Abstract
Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente.
Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L'etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c'era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l'immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L'effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.
Introduction
Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule 1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare 2,3, e l'incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l'integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DNA) e la morte delle cellule 4-9. Si tratta quindi di una strategia pratica per usare inibitori HDAC selettivi di interrompere la replica, la riparazione e la cromatina in cellule tumorali e causare danni al DNA, che a sua volta può fermare la crescita e induce la morte cellulare selettivamente nelle cellule tumorali in rapida crescita.
Durante la replicazione del DNA, cromatina è rapidamente smontato e poi rimontato seguendo duplicazione del DNA. Recentemente synthesized istone H4 è acetilato a K5 e residui K12 (H4K5K12ac) e segue la deposizione sulla cromatina, sono rapidamente deacetilata da istone deacetilasi (HDAC) 10,11. Fallimento di cellule per mantenere l'integrità della cromatina nascente da istoni deacetilazione può portare al collasso della forcella, che a sua volta può causare danni al DNA e la morte cellulare. Abbiamo recentemente dimostrato che l'inibizione selettiva di HDAC1,2 aumenta l'acetilazione degli istoni (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibisce l'attività SMARCA5 cromatina remodeler sulla cromatina nascente, che correla con una ridotta progressione forca di replicazione, aumentato crollo forchetta e aumentato la replica da stress danno al DNA 6 . Così, HDAC inibitore trattamento possono alterare la struttura della cromatina nascente per innescare danni al DNA e la morte molto rapidamente nelle cellule tumorali, in quanto questi ciclo cellule in rapida e passare più volte attraverso la fase S. E 'quindi importante capire come funzionano HDAC regolare acetilazione degli istoni e proteine binding per mantenere la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero.
Per misurare quantitativamente la quantità di acetilazione degli istoni e SMARCA5 remodeler cromatina associata con il DNA nascente durante la replicazione del DNA, abbiamo ideato un saggio ChIP modificato chiamato la tecnica di BrdU-Chip-Slot-occidentale. Dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di una proteina o istone modifica desiderata, la quantità di DNA nascente (all'etichetta analogico timidina, BrdU) nel campione chip può essere rilevato mediante analisi Western di DNA chip BrdU marcato trasferite su una membrana utilizzando un Slot Apparecchio Blot. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che H4K16ac (un marchio coinvolta nella confezione cromatina) e il membro della famiglia ISWI SMARCA5 (regolatore actina-dipendente matrice associata SWI / SNF-correlata della cromatina) remodeler cromatina sono associati con il DNA nascente in cellule in fase S. 6. Abbiamo anche trovato che il marchio nascente H4K16ac è deacetilata da HDAC1,2 durante la replicazione del DNA 6. Inibisce H4K16acattività remodeler cromatina del familiare ISWI SMARCA5 12. Quindi, utilizzando la tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale, potremmo collegare le funzioni per HDAC1,2 nel regolare il rimodellamento della cromatina durante la replicazione del DNA. Quindi, la tecnica BrdU-Chip-Slot-Western Blot è un approccio efficace per misurare quantitativamente l'associazione e dissociazione dinamica delle proteine o loro modificazioni post-traslazionali che sono tenuti al DNA nascente.
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Protocol
1. immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in seguito BrdU etichettatura
- Culture cellule NIH3T3 in presenza sia di DMSO o inibitori selettivi HDAC1,2 come descritto in precedenza 6.
- Dopo il trattamento con inibitori selettivi DMSO o HDAC1,2, aggiungere BrdU alle celle in una cappa coltura tissutale sterile. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 placcati in 10 ml mezzi NIH3T3 con una concentrazione finale di 20 mM di bromodeossiuridina (BrdU) per 60 min in una sterile 37 ° C coltura tissutale incubatore.
- Crosslink proteine intracellulari DNA aggiungendo formaldeide direttamente al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 1%. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 con formaldeide a temperatura ambiente per 10 min su un agitatore.
- Quench la reticolazione mediante l'aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un agitatore.
- Togliere la carta e raccogliere le cellule in PBS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin cells a 956 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet di cellule due volte con PBS freddo. Rimuovere PBS dal tubo. Conservare il pellet reticolato cellulare senza PBS (surnatante) a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare il lisato dal pellet cellulare reticolato aggiungendo tampone FA140 500 microlitri (50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% sodio desossicolato) integrato con inibitore della proteasi cocktail.
- Taglio la cromatina dalle sonicazione dei campioni cinque volte al potere il 35% e con un impulso di 15 secondi, 0,9 secondi acceso e 0,1 secondi spento impostazione. Tenere le provette in ghiaccio dopo ogni turno di ultrasuoni per evitare il riscaldamento dei campioni.
- Controllare il taglio su un gel DNA come l'efficienza di taglio varierà tra i diversi sonicatori. Per controllare sonicazione, invertire reticolazione con l'aggiunta di NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e eseguire i passaggi 1.17.1. - 1.22. Esegui eluita 10 microlitri DNA su un gel di agarosio 1,5% per verificare se il taglio ètra 300-700 bp con una intensità media a 500 bp.
- Dopo sonicazione, centrifugare i campioni per 10 min a 17.949 xga 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Eseguire la stima delle proteine utilizzando il kit di analisi delle proteine commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare la stessa quantità di lisato per il chip di controllo e campioni sperimentali. In generale, utilizzare 1 mg di lisato totale per reazione chip.
- Preparare 50% sospensione di proteina A-agarosio utilizzando tampone FA140 contenente inibitori delle proteasi cocktail. Aggiungere 1/10 volume del cocktail inibitore della proteasi. Calcolare il volume di perline necessari in base al numero di campioni in totale.
- Lavare perline Proteina A-agarosio con tampone FA140 due volte per rimuovere il tampone di conservazione e aggiungere un volume uguale di tampone FA140 ai talloni per fare 50% slurry.
- Per rimuovere le proteine che non si legano specificamente ai talloni, aggiungere 50 ml di 50% sospensione di Proteina A-agarosio e incubate i campioni a 4 ° C con rotazione costante end-over-end in un mixer rosticceria per 30 min.
- Spin i campioni a 956 xg a 4 ° C per un minuto. Raccogliere il surnatante ed eseguire immunoprecipitazione tramite l'aggiunta di 8 microlitri H4K16ac anticorpo o 5 ml (5 mg) di 1 mg / ml di anticorpo SMARCA5 il surnatante. Incubare a 4 ° CO / N con rotazione end-over-end costante in un mixer rosticceria.
- Salva 1/10 ° di un estratto per il controllo 'input' e impostarlo come parte a -20 ° C. L'ingresso deve essere inverso reticolato con i campioni IP.
- Utilizzare la stessa quantità di IgG di coniglio (5 ml di 1 mg / ml) come campione di controllo negativo immunoprecipitazione.
- Il giorno seguente, aggiungere 50 ml di 50% proteina A-agarosio slurry all'estratto e incubare per 1 ora a 4 ° C con rotazione.
- Pellet agarosio per centrifugazione a 956 xg per 2 minuti a 4 ° C, rimuovere con attenzione il surnatante e wash le perline con i seguenti buffer in sequenza. Nelle preparazioni tampone, aggiungere inibitori della proteasi a destra prima dell'uso.
- Lavare con sale basso Immune Complex tampone di lavaggio (FA140; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
- Lavare con Salt Immune Complex tampone di lavaggio ad alta (FA500; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 500 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
- Lavare con LiCl Immune Complex tampone di lavaggio (concentrazione finale di 10 mM di Tris-Cl pH 8,0, 250 mM di LiCl, 0,5% e 0,5% NP40 desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
- Dopo lavaggi come descritto sopra, aggiungere 200 microlitri soluzione di eluizione (concentrazione finale di 1% SDS e 100 mM sodio bicarbonato) e incubate a temperatura ambiente per 15 min con rotazione end-over-end a RT.
- Spin i campioni a 956 xg a RT e trasferire l'eluato in una nuova provetta da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 1.15 con l'aggiunta di soluzione di eluizione 200 l.
- Per 400 ml di eluato, aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e mescolare bene.
- Inoltre, aggiungere la soluzione di eluizione 400 microlitri di 10 microlitri di ingresso che è stato allocato (passo 1.11) e aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M di invertire campioni di ingresso reticolazione pure. Invertire reticolare i campioni incubando a 65 ° C bagnomaria per 5 ore.
- Aggiungere 1 ml di 100% EtOH al eluato reverse-reticolato. Mescolare bene e incubare a -80 ° C per 2-3 ore oppure a -20 ° CO / N. Spin i campioni a 17.949 xg per 15 minuti e scartare l'etanolo.
- Aggiungere 800 ml 70% di etanolo per lavare il pellet. Spin a 17.949 xg per 15 min a 4 ° C e scartare etanolo. Spin brevemente per rimuovere qualsiasi residuo di etanolo. Asciugare i campioni a 37 ° C per 10 min per rimuovere l'etanolo residuo.
- Sciogliere in 90 microlitri DNA RNasi e DNasi acqua libera e aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml RNasi a 0,2 mg / ml concentrazione finale. Incubare a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti.
- Aggiungere 10 ml 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 5% SDS). Mescolare bene e aggiungere 1 ml proteinasi K. Incubare a 42 ° C per 1 ora.
- Purificare ingresso e ChIP DNA usando commerciale kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore ed eluire il DNA in 50 microlitri acqua. Conservare DNA a -20 ° C fino all'utilizzo.
2. Slot blot analisi del DNA ChIP
- Misurare la resa di ingresso e di DNA ChIP eluito in 50 microlitri acqua come descritto al punto 1.22 utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm secondo il protocollo del produttore.
- Prendere volumi uguali (50 microlitri) di ingresso o di DNA immunoprecipitato che si trovano all'interno della gamma lineare di rilevamento.
- Ad esempio, se l'ingressoResa del DNA è di 1,5 ng / ml, poi prendere 30 ml (o 45 ng di DNA totale) e fare volume di 50 ml con acqua. Per fattore ChIP, prendere l'intero 50 microlitri eluato dal punto 2.1 e passare al punto 2.3.
- Denaturare 50 microlitri di ingresso o DNA immunoprecipitato aggiungendo 2,5 volumi di 0,4 N NaOH, vortex brevemente e centrifugare per 956 xg per 10 sec, e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Neutralizzare il DNA denaturato con l'aggiunta di 175 ml di 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugare per 956 g per 10 secondi e posizionare i campioni sul ghiaccio.
- Preparare una diluizione seriale di ingresso e di DNA immunoprecipitato per la Slot Blot test come descritto di seguito.
- Seguire i passaggi 2,3-2,4 per ottenere un volume totale di 350 microlitri del campione (ad esempio, 50 ml di ingresso / DNA ChIP, 125 ml 0,4 N NaOH, 175 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
Nota: Per l'istanza indicato in precedenza, 45 ng di DNA ingresso finirà per essere 0,129 ng / ml. - Per il DNA di ingresso, etichettare tre tubos come 100, 50 e 25 e aggiungere 100 ml, 50 ml e 25 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Rendere il volume finale a 100 ml con acqua priva di nucleasi. Per DNA chip, label tre tubi da 200, 100 e 50 e aggiungere 200 microlitri, 100 microlitri e 50 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Fai volume finale a 200 ml con acqua priva di nucleasi.
- Seguire i passaggi 2,3-2,4 per ottenere un volume totale di 350 microlitri del campione (ad esempio, 50 ml di ingresso / DNA ChIP, 125 ml 0,4 N NaOH, 175 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
- Tagliare la membrana alla dimensione dell'apparato Slot Blot. Pre-bagnare la membrana e carta assorbente in 20x SSC prima e prima di aggiungere DNA. Assemblarle nell'apparato macchia slot secondo il protocollo del produttore.
- DNA pipetta dal punto 2.5.2 in apposite cave. Applicare il vuoto lentamente per tirare il DNA sulla membrana zeta-sonda. Arrestare vuoto dopo tutti i campioni sono passati attraverso l'apparecchio.
- Smontare l'apparato e immobilizzare immediatamente il DNA sulla membrana utilizzando un reticolante UV. Avere il lato del DNA nella reticolante UV e utilizzare il autocrosslink impostazione nel reticolante. Seguire il protocollo del produttore.
- Rileva BrdU sulla macchia slot eseguendo western blotting.
- Bloccare la membrana con 5% di latte secco non grasso in PBS contenente 0,1% Tween-20 (PBST) per 1 ora a RT per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla membrana.
- Aggiungere anticorpo primario anti-BrdU (diluizione 1: 500) diluito nel latte secco non grasso 1% in PBST e incubare il blot con l'anticorpo primario per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l'incubazione anticorpo primario.
- Aggiungere anticorpo secondario anti-topo HRP-coniugato alla macchia (1: 5.000 diluizione) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l'incubazione anticorpo secondario.
NOTA: utilizzare un volume sufficiente di anticorpi per coprire completamente la membrana durante l'incubazione anticorpi primari e secondari.
- Preparare la miscela ECL e aggiungerlo alla ac macchiacondo protocollo del produttore. Incubare la membrana con mix ECL per 5 minuti a RT.
- Posizionare la membrana in una cassetta a raggi X, esporre la membrana alla pellicola a raggi X e sviluppare il blot usando il protocollo del produttore.
- Quantificare il segnale ottenuto per l'ingresso e il DNA chip dopo la scansione le macchie utilizzando il software Image J secondo il protocollo del produttore. Per la quantificazione, utilizzare il segnale che è all'interno del range lineare di rilevamento al fine di garantire la precisione della misurazione.
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Representative Results
Per determinare la specificità degli inibitori selettivi HDAC1,2, sono stati utilizzati Hdac1,2 FL / FL e HDAC3 FL / FL cellule fibrosarcoma. -Adenovirus contenenti Cre ricombinasi (Ad-Cre) è stato utilizzato per eliminare Hdac1,2 e HDAC3 in queste cellule. A seguito di infezione Ad-Cre di Hdac1,2 FL / FL cellule, è stato osservato un robusto incremento della H4K5ac. Il trattamento delle cellule knockout Hdac1,2 con 233 o 898 non ha comportato un ulteriore aumento delle H4K5ac conferma che 233 e 898 inibiscono Hdac1,2 e non HDAC3 in queste cellule. Al contrario, l'aggiunta di 233 o 898 di cellule knockout HDAC3 determinato un aumento significativo H4K5ac rispetto all'aumento visto in cellule knockout HDAC3 causa di un effetto additivo sui livelli H4K5ac come risultato di inibizione della Hdac1,2 e 3. Pertanto, 233 e 898 sono HDAC1, inibitori selettivi 2. Questi risultati sono mostrati nellaFigura 1.
Per convalidare la tecnica BrdU-Chip-Slot, è stata eseguita l'analisi BrdU-pulse chase a guardare la cinetica di PCNA carico al DNA nascente in cellule HeLa. I nostri risultati hanno dimostrato che PCNA associazione con il DNA nascente avviene rapidamente entro 15 minuti e scompare dopo 30 minuti di caccia in accordo con i risultati precedentemente pubblicati 13. Questi risultati sono mostrati in Figura 2.
Tecnica BrdU-H4K16ac ChIP-Slot-occidentale è stato utilizzato per determinare la quantità di H4K16ac associato con il DNA nascente in assenza della funzione HDAC1,2. Un arricchimento robusta in H4K16ac associato nascente DNA è stata osservata rispetto al controllo IgG di coniglio (Figure 3A e 3B). L'aumento nascente H4K16ac DNA-associata seguente inibizione della attività HDAC1,2 o knockdown di Hdac1,2 è mostrato in Figura 3C strong>, 3D e 3E.
Il livello di SMARCA5 cromatina remodeler sul DNA nascente è stato determinato utilizzando BrdU-SMARCA5 tecnica ChIP-Slot-occidentale. I nostri risultati hanno dimostrato che associa SMARCA5 con DNA nascente in cellule di mammifero. Inoltre, l'inibizione HDAC1,2 o knockdown di Hdac1,2 non modificare la quantità di DNA nascente associata SMARCA5 cromatina remodeler come mostrato in Figura 4.
Figura 1. Conferma della specificità di inibitori selettivi HDAC1,2. Analisi Western di lisati cellulari interi preparati con HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL o cellule fibrosarcoma HDAC3 FL / FL seguenti infezione Ad-Cre e il trattamento con 898 o233. Le cellule sono state trattate con 3 micron 898 o 233 per 24 ore a seguito di una 48 ore di infezione Ad-Cre. Questo dato è derivato dal nostro precedente lavoro pubblicato 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Dinamica del PCNA associazione con il DNA nascente in cellule HeLa. Cellule HeLa sono stati etichettati con bromodeossiuridina (BrdU) per 30 minuti. Le cellule sono state poi lavati per rimuovere senza personalità giuridica BrdU e coltivate in media senza BrdU per periodi indicati di tempo (Chase). Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata effettuata con l'antigene nucleare di cellule anti-proliferazione (PCNA) anticorpo. BrdU marcato DNA presente nel DNA di ingresso e quelli associati con PCNA sono stati valutati nello slot blot utilizzando un anti-BrdU anticorpo come illustrato nella figura 2. Questa figura è derivato dal nostro precedente lavoro pubblicato 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La perdita dell'istone deacetilasi 1 e 2 Aumenta H4K16ac sulla nascente del DNA. (AB) Bromodeossiuridina (BrdU) impulso caccia è stata effettuata in cellule HeLa e NIH3T3 per determinare l'associazione di H4K16ac con il DNA nascente nei punti di tempo indicato. (CD) cellule NIH3T3 sono stati trattati con DMSO o un inibitore selettivo HDAC1,2 (898 o 233) per 24 ore. Cellule (E) NIH3T3 erano o transfettate con i non-targeting (NT) o Hdac1,2 (H12) siRNA. Le cellule da (C - E) sono stati etichettati con BrdU e usatiper il chip anti-H4K16ac seguito da slot blotting. La membrana è stata sondato con un anticorpo anti-BrdU. I numeri indicano a J Immagine quantificazione del segnale media BrdU del volume di alta e media del DNA ChIP maculato. Questo dato è derivato dal nostro precedente lavoro pubblicato 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. SMARCA5 Associates con DNA nascente. Viene visualizzata la quantità di SMARCA5 sulla cromatina nascente in seguito alla perdita della funzione HDAC1,2. Cellule NIH3T3 sono stati trattati con un inibitore selettivo HDAC1,2 (898) o trasfettate con i non-targeting (NT) o Hdac1,2 (H12) siRNA. Le cellule sono state marcate con BrdU dopo i trattamenti di cui sopra e chip con anti-SMARCA5 o IgG coniglio (c negativoontrol) è stata effettuata. Volumi crescenti di DNA chip è stato avvistato sulla macchia slot e la membrana è stato sondato con un anticorpo anti-BrdU. Questo dato è derivato dal nostro precedente lavoro pubblicato 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo manoscritto è un metodo relativamente veloce per dimostrare la presenza di proteine o loro forme post-traduzionali modificati sul DNA appena replicato o nascente. Inoltre, questa tecnica permette uno per misurare la cinetica di associazione-dissociazione di una proteina o la sua forma modificata con il DNA nascente. Questa tecnica è complementare alla elegante tecnologia iPOND 13. Nella tecnologia iPOND, il DNA di nuova sintesi è etichettato con deossiuridina etile (EDU). Un coniugato biotina viene poi aggiunto su EdU utilizzando il click chemistry. Biotina-tagged DNA nascente viene quindi immunoprecipitata utilizzando perline streptavidina e proteine co-depurative vengono rilevati da western blotting. D'altra parte, nella nostra tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale, una proteina o la sua forma modificata associata con DNA nascente è immunoprecipitate usando specifiche proteine o anticorpi specifici forma modificata e la quantità di BrdU marcato DNA nascente legato al proteina è then determinato quantitativamente mediante Slot-Western blotting utilizzando un anticorpo anti-BrdU.
Ci sono passaggi critici di questo protocollo che ha bisogno di particolare attenzione. È fondamentale garantire che l'anticorpo di interesse funziona bene in test standard chip con alta efficienza. E 'importante per testare l'efficienza di un anticorpo in saggi chip quantitativa-PCR prima dell'esecuzione del test BrdU-CHIP-Slot-occidentale. Affinché la quantificazione della tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale accurate, una diluizione seriale del DNA BrdU marcato deve essere applicato allo slot blot e analisi Western utilizzando l'anticorpo anti-BrdU dovrebbe effettuato inizialmente per determinare il campo lineare di rilevamento. Determinazione della concentrazione di DNA di ChIP e DNA Input permette uno per assicurare che la quantità di DNA BrdU marcato è all'interno del range lineare di rilevamento in Western blotting. Ad esempio, abbiamo determinato 50 ng a 12,5 ng di DNA di ingresso per essere inil campo lineare nel nostro esperimento pilota. Inoltre, se la concentrazione dei campioni chip è molto elevata, è indispensabile per diluire il DNA chip prima di eseguire slot. La limitazione di questa tecnica è la risoluzione, che dipende l'efficienza del taglio cromatina. Il taglio della cromatina per sonicazione determina la prossimità di una data proteina o la sua forma modificata al DNA di nuova sintesi.
In passato, lo studio dei cambiamenti nella cromatina e enzimi che modificano la cromatina durante la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero è rimasta una domanda difficile da affrontare a causa della mancata disponibilità di tecniche appropriate. Inoltre, dato che le cellule Hdac1,2-null arresto in fase G1, è stato difficile per esaminare le funzioni per Hdac1,2 all'interno fase S. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato le funzioni di questi due HDAC durante la replicazione del DNA utilizzando una combinazione di prime-in-class inibitori selettivi per inibire le loro attività all'interno della fase S e il romanzo BrdU-Chip-Slot-occidentale tecnica. In futuro, questa tecnica può essere utilizzata anche per lo studio della dinamica delle proteine DNA risposta al danno e riparazione del DNA alla biforcazione stallo oltre a studiare le modificazioni degli istoni e-cromatina modifica enzimatica a forcella. Inoltre, questa tecnica non è limitata alle cellule NIH3T3 topo. Questa tecnica può essere utilizzata con successo in altre linee cellulari per studiare come altri inibitori di enzimi o proteine influenzano replicazione del DNA e replica da stress modifiche cromatina al bivio replica.
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Acknowledgments
Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Radioterapia Oncologica e Huntsman Cancer Institute e il National Institute of Health sovvenzione (R01-CA188520) di SB. Ringrazio Danielle Johnson e Steven Bennett nel mio laboratorio per dimostrare il protocollo e spiegando i suoi benefici. Sono grato al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) per i commenti critici sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
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