis, dusmet een voorgevormde mature DEJ kunnen profiteren huidtransplantatie ontvangers in termen van graft stabiliteit en de algemene wondgenezing. Bovendien werd cultuur tijd gecondenseerd uit 5 weken tot 3 weken de tijd om een volwassen construct te verkrijgen bij het gebruik van MMC, de kosten te verlagen.
Introduction
De huid vormt een beschermende barrière door te voorkomen dat water verlies en ziekteverwekker binnenkomst. Het bestaat uit drie hoofdbestanddelen; de stromale rijke dermis 1, een gelaagde epidermis 2,3,4 op de top van het, en de dermo-epidermale verbinding in tussen 5,6. De dermis bestaat grotendeels uit collageen en elastische vezels en is dun bevolkt met fibroblasten 7. Daarentegen wordt de cellenrijke epidermis bestaat uit meervoudige lagen van keratinocyten. De keratinocyten van de diepste laag zijn proliferatieve en nieuwe basale cellen die vernieuwen en vervangen terminaal differentiërende keratinocyten die constant naar de buitenste laag van de huid en hun kernen en cytoplasmatische materiaal verloren, waardoor een verhoornde laag die uitgebreid schilfering.
De dermale-epidermale junctie, een specifiek type basaalmembraan is een complexe structuur bestaande uit onderling verbonden matrix moleculen, die tethers de epidermis aan de dermis. Collageen I vezels van de lederhuid vervlochten met collageen VII ankerfibrillen die zijn verankerd aan het collageen IV rijke lamina densa. Verankering filamenten (laminine 5, collageen XVII en integrines) op zijn beurt sluit de lamina densa met hemidesmosomen van basale keratinocyten. Basale keratinocyten (Kiemlaag) hebben het vermogen om te prolifereren en te vernieuwen, en differentiëren en stratificeren de suprabasale lagen vormen; stratum spinosum, stratum granulosum, en tenslotte het stratum corneum, waarbij het contactoppervlak van de huid vormt met de omgeving. Op weg van de basale laag op de verhoornde laag keratinocyten overschakelen expressiepatronen van cytokeratines en uiteindelijk apoptose en omsluiten zich in verhoornde enveloppen, rompen van specifieke eiwitten die covalent verknoopt met transglutaminase activiteit.
Recreëren huid en de lagen in vitro, zoals de complexe structuren van de dermale-epidermale junctie en dermale extracellulaire matrix, en de verhoorningsproces proces na te bootsen, is al lang geïntrigeerd wetenschappers en bioengineers als een uitdagende taak. Er zijn aanzienlijke vooruitgang in huidweefsel techniek, bijvoorbeeld is de succesvolle extractie van huidcellen van patiënt biopsies en het genereren van huid organotypische kweken behulp patiënt afgeleide huidcellen 8. Echter, onopgeloste problemen blijven met betrekking tot slechte secretie van extracellulaire matrix eiwitten door de huidcellen zelf en resulteert in suboptimale huid modellen. Bovendien is de tijd die nodig is om 3D organotypische huid co-kweek met gebruikmaking van bestaande protocollen genereren varieert van vier tot acht weken, een tijdsbestek dat zou kunnen worden ingekort met de opname van macromoleculaire Crowders. Vermindering kweekduur bespaart reagenskosten, vermindert de incidentie van celsenescentie en vermindert de wachttijd van de patiënt moet het product worden gebruikt in de kliniek.
t "> macromoleculaire crowding (MMC) omvat houdende specifieke macromoleculen aan het kweekmedium uitgesloten volume-effecten. Deze hebben invloed enzymatische reactiesnelheden waaronder proteolytische splitsing van procollageen die traag onder standaard kweekomstandigheden waterige 9-13. Onder MMC, enzymatische reacties genereren worden bespoedigd zonder verhoging van de hoeveelheid reagentia 14,15 waardoor, bij procollageen splitsing, een verhoogde hoeveelheid collageen I-moleculen in drukke kweken vergeleken met de controles 10 rustig. als de omzetting van procollageen collageen maakt de vorming van collageen samenstellingen, fibroblasten gekweekt met MMC gedurende 48 uur leverde aanzienlijk meer collageen I in vergelijking met rustig fibroblast kweken gecontroleerd tot vier weken 11,16,17. Naast effecten op enzymatische activiteiten die de vorming, stabilisatie en hermodellering van ECM beïnvloeden, ook MMC aangetoond is rechtstreeks versterken en moduleren collageenvezelvorming 18,19.We stellen hier een werkwijze voor de productie extracellulaire matrix (ECM) van huidcellen, met name dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten verbeteren. Bovendien tonen wij dat de verrijkte ECM geproduceerd onder MMC in monolaag culturen worden ontceld en gebruikt als zuivere cel-afgeleide matrix (CDM).
We maken gebruik van een niet-conventionele benadering te visualiseren en de ECM afgezet door huidcellen gekweekt met MMC ten volle benutten. Interferentie reflectie microscopie wordt meestal gebruikt voor het bestuderen van cel-matrix interacties en cel-glas contactpunten. Deze techniek werd gebruikt in ons systeem de totale matrix afgezet op het glasoppervlak bekijken. Interferentie reflectie microscopie gekoppeld met fluorescerende immunokleuring om de hoeveelheid informatie te verkrijgen in termen van extracellulaire matrix samenstelling en patroon, in aanwezigheid en afwezigheid van MMC.
Organotypic skin co-culturen is een klassieke methode voor het huidmodel in vitro in een driedimensionale context. Terwijl twee-dimensionale co-culturen belangrijke informatie kan verschaffen, is beperkt bij het vertalen van deze informatie bevat welke naar een in vivo omgeving, die inherent een driedimensionale structuur. Huidkeratinocyten name zijn gepolariseerd en apicale en basale segmenten die essentieel is voor homeostase en celadhesie bevatten. Daarnaast is de expressie van eiwitten in typische suprabasale keratinocyten boven de basale laag, zoals keratine 1, keratine 10 en filaggrin is alleen aanwezig in de loop van stratificatie en differentiatie van keratinocyten. Zoals terminale differentiatie nauwelijks aanwezig in de typische monolaag culturen is, wordt suprabasale eiwitexpressie gewoonlijk niet gehaald in deze cultuur systeem. Daarom start organotypische culturen ondergedompeld in kweekmedium, maar worden dan opgeheven om een lucht-vloeistof interface naar keratinocyt rijdene differentiatie. Dit resulteert in de expressie van stratificatie markers, zelfs verhoorning en een algemeen beter weer epidermale fysiologie. Terwijl andere groepen die eerder met succes hebben gegenereerd organotypische huid co-culturen, heeft de invoering van een functionele dermo-epidermale verbinding zone een probleem geweest. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het kweken van huid organotypische co-culturen met een verbeterd basaal membraan, in een verkorte termijn en zonder afbreuk te doen aan de looptijd van deze constructen. Dit zou skin mimetica in vitro modellen, de studie van de huid biologie en een assortiment van screeningstesten verschaffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Macromoleculaire Verdringing in 2D Skin Cell Cultures
- Zaad 50.000 cellen (primaire fibroblasten of primaire keratinocyten of co-kweek van primaire fibroblasten en keratinocyten) per putje van een 24-wells plaat. Zaadcellen in 1 ml van het overeenkomstige celtype groeimedia.
- Sta cellen overnacht hechten, in een 37 ° C incubator bij 5% CO2.
- Gooi oude media en te vervangen door 1 ml vers medium bevattende macromoleculaire Crowders en 100 uM ascorbinezuur. Gebruik een crowder cocktail bestaande uit 37,5 mg / ml Ficoll 70 en 25 mg / ml Ficoll 400. Met fibroblast media (FM) bestaat uit DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine-antibiotica. Groeien keratinocyten in een serum-vrije media, KSFM of CNT-57. Onderhouden co-culturen in een mengsel van 50% en 50% FM serumvrij medium.
- Incubeer kweken gedurende 6 dagen in een 37 ° C incubator bij 5% CO2, met media veranderen elke 2 dagen.
2. Fluorescent Immunokleuring on Skin Cell Cultures
- Wassen celkweken tweemaal met 1 x PBS.
- Fix celkweken met ofwel methanol of paraformaldehyde (afhankelijk van het antilichaam specificaties).
- Voor Methanol Fixatie
- Aliquot 500 ul koude methanol in elk putje en incuberen bij -20 ° C gedurende 10 minuten. Zuig fixeermiddel en gooi methanol afval. De lucht drogen in een laminaire zuurkast.
- Voor Paraformaldehyde Fixatie
- Aliquot 500 pi 2% paraformaldehyde oplossing in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Zuig fixeermiddel en gooi paraformaldehyde afval.
- Was met 1x PBS, voor drie wassingen, 5 minuten per wasbeurt.
- Aliquot 1 ml 1x PBS in elk putje.
- Voor Methanol Fixatie
- Fluorescerende Immunokleuring gebruiken Antilichamen
- Aliquot 500 pi 3% bovine serum albumine (verdund in 1 x PBS) in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Zuig het blokkerende oplossing en gooi.
- Primary Antibody
- Voor beeldvorming direct uit plaatmateriaal: Aliquot 200 ui primaire antilichaam (1: 100 verdunning in 10% geit serum) oplossing in elk putje en incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
- Voor dekglaasjes: Aliquot 50 ul van primair antilichaam (1: 100 verdunning in 10% geit serum) oplossing op een plat stuk Parafilm. Plaats dekglaasje op de Parafilm, met de mobiele-side (een deel van dekglaasje met cellen) naar de oplossing. Bedek de hele cel-side, zonder bubbels. Incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig primaire antilichaam-oplossing en de teruggooi.
- Was met 1x PBS, voor drie wassingen, 5 minuten per wasbeurt.
- secundair antilichaam
- Voor beeldvorming direct uit plaatmateriaal: Aliquot 200 ul secundair antilichaam (1: 400 verdunning in 10% geit serum) oplossing in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, die de plaat met aluminium fo il.
- Voor dekglaasjes: Aliquot 50 ul van secundair antilichaam (1: 400 verdunning in 10% geit serum) oplossing op een vlak stuk van Parafilm. Plaats dekglaasje op de Parafilm, met de mobiele-side (een deel van dekglaasje met cellen) naar de oplossing. Bedek de hele cel-side, zonder bubbels. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, voor de Parafilm met aluminiumfolie.
- Zuig secundair antilichaam-oplossing en de teruggooi.
- Was met 1x PBS, voor drie wassingen, 5 minuten per wasbeurt. Aliquot 1 ml 1x PBS in elk putje.
- Montage
- Voor direct het afbeelden van de plaat: niet monteren. Ga verder met microscoop.
- Voor de beeldvorming van dekglaasjes: Mount dekglaasjes, bij het monteren van de media, op een glasplaatje. Droog 's nachts in een container afgedekt met aluminiumfolie. Ga verder met microscoop.
- Acquire Beelden Met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40X / 1.30 Oil Objective.
- Wassen cellagen tweemaal met 1 x PBS.
- Aliquot 100 ul lysis buffer (zie Materialen List) in elke well (6-well plaat formaat). Schraap de cellaag met een cel schraper en overdracht oplossing in een microcentrifugebuis.
- Centrifugeer oplossing bij 15.330 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande om een andere microcentrifugebuis en gooi de pellet.
- Meng 13 pl van elk monster met 5 gl monsterbuffer en 2 pl reductiemiddel (zie Materialen List). Warmte monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
- Centrifuge monsters bij 15.330 xg gedurende 1 minuut om condensatie water op te vangen. Laad monsters in een prefab PAGE gel en uitgevoerd bij 100 V gedurende ongeveer 1 uur.
- Om gescheiden eiwitten overbrengen naar een nitrocellulosemembraan, sandwich en de gel membraan tussen stukken papier en sponzen (van dezelfde grootte). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de gel, membraan, papers en sponss. Sluit de sandwich cassette en laat de overdracht op 70 V gedurende 2 uur.
- Om te controleren of de overdracht volledig was, incubeer het membraan met 10 ml Ponceau S. Was membraan met 0,1% PBS-Tween-20, drie keer, 10 min per wasbeurt.
- Blok met 10 ml 5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was membraan met 0,1% PBS-Tween-20, drie maal, 10 min per wasbeurt.
- Incuberen met 10 ml primair antilichaam gedurende 90 min (muis anti-collageen VII, LH 7,2, 1: 1000 verdund in 5% melk). Was membraan met 0,1% PBS-Tween-20, drie maal, 10 min per wasbeurt.
- Incuberen met 10 ml secundair antilichaam gedurende 30 min (geit anti-muis-HRP, 1: 2000 verdund in 5% melk). Was membraan met 0,1% PBS-Tween-20, drie maal, 10 min per wasbeurt.
- Het membraanfilter een cassette en voeg 1 ml ECL detectiereagens. Leg een heldere, dunne plastic laken over het membraan.
- Om chemiluminescentie detectie, plaats een lichtgevoelige film via kunststofvel en sluit de cassette. na 2-5 Min, verwijdert u de film uit de cassette en plaats deze in een ontwikkelaar.
4. Het maken en gebruiken van een cel afkomstige Matrix
- Zaad 50.000 cellen (primaire fibroblasten of primaire keratinocyten of co-kweek van primaire fibroblasten en keratinocyten) per putje van een 24-wells plaat.
- Sta cellen overnacht hechten, in een 37 ° C incubator bij 5% CO2.
- Gooi oude media en te vervangen door verse media met macromoleculaire Crowders en 100 uM ascorbinezuur. De crowder cocktail bestaat uit 37,5 mg / ml Ficoll 70 en 25 mg / ml Ficoll 400. fibroblast media (FM) bestaat uit DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% pen-strep. Keratinocyten worden gekweekt in een serumvrij medium, KSFM of CnT-57. Onderhouden co-culturen in een mengsel van 50% en 50% FM KSFM of CnT-57.
- Incubeer kweken gedurende 6 dagen in een 37 ° C incubator bij 5% CO2, veranderende informatie elke 2 dagen.
- Decellularize cel lagen om een cel afkomstige Matri verkrijgenx (f-mat =-fibroblast afgeleide matrix, k-mat =-keratinocyten afgeleide matrix, co-mat = matrix afgeleid van een co-cultuur van fibroblasten en keratinocyten).
- Wassen cellagen tweemaal in 1x PBS.
- Voeg 250 ul van 0,5% natriumdeoxycholaat. Incubeer op ijs gedurende 10 min. Zuig cellysaat.
- Herhaal stap 4.5.2 driemaal.
- Wash cel-afgeleide matrix tweemaal in gedestilleerd H2O Houd cel afkomstige matrix in 1x PBS. Matrices kunnen worden bewaard tot 1 week bij 4 ° C.
- Bereid Secundaire Cell Suspension (Bijvoorbeeld, Seeding keratinocyten op de top van f-mat).
- Zuig 1x PBS.
- Zaad 50.000 keratinocyten bovenop de cel afkomstige matrix (f-mat). Sta cellen overnacht hechten, in een 37 ° C incubator bij 5% CO2.
Opmerking: Testen kan direct worden uitgevoerd op hechtende cellen.
5. Analyse van de Cel-afgeleide Matrix
- Fluorescent immunokleuring: Zie Protocol 2.
- Interferentie Reflection Microscopie
- Zaad cellen op dekglaasjes, volgende Protocol 4,1-4,5.
- Na het behalen van de cel afkomstige matrix, fix samples volgende Protocol 2.2.
Opmerking: Antilichaam kleuring is optioneel. Indien nodig verwijzen naar Protocol 2.3. - Voer beeldacquisitie met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een olie objectief 40X / 1.30. Stel pengat bij 74 mm.
- Gebruik LP 505 voor de storing reflectie microscopie (IRM) kanaal en BP 575-615 IR voor de fluorescentie rode kanaal voor filters. Gebruik NT 80/20 voor de IRM kanaal en HFT 405/488/561, NFT 565, platen voor de fluorescentie rode kanaal voor de bundel splitters. Gebruik de volgende lasers: DPSS 561-10 (golflengte 561 nm) op 1,1% vermogen voor de fluorescentie rode kanaal en HeNe633 (golflengte 633 nm) bij 5,0% vermogen voor de IRM kanaal.
6. 3D organotypische Skin Co-cultuur
- Wierp een collageengel met fibroblasten ingekapseld, in een celcultuur Insert (6-well plaat formaat).
- Aliquot 10 ml rattenstaart collageen type I een koud beker.
- Voeg 1 ml koude DMEM. Voeg 0,5 ml van 1 M NaOH aan de zure collageen neutraliseren. Voeg 0,5 ml fibroblast suspensie (met 1.200.000 fibroblasten).
- Breng de oplossing in een koude pipet, de celcultuur inserts in een 6-wells plaat. 12 ml van de totale oplossing wordt gelijkmatig verdeeld in 6 celcultuur inserts.
- Incubeer de gel in een 37 ° C incubator bij 5% CO2, gedurende 1 uur.
- Nadat de gel is gestold, dompel de gel in FM. Na 24 uur, gooi de oude media en te vervangen door verse media, met macromoleculaire Crowders. Voeg een volume van 2 ml op het inwendige van de cel-kweek insert en 2 ml aan de buitenkant van de cel-kweekinsert.
- Na 24 uur,Zaad keratinocyten bovenop de collageengel.
- Trypsinize keratinocyten middels 0,125% trypsine / chelerend middel voor 5 min bij 37 ° C. Tik zijden van kolf voorzichtig om cellen los te maken en te neutraliseren trypsine met serum bevattende media. Tellen cellen en voor te bereiden keratinocyten suspensie (300.000 keratinocyten per gel en gesuspendeerd in 200 ul media).
- Zuig oude media uit celcultuur insert. keratinocyten voegen bovenop de gel.
- Incubeer de gel in een 37 ° C incubator bij 5% CO2, gedurende 1 uur.
- Na keratinocyten om de gel oppervlak hebben gehecht, onderdompelen gel met 2 ml KSFM of CnT-57 aan de binnenkant van de cel-kweek insert en 2 ml van FM naar de buitenkant van de cel-kweekinsert.
- Na 24 uur, gooi de oude media en te vervangen door verse media, met macromoleculaire Crowders.
- Na 7 dagen ondergedompeld cultuur, verhoging van de cultuur tot een lucht-vloeistof interface.
- Breng de celcultuur insERT een deep-well plaat. Voeg 10 ml stratificatie media om de buitenkant van de cel-kweekinsert. Houd het inwendige van de cel-kweekinsertie droog.
- Incubeer kweken in een 37 ° C incubator bij 5% CO2 en media veranderen elke 3 dagen voor de volgende 14 dagen.
NB: Na 2 weken in de lucht-vloeistof-interface, de huid gelijk is volwassen en kan worden geoogst (ofwel snel bevroren of formaline gefixeerde).
7. Harvest en karakterisering van organotypische Skin equivalenten
- Zuig stratificatie media.
- Met behulp van een pincet, overdracht van de cultuur voegt op een papieren handdoek en dep weg overgebleven afdrukmateriaal uit de basis van het inzetstuk.
- Met behulp van een scalpel gesneden langs de binnenomtrek van de kweekinsert.
- Bevestig de huid organotypische co-kweek (tezamen met de PET-membraan).
- Snap Freeze
- Breng de gel construct een cryomold. Bedek de binnenkant van de cryomold met oktoberverbinding. Plaats de cryomold in vloeibare stikstof gedurende 10 sec.
- Met behulp van een pincet, verwijder de bevroren cryomold uit de vloeibare stikstof, wikkel in aluminiumfolie en de bevroren monsters op te slaan in een -80 ° C vriezer.
- Sectie bevroren monsters met een cryostaat, met een sectie dikte van 7 urn.
- formalinefixatie
- Plaats een 'biopsie spons' in de 'biopsie cassette'. Breng de gel te bouwen op de spons pad. Plaats een andere spons zachtjes op de top van de gel construct. Sluit de cassette.
- Volledig onderdompelen cassette in 10% neutraal gebufferde formaline voor 48 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de cassette en gooi formaline afval.
- Integreer de vaste monster in een wax blok door eerst dehydrateren met een ethanol-serie en vervolgens geleidelijk infiltreren van het monster met wax. Section de wax blok met een microtoom.
- Snap Freeze
- Karakterisering van de Skin Equivalent
- immunokleuring
- Voor bevroren secties:
- Incubeer secties in 10% geit serum (verdund in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties in 1x PBS om de geit serum te verwijderen.
- Incubeer secties met primaire antilichaam (1: 100 verdunning in 10% geit serum) gedurende 90 min bij kamertemperatuur. Was secties in 1x PBS, drie keer, 5 minuten per wasbeurt.
- Incubeer secties met secundair antilichaam (1: 400 verdunning in 10% geit serum) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een container bedekt met aluminiumfolie. Was secties in 1x PBS, drie keer, 5 minuten per wasbeurt.
- Mount dia's, met het opzetten van de media, op een dekglaasje. Cover monsters met aluminiumfolie en laat een nacht drogen.
- Beeld met behulp van een confocale microscoop met een olie objectief 40X / 1.30.
- Voor formaline gefixeerde in paraffine ingebedde secties:
- Dewax secties (en hydrateren) in dalende percentages ethanol aan water (Xyleen - 100% ethanol- 90% ethanol - 80% ethanol - 70% ethanol - water). Volledig onderdompelen monsters in oplossing. Elke ontparaffineringsstap moet 3 min.
- Incubeer secties in 1% waterstofperoxide gedurende 30 minuten. Was secties in 1x PBS gedurende 5 minuten.
- Incubeer secties citraatoplossing (10 ml citraatoplossing wordt opgelost in 90 ml water) bij 120 ° C gedurende 20 min. Sta slides overnacht afkoelen bij kamertemperatuur. Was secties in 1x PBS, drie keer, 5 minuten per wasbeurt.
- Incubeer secties in 10% geit serum (verdund in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was de secties in 1x PBS om de geit serum te verwijderen.
- Incubeer secties met primaire antilichaam (1: 100 verdunning in 10% geit serum) gedurende 90 min bij kamertemperatuur. Was secties in 1x PBS, drie keer, 10 min per wasbeurt.
- Incubeer secties met HRP-gelabelde polymeer (onverdund) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Was secties met 1x PBS, drie keer, 10 min per wasbeurt.
- Een microcentrifugebuis, combineren 1 mlDAB Substrate (3,3'-diaminobenzidine) met 1 druppel chromogeen. Incubeer de secties met deze oplossing voor 15 sec - 5 min (bruine kleur = positief signaal).
- Om de reactie te stoppen, was de secties in stromend water.
- Tegenkleuring kernen met hematoxyline gedurende 5 min. Spoel secties in stromend water.
- Incubeer secties in zure alcoholoplossing, gedurende 1 min. Spoel secties in stromend water.
- Incubeer secties in Scott's leidingwater oplossing, gedurende 2 minuten. Spoel secties in stromend water.
- Optioneel: Incubeer secties in eosine gedurende 1 minuut en wassen in stromend water.
- Uitdrogen secties oplopend percentages ethanol xyleen (70% ethanol - 80% ethanol - 90% ethanol - 100% ethanol - xyleen). Zorg ervoor dat de monsters volledig ondergedompeld gedurende 3 minuten per fase.
- Mount dia's, met behulp van montage media, een dekglaasje. De lucht drogen 's nachts.
- Beeld met behulp van een confocale microscoop met een olie objectief 40X / 1.30.
- Voor bevroren secties:
- Transmission Electron Microscopy (Om ankerfibrillen visualiseren)
- Fix monsters in 2,5% glutaaraldehyde gedurende 72 uur.
- Spoelmonsters in 1x PBS, driemaal, 10 min per wasbeurt.
- In kleine stukjes gesneden (1 mm 3). Post-fix monsters in 1% osmiumtetroxide, pH 7,4, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Spoelmonsters in gedestilleerd water.
Let op: osmiumtetroxide is giftig en giftig en moet zorgvuldig worden behandeld in een zuurkast. - Uitdrogen monsters via een oplopende ethanolreeks (25% ethanol - 50% ethanol - 75% ethanol - 95% ethanol - 100% ethanol - aceton) gedurende 20 min per stap.
- Infiltreren door het weken monsters in 100% aceton: Araldite hars (1: 1) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en vervolgens 1: 3 tot 1 uur, gevolgd door 1: 6 overnight. Weken monster in vers Araldite hars 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, gevolgd door een tweede wijziging van vers Araldite hars gedurende 1 uur bij 40 ° C. Laat het derde vers van eenraldite hars verandering voor 1 uur bij 45 ° C en verlaat de vierde verse hars Araldite verandering voor 1 uur bij 50 ° C.
- Incubeer monsters bij 60 ° C gedurende 24 uur om polymerisatie mogelijk.
- Sectiemonsters met een glazen mes, semi-dunne secties te verkrijgen met een dikte van 1 pm. Vlek sectie met methyleenblauw om histologie observeren. Sectie van het monster aan ultra-dunne lagen van 70 nm te verkrijgen en het verzamelen van elke sectie op een koperen rooster.
- Stain secties met 5% uranyl acetaat oplossing 15 min gevolgd door 3% loodcitraat gedurende 10 min.
- Acquire beelden met een transmissie elektronenmicroscoop (100 kV), bij een vergroting van 30,000X.
- immunokleuring
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Macromoleculaire crowding kunnen ECM afzetting verbeteren, in het bijzonder was, fibroblasten gedeponeerd meer collageen I, IV en fibronectine in vergelijking met controle kweken (figuur 1, cellaag, 1A, collageen I; 1B, collageen IV, 1C, fibronectine). Na decellularisatie, was het duidelijk dat fibroblasten waren de belangrijkste inleggers van collageen I, IV en fibronectine in vergelijking met keratinocyten (figuur 1, Matrix).
In figuur 2, werd waargenomen dat fibroblasten plaats keratinocyten waren de voornaamste producenten van collageen VII. Dit is het eerste verslag van collageen VII succes afgezet in vitro (Benny et al, 2015).
De cellen afgeleide matrix werd gekarakteriseerd door middel van immunofluorescentie met specifieke Antibodies. Hoewel dit een klassieke benadering was het belangrijk om de ECM in zijn totaliteit visualiseren en het effect van de macromoleculaire Crowders waarderen. Gebruik interferentie reflectie microscopie (IRM), de volledige omvang van de matrix werd gevangen (figuur 3). Een bekleding van het antilichaam kleuring beeld met IRM toont de relatieve hoeveelheid die ECM component in verhouding tot de totale hoeveelheid ECM.
In een 3D in vitro huidmodel, MMC gecondenseerd de kweekperiode van 5 weken tot 3 weken om een volwassen huid organotypische co-kweek (figuur 4) te verkrijgen. Een hematoxyline en eosine kleuring toonde aan dat bij 3 weken, de cultuur macromoleculaire Crowders bestond uit een plurinationale gestratificeerde epidermis en stromale rijke dermis in vergelijking met controleculturen rustig, dat een volledig gedifferentieerde epidermis ontbrak. Bovendien werd intense en continue collageen VII immunokleuring gedetecteerd dermal-epidermale junctie overvolle celculturen, in vergelijking met een zwak en vlekkerige collageen VII immunokleuring in controleculturen. Transmissie elektronen microscopie (figuur 5) toonde de aanwezigheid van ankerfibrillen in organotypische kweken, toont functioneel collageen VII.
Figuur 1: Mixed macromoleculaire crowding (MMMC) verbetert de afzetting van de huid-epidermale verbinding componenten in vitro (A) Collageen I afzetting wordt versterkt door MMMC (cellaag en matrix) alleen in fi fibroblasten.. Verdringing van co-culturen te produceren de meest collageen I en laten zien dat keratinocyten gestimuleerd collageen I-productie door fi fibroblasten. (B) Collageen IV afzetting door fi fibroblasten wordt versterkt door verdringing. Dit is nog duidelijker te zien in drukke co-culturen. Van de nota, keratinocytes gekleurd voor collageen IV tonen meestal cel-geassocieerde of intracellulaire collageen IV, maar niet een pericellulaire matrix. In co-culturen, beide celtypen scheiden met collageen IV wordt voornamelijk geassocieerd met fi fibroblasten spaarde keratinocyten eilanden. (C) fibronectine afzetting werd alleen gezien met fi fibroblasten, en daarin sterk verbeterd door verdringing (cellaag en matrix). In co-culturen, een reticulair maaswijdte van fi bronectin werd in verband gebracht met slechts fi fibroblasten, spaarde eilanden keratinocyten. Schaalbalken = 20 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Benny et al., 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mixed macromoleculaire crowding (MMMC) vergemakkelijkt de afzetting vanverankering fi bril gebouw collageen VII. (A) Een reticulaire afzetting patroon van collageen VII depositie is duidelijk met fi fibroblasten alleen onder MMMC. In co-culturen, is extracellulaire collageen VII sterk geassocieerd met fi broblast kolonies in tussen keratinocyten eilanden. Keratinocyten vertonen pericellulaire en intracellulaire collageen VII sterker tot expressie gebracht in aanwezigheid van MMMC. Na cellysis, zijn collageen VII voetafdrukken gezien in een fi jne granulaire laag in MMMC-behandelde fi broblast culturen, maar een waarneembare fi brillar afzetting wordt opgehaald uit co-culturen. (B) Immunoblotanalyse van gelyseerde cel lagen blijkt dat zowel drukke fi fibroblasten en keratinocyten culturen bevatten significant meer collageen VII vergelijking met dunbevolkt controles. De teruggewonnen collageen VII hoofdzakelijk pericellulaire afgeleid. (C) Densitometrische analyse van B toont dat MMMC verhoogt de hoeveelheid cel-geassocieerded collageen VII met een factor 8 in fi fibroblasten en een factor 2 in keratinocyten. Schaalbalken = 20 urn. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Benny et al., 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: fibroblast voetafdrukken bevatten meer totale ECM zoals gevisualiseerd door interferentie reflectie microscopie (IRM) op de analyse van afzonderlijke ECM componenten (collageen IV en fi bronectin), cultuur onder MMMC verhoogde de extracellulaire afzetting.. Om de totale ECM afgezette visualiseren, werd IRM gebruikt om alle ECM kwantificeren antilichaam kleuring zijn beperkingen had. IRM bleek duidelijk de totale matrix hoeveelheid en het patroon onder MMMC in vergelijking met controle-omstandigheden. Schaal bar = 20 micrometer. Dit cijfer isgewijzigd ten opzichte van Benny et al., 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Mixed macromoleculaire crowding (MMMC) tijdens de verzonken fase verbetert rijping van de dermale-epidermale verbinding (DEV) in de huid equivalenten fibroblast-bevattende collageen gels werden geënt met keratinocyten op de top en hield onder water gedurende 1 week, daarna opgeheven om een air-vloeistof interface. In het klassieke protocol, collageen VII (groen) afwezig na een totaal van 3 weken in kweek, maar wel in huidequivalenten na 5 weken. In tegenstelling, onder MMMC, collageen VII was al sterk evident na 3 weken en nog sterker gekleurd na 5 weken in vergelijking met standaard culturen. Hematoxyline en eosine (20x vergroting) kleuring cop heeft bevestigd dat met deze snelle protocol, strati fi catie en de looptijd van de huid gelijkwaardige werden onderhouden en versneld. Schaal bar = 100 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Benny et al., 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Bewijs van de novo vorming van verankering fi Brils in huidequivalenten die onder MMMC Ultrastructurele studies van de opkomende dermale-epidermale grensvlak van organotypische co-kweken na 3 weken cultuurprotocol met MMMC (A, B) stelt structuren verwant verankering fi Brils (pijlen) die afwezig is in niet-druk huidequivalenten (C) na 3 weken kweken zijn. Dit cijfer is gewijzigd frOM Benny et al., 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
