Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Published: January 14, 2016 doi: 10.3791/53647
Automatic Translation
1
1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

Abstract

deacetylases هيستون 1 و 2 (HDAC1،2) تعريب لمواقع تكرار الحمض النووي. في الدراسة السابقة، وذلك باستخدام مثبطات انتقائية ونظام ضربة قاضية الجيني، أظهرنا وظائف جديدة لHDAC1،2 في النسخ المتماثل شوكة التقدم والاستقرار لونين الوليدة في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب الذي يجمع بين لونين مناعي (رقاقة) من برومو-deoxyuridine (BrdU) DNA -labeled مع فتحة لطخة والتحليلات الغربية لقياس كميا البروتينات أو تعديل هيستون المرتبطة الحمض النووي الناشئ.

بنشاط تم علاج الخلايا المنقسمة مع HDAC1،2 مثبط انتقائي أو مع transfected الرناوات siRNAs ضد Hdac1 وHDAC2 ثم وصفت DNA تصنيعه حديثا مع bromodeoxyuridine التيميدين التناظرية (BrdU). وقد تم وضع العلامات BrdU في نقطة زمنية عندما لم يكن هناك دورة الخلية القبض كبير أو موت الخلايا المبرمج بسبب فقدان الوظائف HDAC1،2. التالي لتم تنفيذ abeling من الخلايا مع BrdU، مناعي لونين (رقاقة) من علامات أستلة هيستون أو لونين-remodeler مع الاجسام المضادة المحددة. ثم رصدت المسمى BrdU DNA المدخلات وimmunoprecipitated (أو ChIPed) DNA على غشاء باستخدام تقنية فتحة وصمة عار وثبتوا باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. ثم تم تقييم كمية الحمض النووي الناشئ في كل فتحة كميا باستخدام التحليل الغربي مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. ثم تم تحديد تأثير فقدان الوظائف HDAC1،2 على مستويات تصنيعه حديثا هيستون علامات أستلة المرتبطة الحمض النووي والكروماتين remodeler عن طريق تطبيع إشارة BrdU رقاقة تم الحصول عليها من العينات المعالجة إلى عينات السيطرة.

Introduction

إصلاح الحمض النووي عيب و / أو تكرار الحمض النووي هي السبب الرئيسي لعدم الاستقرار الجينوم، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا. وحيد دون اصلاح كسر حبلا مزدوج يكفي ليسبب موت الخلايا 1. يتم تبديل المنظمة لونين عابر خلال كل تكرار وإصلاح 2،3، والفشل في الحفاظ على المعلومات جينية خلال هذه العمليات سوف يؤدي إلى تهديد للسلامة الجينوم. فقدان HDAC3 أو وظيفة HDAC1،2 يعوق التقدم S-المرحلة، والنسخ وإصلاح الحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد السمية (تلف DNA) وموت الخلايا 4-9. وبالتالي فإنه من استراتيجية عملية لاستخدام مثبطات انتقائية HDAC لتعطيل النسخ المتماثل إصلاح والكروماتين في الخلايا السرطانية وتسبب التلف في الحمض النووي، والتي بدورها يمكن أن يوقف النمو ولحث على موت الخلايا بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية سريعة النمو.

خلال تكرار الحمض النووي، وتفكيكها لونين بسرعة ومن ثم تجميعها بعد تكرار الحمض النووي. سي حديثاوالأسيتيل nthesized هيستون H4 في K5 والمخلفات K12 (H4K5K12ac) وترسب التالية على لونين، وdeacetylated أنها بسرعة عن طريق deacetylases هيستون (HDACs) 10،11. يمكن فشل الخلايا للحفاظ على لونين سلامة الوليدة التي كتبها هيستون deacetylation يؤدي إلى انهيار شوكة، وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا. أظهرنا مؤخرا أن تثبيط انتقائي من HDAC1،2 يزيد هيستون أستلة (H4K5ac، H4K12ac وH4K16ac) ويمنع SMARCA5 النشاط لونين remodeler على لونين الناشئ، الذي يرتبط مع انخفاض تطور تكرار مفترق الطرق، وزيادة انهيار شوكة وزيادة تكرار التوتر الناجم عن الحمض النووي من التلف 6 . وبالتالي، يمكن HDAC العلاج المانع يغير هيكل لونين الناشئ لتحريك الحمض النووي من التلف والموت بسرعة كبيرة في خلايا السرطان، حيث أن هذه الخلايا دورة بسرعة وتمرير عدة مرات خلال المرحلة S. ولذلك فمن المهم أن نفهم كيف تعمل HDACs لتنظيم أستلة هيستون والبروتين بيندينانوغرام للحفاظ على تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات.

لقياس كمي لمقدار أستلة هيستون وSMARCA5 remodeler ونين المرتبطة الحمض النووي الناشئ خلال تكرار الحمض النووي، ونحن وضعت دعا مقايسة الشذرة تعديل أسلوب BrdU رقاقة فتحة للغرب. بعد مناعي لونين (رقاقة) من المطلوب البروتين أو هيستون تعديل، وكمية من الحمض النووي الناشئ (المسمى باستخدام التناظرية ثيميدين، BrdU) في العينة رقاقة يمكن الكشف عنها باستخدام التحليل الغربي من المسمى BrdU الشذرة DNA نقل على غشاء باستخدام فتحة جهاز لطخة. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن H4K16ac (علامة تشارك في التعبئة والتغليف لونين) وأفراد الأسرة ISWI SMARCA5 (المتعلقة SNF-SWI / المصاحب المصفوفة التي تعتمد على الأكتين منظم من لونين) remodeler ونين ترتبط مع الحمض النووي الناشئ في خلايا S-المرحلة 6. وجدنا أيضا أن العلامة H4K16ac الوليدة وdeacetylated التي كتبها HDAC1،2 خلال تكرار الحمض النووي (6). يمنع H4K16acالنشاط remodeler لونين من أفراد الأسرة ISWI SMARCA5 12. وبالتالي، وذلك باستخدام تقنية BrdU-CHIP فتحة للغرب، فإننا لا يمكن ربط وظائف لHDAC1،2 في تنظيم الكروماتين إعادة عرض خلال تكرار الحمض النووي. وبالتالي، فإن تقنية BrdU رقاقة فتحة للغرب وصمة عار هو طريقة فعالة لقياس كمي لتكوين الجمعيات والتفكك ديناميات البروتينات أو تعديلات في مرحلة ما بعد متعدية التي لا بد أن الحمض النووي الناشئ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. لونين مناعي (رقاقة) بعد BrdU وصفها

  1. ثقافة الخلايا NIH3T3 في وجود إما DMSO أو مثبطات HDAC1،2 انتقائية كما هو موضح سابقا 6.
  2. بعد العلاج مع DMSO أو مثبطات انتقائية HDAC1،2، إضافة BrdU إلى الخلايا في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة. احتضان 2 × 10 6 NIH3T3 خلايا مطلي في 10 مل سائل الإعلام NIH3T3 مع 20 ميكرومتر تركيز النهائي من bromodeoxyuridine (BrdU) لمدة 60 دقيقة في العقيمة 37 ° C زراعة الأنسجة الحاضنة.
  3. تشعبي البروتينات داخل الخلايا لDNA عن طريق إضافة الفورمالدهيد مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة بتركيز نهائي من 1٪. احتضان 2 × 10 6 خلايا NIH3T3 مع الفورمالديهايد في RT لمدة 10 دقيقة على شاكر.
  4. إخماد عبر ربط بإضافة الجلايسين إلى التركيز النهائي من 125 ملم. في احتضان RT لمدة 5 دقائق على شاكر.
  5. إزالة وسائل الإعلام وجمع الخلايا في برنامج تلفزيوني في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور سلليرة سورية في 956 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. غسل بيليه الخلية مرتين مع PBS الجليد الباردة. إزالة PBS من الأنبوب. تخزين بيليه الخلية عبر ربط دون PBS (طاف) في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. إعداد المحللة من بيليه الخلية crosslinked بإضافة 500 ميكرولتر العازلة FA140 (50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل.
  7. القص لونين من قبل sonicating عينات خمس مرات في السلطة 35٪ مع وجود نبض 15 ثانية، 0.9 ثانية على والإعداد 0.1 ثانية قبالة. إبقاء الأنابيب على الجليد بعد كل جولة من صوتنة لتجنب تسخين العينات.
    1. تحقق من القص على هلام DNA كما كفاءة القص تتنوع بين sonicators مختلفة. للتحقق صوتنة، عكس تشعبي عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتنفيذ الخطوات 1.17.1. - 1.22. تشغيل مزال 10 DNA ميكرولتر على 1.5٪ هلام الاغاروز للتحقق ما إذا كان القص هوبين 300-700 سنة مضت بمتوسط ​​كثافة في 500 سنة مضت.
  8. وبعد صوتنة، وعينات من أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 17949 x ج في 4 درجات مئوية، وطاف لنقل أنبوب جديد.
    1. أداء تقدير البروتين باستخدام عدة فحص البروتين التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. استخدام كمية مساوية من المحللة للرقاقة الرقابة والعينات التجريبية. عموما، استخدم 1 ملغ من المحللة الكلي في رد الفعل الشذرة.
  9. تجهيز 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز باستخدام العازلة FA140 تحتوي على مثبط البروتياز كوكتيل. إضافة 10/01 حجم كوكتيل مثبط البروتياز. حساب حجم حبات اللازمة استنادا إلى عدد من العينات في المجموع.
    1. غسل البروتين الخرز A-الاغاروز مع العازلة FA140 مرتين لإزالة العازلة التخزين وإضافة حجم مساو لعازلة FA140 إلى حبات لجعل 50٪ الطين.
    2. لإزالة البروتينات التي تربط غير تحديدا إلى الخرز، وإضافة 50 ميكرولتر من 50٪ من البروتين الطين A-الاغاروز وcubate العينات عند 4 درجات مئوية مع ثابت نهاية الإفراط في نهاية التناوب في خلاط المشواة لمدة 30 دقيقة.
  10. تدور العينات في 956 x ج في 4 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. جمع طاف وأداء مناعي عن طريق إضافة 8 ميكرولتر H4K16ac الأجسام المضادة أو 5 ميكرولتر (5 ميكروغرام) من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة SMARCA5 لطاف. احتضان عند 4 درجات CO / N مع ثابت التناوب نهاية الإفراط في نهاية في خلاط المشواة.
  11. حفظ 1/10 للاستخراج من أجل السيطرة "الإدخال" وتعيينه جانبا في -20 ° C. المدخلات يجب أن يكون العكس يرتبط العابرة جنبا إلى جنب مع عينات IP.
  12. استخدام كمية مساوية من أرنب مفتش (5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل) على أنها سلبية العينة الضابطة مناعي.
  13. في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ بروتين-A الاغاروز الطين لاستخراج واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع دوران.
  14. بيليه الخرز agarose بواسطة الطرد المركزي في 956 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية وطاف واSH حبات مع المخازن المؤقتة التالية بالتتابع. في الاستعدادات العازلة، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني الحق قبل الاستخدام.
    1. يغسل مع منخفضة الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA140؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 140 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
    2. يغسل عالية من الملح المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (FA500؛ تركيز النهائي من 50 ملم من HEPES KOH درجة الحموضة 7.5، 500 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم من EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 1٪ تريتون-X-100 و 0.1٪ deoxycholate الصوديوم) ل 5 دقائق عند 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
    3. يغسل LiCl المناعي مجمع الاحتياطي اغسل (تركيز النهائي من 10 ملم من تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 250 ملي من LiCl، و 0.5٪ و 0.5٪ NP40 deoxycholate الصوديوم) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب.
  15. وبعد يغسل كما هو موضح أعلاه، إضافة 200 حل شطف ميكرولتر (تركيز النهائي من 1٪ SDS وبيكربونات الصوديوم 100 ملم) وincubatه في RT لمدة 15 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية تناوب على RT.
  16. تدور العينات في 956 x ج في RT ونقل شطافة لأنبوب جديد 1.5 مل. كرر الخطوة 1.15 مع إضافي الحل شطف 200 ميكرولتر.
  17. 400 ميكرولتر من شطافة، إضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M وتخلط جيدا.
    1. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 400 ميكرولتر حل شطف إلى 10 ميكرولتر المدخلات التي تم تعيينها جانبا (الخطوة 1.11) وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز 0.16 M لعكس عينات المدخلات تشعبي كذلك. عكس تشعبي العينات التي يحتضنها في 65 ° C حمام الماء لمدة 5 ساعة.
  18. إضافة 1 مل من 100٪ ETOH إلى شطافة crosslinked للعكس. تخلط جيدا واحتضان عند -80 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة أو في -20 درجة CO / N. تدور العينات في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل الايثانول.
  19. إضافة 800 ميكرولتر 70٪ من الإيثانول لغسل بيليه. تدور في 17949 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل الايثانول. تدور لفترة وجيزة لإزالة أي الإيثانول المتبقية. الهواء الجاف العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الإيثانول المتبقية.
  20. حل الحمض النووي في 90 ميكرولتر ريبونوكلياز والدناز المياه المجانية وإضافة 2 ميكرولتر 10 ملغ / مل ريبونوكلياز في 0.2 ملغ / مل تركيز النهائي. احتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
  21. إضافة 10 ميكرولتر 10X بروتين K العازلة (100 ملي تريس، الكلور ودرجة الحموضة 8.0، 50 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 5٪ SDS). تخلط جيدا وإضافة 1 ميكرولتر بروتين K. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  22. تنقية المدخلات ورقاقة الحمض النووي باستخدام PCR تجارية عدة تنقية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة وأزل الحمض النووي في 50 ميكرولتر المياه. متجر DNA في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

2. فتحة تحليل لطخة من رقاقة الحمض النووي

  1. قياس العائد من المدخلات ورقاقة الحمض النووي مزال في 50 ميكرولتر المياه كما هو موضح في الخطوة 1.22 باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 280 نانومتر وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  2. أخذ كميات متساوية (50 ميكرولتر) من المدخلات أو DNA immunoprecipitated التي هي ضمن مجموعة خطية من الكشف.
    1. على سبيل المثال، إذا كان الإدخالالعائد DNA هو 1.5 نانوغرام / ميكرولتر، ثم تأخذ 30 ميكرولتر (أو 45 نانوغرام DNA الكلي) وجعل حجم 50 ميكرولتر بالماء. للعامل رقاقة، واتخاذ كامل شطافة 50 ميكرولتر من الخطوة 2.1 وانتقل إلى الخطوة 2.3.
  3. تفسد 50 ميكرولتر المدخلات أو DNA immunoprecipitated بإضافة 2.5 حجم 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي ل956 x ج لمدة 10 ثانية، واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  4. تحييد الحمض النووي التشويه والتحريف عن طريق إضافة 175 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، دوامة، الطرد المركزي لمدة 956 x ج لمدة 10 ثانية، ووضع العينات في الثلج.
  5. إعداد التخفيف المتسلسل من المدخلات وDNA immunoprecipitated للفتحة وصمة عار الفحص كما هو موضح أدناه.
    1. اتبع الخطوات 2،3-2،4 للحصول على حجم العينة الكلي 350 ميكرولتر (أي 50 ميكرولتر الإدخال / رقاقة الحمض النووي، 125 ميكرولتر 0.4 N هيدروكسيد الصوديوم، 175 ميكرولتر 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8).
      ملاحظة: للحصول على سبيل المثال ذكر أعلاه، فإن 45 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات في نهاية الأمر 0،129 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. لDNA المدخلات، وتسمية ثلاثة أنبوبالصورة الى 100 و 50 و 25 و إضافة 100 ميكرولتر، 50 ميكرولتر و 25 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. لرقاقة الحمض النووي، وتسمية ثلاثة أنابيب إلى 200 و 100 و 50 و 200 إضافة ميكرولتر 100 ميكرولتر و 50 ميكرولتر من عينة DNA التشويه والتحريف وتحييدها. جعل الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر مع المياه مجانا نوكلياز.
  6. قطع غشاء لحجم الجهاز فتحة وصمة عار. قبل الرطب الغشاء وأوراق النشاف في 20x وSSC قبل وقبل إضافة DNA. تجميعها في الجهاز فتحة وصمة عار وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  7. DNA الماصة من الخطوة 2.5.2 في فتحات مناسبة. تطبيق فراغ ببطء لسحب DNA على الغشاء زيتا التحقيق. وقف فراغ بعد مرور جميع العينات من خلال جهاز.
    1. تفكيك الجهاز وشل على الفور DNA على الغشاء باستخدام crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. هل لديك الجانب DNA حتى في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية واستخدام الاتحاد الافريقيtocrosslink وضع في crosslinker. اتبع بروتوكول الشركة الصانعة.
  8. كشف BrdU على فتحة لطخة عن طريق أداء الغربية النشاف.
    1. منع الغشاء مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBS تحتوي على 0.1٪ توين-20 (PBST) لمدة 1 ساعة على RT لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة للغشاء.
    2. إضافة الابتدائي الأجسام المضادة لمكافحة BrdU (1: 500 تمييع) المخفف في 1٪ الحليب المجفف منزوع الدسم في PBST واحتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 3 ساعة على RT على شاكر. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية.
    3. إضافة HRP-مترافق مكافحة فأر الضد الثانوية إلى وصمة عار (1: 5000 تمييع) واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء مع PBST ثلاث مرات بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.
      ملاحظة: استخدم حجم ما يكفي من الأجسام المضادة لتغطية كامل الغشاء خلال حضانات الضد الابتدائية والثانوية.
  9. تحضير مزيج ECL وإضافته إلى ميلان وصمة عارحبال لبروتوكول الشركة المصنعة. احتضان الغشاء مع ECL المزيج لمدة 5 دقائق على RT.
    1. وضع الغشاء في كاسيت الأشعة السينية، كشف الغشاء إلى فيلم الأشعة السينية وتطوير وصمة عار باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قياس إشارة التي تم الحصول عليها لإدخال وDNA ChIPed بعد مسح البقع باستخدام صورة البرنامج J وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. لالكميات، استخدم إشارة إلى أن ضمن مجموعة خطية من الكشف لضمان دقة القياس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد خصوصية مثبطات HDAC1،2 انتقائية، استخدمت Hdac1،2 FL / FL وHdac3 FL / FL خلايا ليفية. واستخدمت لجنة المساواة العرقية recombinase (الإعلان، لجنة المساواة العرقية) التي تحتوي على اتش حذف Hdac1،2 وHdac3 في هذه الخلايا. بعد الإصابة الإعلان، لجنة المساواة العرقية من Hdac1،2 FL / FL الخلايا، لوحظ وجود زيادة قوية في H4K5ac. لم علاج الخلايا خروج المغلوب Hdac1،2 مع 233 أو 898 لا يؤدي إلى أي زيادة أخرى في H4K5ac مؤكدا أن 233 و 898 تمنع Hdac1،2 وليس Hdac3 في هذه الخلايا. في المقابل، أدت إضافة 233 أو 898 إلى خلايا خروج المغلوب Hdac3 في زيادة كبيرة في H4K5ac بالمقارنة مع الزيادة ينظر في خلايا خروج المغلوب Hdac3 بسبب تأثير مضافة على مستويات H4K5ac نتيجة لتثبيط Hdac1،2 و3. وبالتالي، 233 و 898 هي Hdac1، مثبطات 2 انتقائية. وتظهر هذه النتائج فيالشكل 1.

للتحقق من صحة تقنية BrdU رقاقة فتحة، أجري تحليل BrdU نبض مطاردة للنظر في حركية PCNA التحميل إلى الحمض النووي الناشئ في خلايا هيلا. أظهرت نتائجنا أن جمعية PCNA مع الحمض النووي الناشئ تحدث بسرعة في غضون 15 دقيقة ويختفي بعد مطاردة 30 دقيقة في اتفاق مع النتائج المنشورة سابقا 13. وتظهر هذه النتائج في الشكل 2.

تم استخدام تقنية BrdU-H4K16ac رقاقة فتحة للغرب لتحديد مقدار H4K16ac المرتبطة الحمض النووي الناشئ في غياب وظيفة HDAC1،2. ولوحظ وجود تخصيب القوي في H4K16ac المرتبطة الحمض النووي الناشئ عند مقارنة بالكنترول أرنب مفتش (أرقام 3A و 3B). يظهر زيادة في الوليدة H4K16ac المرتبطة DNA التالية تثبيط الأنشطة HDAC1،2 أو ضربة قاضية من Hdac1،2 في الشكل 3C قوية>، 3D، و3E.

مستوى SMARCA5 لونين remodeler على الحمض النووي الناشئ تم تحديدها باستخدام BrdU-SMARCA5 تقنية رقاقة فتحة للغرب. أظهرت نتائجنا أن الزميلة SMARCA5 مع الحمض النووي الناشئ في خلايا الثدييات. وعلاوة على ذلك، لم HDAC1،2 تثبيط أو ضربة قاضية من Hdac1،2 لا يغير كمية الناشئ المرتبط DNA SMARCA5 لونين remodeler كما هو مبين في الشكل (4).

الشكل 1
الشكل 1. التأكيد على خصوصية مثبطات HDAC1،2 انتقائية. التحليل الغربي لللست] خلية كاملة أعدت من Hdac1 FL / FL HDAC2 FL / FL أو خلايا ليفية Hdac3 FL / FL بعد الإصابة الإعلان، لجنة المساواة العرقية والعلاج مع 898 أووعولج 233. الخلايا مع 3 ميكرومتر 898 أو 233 لمدة 24 ساعة بعد 48 ساعة العدوى الإعلان، لجنة المساواة العرقية. ويستمد هذا الرقم من عملنا نشرت السابق 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. ديناميات رابطة PCNA مع DNA الوليدة في خلايا هيلا. وصفت خلايا هيلا مع bromodeoxyuridine (BrdU) لمدة 30 دقيقة. ثم تم غسلها الخلايا لإزالة غير مدمج BrdU ومثقف في وسائل الإعلام دون BrdU لفترات المشار إليها من الزمن (مطاردة). تم تنفيذ مناعي لونين (رقاقة) مع خلية مكافحة المتكاثرة مستضد النووي (PCNA) الأجسام المضادة. تم تقييم BrdU المسمى DNA الحالي في DNA المدخلات وتلك المرتبطة PCNA في تحليل لطخة فتحة باستخدام مضاد للBRDU الضد كما هو مبين في الشكل (2). ويستمد هذا الرقم من عملنا نشرت السابق 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تم تنفيذ الشكل 3. فقدان هيستون Deacetylase 1 و 2 الزيادات H4K16ac على الوليدة DNA. (AB) Bromodeoxyuridine (BrdU) نبض مطاردة في خلايا هيلا وNIH3T3 لتحديد جمعية H4K16ac مع الحمض النووي الناشئ في النقاط الزمنية المشار إليها. وعولج (CD) خلايا NIH3T3 مع أي DMSO أو مثبطات انتقائية HDAC1،2 (898 أو 233) لمدة 24 ساعة. الخلايا (E) NIH3T3 و transfected إما مع عدم استهداف (NT) أو Hdac1،2 (H12) سيرنا. وصفت مع BrdU واستخدامها - الخلايا من (E C)لرقاقة مع anti-H4K16ac تليها فتحة النشاف. تم بحثها الغشاء مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. تشير الأرقام إلى صورة J الكميات من متوسط ​​إشارة BrdU من الحجم الكبير والمتوسط ​​من رقاقة الحمض النووي رصدت. ويستمد هذا الرقم من عملنا نشرت السابق 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. SMARCA5 يخالط الوليدة DNA. يظهر مبلغ من SMARCA5 على لونين الناشئ بعد فقدان وظيفة HDAC1،2. إما تعامل الخلايا NIH3T3 مع مثبطات انتقائية HDAC1،2 (898) أو مع transfected عدم استهداف (NT) أو Hdac1،2 (H12) سيرنا. وصفت الخلايا مع BrdU التالية العلاجات المذكورة أعلاه، ورقاقة مع anti-SMARCA5 أو أرنب مفتش (ج السلبيةontrol) قد أنجز. وقد رصدت كميات متزايدة من شرائح الحمض النووي على فتحة لطخة وتم بحثها الغشاء مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. ويستمد هذا الرقم من عملنا نشرت السابق 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول صفها في هذه المخطوطة هي طريقة سريعة نسبيا لإثبات وجود البروتينات أو أشكالها المعدلة بعد translationally على DNA تكرارها حديثا أو الناشئ. بالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه التقنية واحدة لقياس حركية جمعية-تفكك البروتين أو شكله المعدل مع الحمض النووي الناشئ. هذه التقنية هي مكملة لتكنولوجيا أنيقة iPOND 13. في التكنولوجيا iPOND، هو المسمى DNA تصنيعه حديثا مع deoxyuridine الإيثيلي (EDU). ثم يتم إضافة المترافقة البيوتين على EDU باستخدام النقر الكيمياء. ثم يتم immunoprecipitated DNA الناشئ الموسومة البيوتين باستخدام الخرز streptavidin والبروتينات شارك في تنقية يتم الكشف عنها بواسطة النشاف الغربي. من ناحية أخرى، في أسلوبنا BrdU رقاقة فتحة للغرب، وimmunoprecipitated البروتين أو شكله تعديل المرتبطة الحمض النووي الناشئ باستخدام بروتين معين أو تعديل الضد شكل معين وكمية من الحمض النووي الناشئ المسمى BrdU منضمة إلى البروتين هو الأون تحديدها كميا عن طريق فتحة الغربية النشاف باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة BrdU.

هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول الذي يحتاج إلى عناية خاصة. فمن الأهمية بمكان التأكد من أن الأجسام المضادة التي تهم يعمل بشكل جيد في المقايسات رقاقة قياسية مع كفاءة عالية. من المهم لاختبار كفاءة الأجسام المضادة في المقايسات رقاقة بواسطة الكمي-PCR قبل إجراء الفحص BrdU-CHIP فتحة للغرب. من أجل تحديد الكميات من تقنية BrdU-CHIP فتحة للغرب أن تكون دقيقة، ينبغي تطبيق التخفيف المتسلسل من الحمض النووي المسمى BrdU إلى فتحة وصمة عار والتحليل الغربي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة BrdU ينبغي أن يقوم في البداية من أجل تحديد مجموعة خطية من الكشف. تحديد تركيز الحمض النووي DNA من رقاقة والإدخال تمكن واحد لضمان أن كمية الحمض النووي المسمى BrdU هو ضمن مجموعة خطية من الكشف في الغرب النشاف. على سبيل المثال، توصلنا إلى 50 نانوغرام إلى 12.5 نانوغرام من الحمض النووي المدخلات ليكون فيفي مجموعة خطية في تجربة رائدة لدينا. أيضا، إذا كان تركيز العينات رقاقة عالية جدا، فإنه لا بد من تمييع DNA رقاقة قبل تنفيذ الفتحة. الحد من هذه التقنية هو قرارها، الذي يعتمد على كفاءة القص لونين. والقص من لونين من قبل صوتنة يحدد القرب من بروتين معين أو صيغة معدلة لالحمض النووي مركبة جديدة.

في الماضي، ظلت دراسة التغيرات في لونين والانزيمات تعديل لونين خلال تكرار الحمض النووي في خلايا الثدييات سؤال صعب لمعالجة بسبب عدم توفر التقنيات الملائمة. وعلاوة على ذلك، منذ إلقاء القبض خلايا Hdac1،2 فارغة في المرحلة G1، كان من الصعب لفحص وظائف لHdac1،2 داخل S-المرحلة. في دراستنا، أظهرنا وظائف لهذه Hdacs اثنين خلال تكرار الحمض النووي باستخدام مزيج من مثبطات انتقائية الأولى في فئتها لكبح أنشطتها داخل S-مرحلة ورواية BrdU رقاقة-Sالكثير الغربي التقنية. في المستقبل، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة ديناميكية DNA استجابة الضرر وإصلاح الحمض النووي البروتينات عند مفترق الطرق المتعثرة بالإضافة إلى دراسة التعديلات هيستون وإنزيم تعديل لونين عند مفترق الطرق. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب لا يقتصر على خلايا فأر NIH3T3. هذه التقنية يمكن استخدامها بنجاح في خطوط الخلايا الأخرى من أجل التحقيق في كيفية مثبطات أخرى من الإنزيمات أو البروتينات تؤثر على تكرار الحمض النووي وتكرار التوتر الناجم عن التغيرات ونين عند مفترق الطرق النسخ المتماثل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد العمل في هذه المخطوطة من أموال من قسم علاج الأورام بالإشعاع ومعهد هانتسمان للسرطان والمعهد الوطني للصحة منح (R01-CA188520) لSB. أشكر دانييل جونسون وستيفن بينيت في مختبري ليدل على البروتوكول وشرح فوائدها. وأنا ممتن للدكتور ماهيش شاندراسيخاران (معهد هانتسمان للسرطان) للتعليق الحرجة على المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU (westerns) BD Biosciences B555627
Anti-SMARCA5 Abcam ab3749
Anti-H4K16ac Active Motif 39167
Zeta-Probe GT Membrane Bio-Rad 162-0197
Formaldehyde Fisher BP531-500
Protein A agarose Millipore 16-156
Rnase A Qiagen 19101
Proteinase K Sigma P4850
PCR Purification Kit Qiagen 28106
Glycine Sigma G7403
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
BrdU Sigma B9285
Rabbit IgG  Millipore 12-370
HEPES Sigma H3375
NaCl Sigma S-3014
Triton-X-100 Sigma 93443
NP40 USB Corporation 19628
Sodium deoxycholate Sigma D6750
Sodium bicarbonate Sigma S-4019
Ethanol Decon Laboratories 04-355-222
DEPC-treated water Sigma 95284
Tris Fisher BP-152-5
EDTA Invitrogen 15575-020
SDS Ambion AM9820
Sodium hydroxide Mallinckrodt GenAR  MAL7772-06
20x SSC Life Technologies 15557-036
Non-fat dry milk Lab Scientific Inc M0841
ECL Thermo Fisher 80196
X-ray film Genesee Sci 30-101
Developer Konica Minolta SRX-101A
UV Crosslinker Stratagene XLE-1000
Sonicator Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor Model: 450
Centrifuge Eppendorf Model: 5810R
Water bath Fisher Scientific Isotemp Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer ThermoScientific Model: 1000
Slot Blot apparatus  Schleicher and Schuell Minifold II 44-27570
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
  2. Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
  3. Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
  4. Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
  5. Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
  6. Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
  7. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  8. Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
  9. Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
  10. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
  11. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).
  12. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 107، HDAC1،2، الوليدة DNA، تكرار الحمض النووي والاستقرار الجينوم، لونين مناعي، السرطان، BrdU، فتحة وصمة عار، الهستونات، لونين remodeler وHDAC مثبطات
فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhaskara, S. Examination of Proteins … More

Bhaskara, S. Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using BrdU-ChIP-Slot-Western Technique. J. Vis. Exp. (107), e53647, doi:10.3791/53647 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter