Abstract
deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ"א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה.
פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.
Introduction
תיקון דנ"א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ"א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ"א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ"א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות.
במהלך שכפול הדנ"א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ"א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ"א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ"א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים.
כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ"א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הבאים תיוג BrdU
- תאי NIH3T3 תרבות בנוכחות או DMSO או מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי כפי שתואר לעיל 6.
- בעקבות טיפול במעכבים סלקטיביים DMSO או HDAC1,2, להוסיף BrdU לתאים בתרבית רקמת מכסה המנוע סטרילי. דגירה 2 x 10 6 NIH3T3 תאים מצופים ב 10 מיליליטר תקשורת NIH3T3 עם 20 מיקרומטר ריכוז סופי של bromodeoxyuridine (BrdU) במשך 60 דקות בתרבית רקמת חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס.
- חלבוני Crosslink תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות לתקשורת והתרבות בריכוז סופי של 1%. דגירה 2 x 10 6 תאי NIH3T3 עם פורמלדהיד ב RT במשך 10 דקות על שייקר.
- להרוות את הקישור הצולב על ידי התוספת של גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ. לדגור על RT במשך 5 דקות על שייקר.
- הסר את המדיה ולאסוף תאים בPBS בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. cel ספיןLS 956 בXG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS קר כקרח. הסר PBS מהצינור. אחסן את התא גלולה צולבים ללא PBS (supernatant) ב -80 ° C עד שימוש.
- הכן את lysate מהתא גלולה crosslinked על ידי הוספת חיץ FA140 500 μl (50 מ"מ של HEPES KOH 7.5 pH, 140 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז.
- הגזירה הכרומטין ידי sonicating דוגמאות חמש פעמים ב -35% כוח ועם דופק 15 שניות, 0.9 שניות ובהגדרה 0.1 שניות מ. שמור את הצינורות על קרח לאחר כל סיבוב של sonication כדי למנוע חימום של הדגימות.
- בדוק את הגז על ג'ל DNA כיעילות הגז תנוע בין sonicators שונה. כדי לבדוק sonication, הפוך crosslink ידי הוספת NaCl בריכוז של 0.16 M ולבצע צעדים 1.17.1. - 1.22. הפעלת eluted 10 DNA μl על ג'ל agarose 1.5% כדי לבדוק אם הגז הואבין 300-700 נקודות בסיס בעוצמה ממוצעת על 500 נקודות בסיס.
- בעקבות sonication, דגימות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 17949 XG ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש.
- לבצע הערכת חלבון באמצעות ערכת assay החלבון המסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש בכמות שווה של lysate לשבב של שליטה ודגימות ניסוי. בדרך כלל, להשתמש 1 מ"ג של lysate הכולל לכל תגובת שבב.
- הכן תרחיף 50% מ- agarose חלבון באמצעות חיץ FA140 המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל. להוסיף 1/10 נפח של מעכבי פרוטאז הקוקטייל. חשב את הנפח של חרוזים צורך מבוסס על מספר הדגימות בסך הכל.
- חרוזים-agarose חלבון לשטוף עם חיץ FA140 פעמיים כדי להסיר את חיץ האחסון ולהוסיף נפח שווה לחיץ FA140 לחרוזים לעשות slurry 50%.
- כדי להסיר חלבונים שאינם במיוחד לאגד את חרוזים, להוסיף 50 μl של תרחיף 50% מ- agarose חלבון ובcubate הדגימות ב 4 ° C עם רוטציה הסוף-על-קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה למשך 30 דקות.
- ספין הדגימות ב956 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך דקה. לאסוף את supernatant ולבצע immunoprecipitation על ידי הוספה או נוגדן H4K16ac 8 μl או 5 μl (5 מיקרוגרם) של 1 מ"ג / מיליליטר נוגדן SMARCA5 לsupernatant. דגירה על 4 מעלות CO / N עם סיבוב קצה על קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה.
- חוסכים 1/10 בתמצית לשליטה 'קלט' ולהגדיר אותו כצד ב -20 ° C. הקלט צריך להיות הפוך צולבים יחד עם דגימות ה- IP.
- השתמש בכמות שווה של IgG ארנב (5 μl של 1 מ"ג / מיליליטר) כמדגם immunoprecipitation ביקורת השלילי.
- למחרת, להוסיף 50 μl של 50% תרחיף-agarose חלבון לתמצית דגירה עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה.
- גלולה חרוזים agarose ידי צנטריפוגה ב956 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant וwa זהירותsh חרוזים עם המאגרים ברצף הבאים. בהכנות חיץ, להוסיף מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש.
- לשטוף עם מלח נמוך מורכבת הצפת לשטוף חיסונית (FA140; ריכוז סופי של 50 מ"מ של HEPES KOH pH 7.5, 140 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה.
- לשטוף עם מלח גבוה קומפלקס הצפת לשטוף חיסונית (FA500; ריכוז סופי של 50 מ"מ של HEPES KOH pH 7.5, 500 מ"מ של NaCl, 1 מ"מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה.
- לשטוף עם LiCl מורכב הצפת לשטוף חיסונית (ריכוז סופי של 10 מ"מ של טריס-Cl pH 8.0, 250 מ"מ של LiCl, 0.5% ו -0.5% NP40 deoxycholate נתרן) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה הסוף-על-קצה.
- בעקבות שטיפות כפי שתואר לעיל, להוסיף 200 פתרון elution μl (ריכוז סופי של SDS 1% ויקרבונט 100 מ"מ נתרן) וincubatדואר ב RT במשך 15 דקות עם סיבוב קצה על קצה על RT.
- ספין הדגימות ב956 XG ב RT ולהעביר את eluate לצינור 1.5 מיליליטר חדש. חזור על שלב 1.15 עם פתרון elution 200 μl נוסף.
- 400 μl של eluate, להוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M ומערבבים היטב.
- בנוסף, להוסיף פתרון elution 400 μl 10 קלט μl שלהפריש (שלב 1.11) ולהוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M להפוך דגימות קלט crosslink גם כן. הפוך crosslink הדגימות ידי דוגרים באמבט המים C ° 65 במשך 5 שעות.
- הוסף 1 מיליליטר של 100% EtOH לeluate ההפוך-crosslinked. מערבבים היטב דגירה ב -80 ° C 2 - 3 שעות או ב -20 CO ° / N. ספין הדגימות ב17949 XG במשך 15 דקות וזורקי אתנול.
- להוסיף 800 אתנול 70% μl ללשטוף את הכדור. ספין ב17949 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקי אתנול. ספין בקצרה כדי להסיר כל אתנול שיורית. האוויר יבש הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר אתנול שייר.
- ממיסים DNA ב -90 RNase μl ומים חופשיים DNase ולהוסיף 2 μl 10 מ"ג / מיליליטר RNase ב0.2 מ"ג / מיליליטר ריכוז סופי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות.
- הוסף 10 μl 10x proteinase K הצפת (100 מ"מ טריס pH-Cl 8.0, 50 מ"מ EDTA pH 8.0, 5% SDS). מערבבים היטב ומוסיף μl 1 proteinase ק לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לטהר DNA קלט והשבב באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR על פי הפרוטוקול של היצרן וelute DNA במי 50 μl. DNA החנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
2. חריץ ניתוח כתם של השבב ה- DNA
- מדוד את התשואה של קלט ושבב ה- DNA eluted במי 50 μl כמתואר בשלב 1.22 באמצעות ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר פי הפרוטוקול של היצרן.
- קח כמויות שווה (50 μl) של קלט או DNA immunoprecipitated שנמצאים בטווח ליניארי של זיהוי.
- לדוגמא, אם קלטתשואת DNA היא 1.5 ng / μl, ואז לקחת 30 μl (או 45 ng DNA סך הכל) ולהפוך את נפח 50 μl עם מים. לשבב גורם, לקחת את כל eluate 50 μl משלב 2.1 והמשיכו לשלב 2.3.
- לפגל 50 קלט μl או DNA immunoprecipitated ידי הוספת 2.5 כרכים של 0.4 N NaOH, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות לXG 956 במשך 10 שניות, ולדגור על RT למשך 30 דקות.
- לנטרל את ה- DNA מפוגל ידי הוספת 175 μl של 1 M טריס- HCl, pH 6.8, מערבולת, צנטריפוגות במשך 956 XG במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח.
- הכן דילול סדרתי של קלט וDNA immunoprecipitated עבור assay כתם חריץ כמפורט להלן.
- בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8).
הערה: הדוגמא האמורה לעיל, 45 ng של DNA הקלט יהיה בסופו .129 ng / μl. - לDNA קלט, תווית שלושה צינורשל 100, 50 ו -25 ולהוסיף 100 μl, 50 μl ו -25 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך את הנפח הסופי 100 μl עם מים nuclease חינם. לשבב ה- DNA, תווית שלושה צינורות 200, 100 ו -50 ולהוסיף 200 μl, 100 μl ו -50 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך נפח סופי 200 μl עם מים nuclease חינם.
- בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8).
- חותך את הקרום לגודל של מנגנון כתם חריץ. טרום להרטיב את הקרום וניירות סופג ב20x SSC לפני ולפני הוספת ה- DNA. להרכיב אותם למנגנון כתם חריץ על פי הפרוטוקול של היצרן.
- DNA Pipet מצעד 2.5.2 לחריצים מתאימים. החל ואקום לאט למשוך את ה- DNA על הממברנה זטה-בדיקה. תפסיק ואקום לאחר כל הדגימות שעברו במנגנון.
- לפרק את המנגנון ולשתק באופן מיידי את ה- DNA על הממברנה באמצעות crosslinker UV. יש צד DNA בcrosslinker UV ולהשתמש autocrosslink ההגדרה בcrosslinker. עקוב הפרוטוקול של היצרן.
- זיהוי BrdU על כתם החריץ על ידי ביצוע מערבי סופג.
- חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש ללא שומן PBS המכילים 0.1% Tween-20 (PBST) במשך שעה 1 ב RT כדי למנוע שאינו ספציפי המחייב של נוגדנים לממברנה.
- להוסיף נוגדן ראשוני נגד BrdU (1: 500 דילול) בדילול מלא בחלב 1% יבשים ללא שומן בPBST דגירה הכתם עם הנוגדן הראשוני עבור 3 שעות ב RT על שייקר. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה הנוגדן הראשונית.
- הוסף נוגדן המשני אנטי עכבר HRP-מצומדות לכתם (1: דילול 5000) ולדגור על RT עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה נוגדנים משני.
הערה: השתמש בנפח מספיק של הנוגדנים כדי לכסות את הקרום במהלך incubations נוגדן הראשוני והמשני לחלוטין.
- מכין את תערובת ECL ולהוסיף אותו לAC הכתםcording לפרוטוקול של היצרן. דגירה הממברנה עם תערובת ECL במשך 5 דקות על RT.
- מניחים את הקרום בקלטת רנטגן, לחשוף את הקרום לסרט X-ray ולפתח את הכתם באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
- לכמת את האות המתקבל עבור קלט וDNA ChIPed לאחר סריקת הכתמים באמצעות תוכנת J תמונה על פי הפרוטוקול של היצרן. לכימות, להשתמש באות שנמצאת בטווח ליניארי של זיהוי על מנת להבטיח דיוק של מדידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע את הספציפיות של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי, תאי fibrosarcoma Hdac1,2 פלורידה / פלורידה וHdac3 פלורידה / פלורידה היו בשימוש. recombinase Cre (Ad-Cre) המכיל אדנווירוס שימש למחוק Hdac1,2 וHdac3 בתאים אלה. זיהום Ad-Cre הבא של Hdac1,2 פלורידה / פלורידה תאים, עלייה חזקה בH4K5ac נצפו. טיפול בתאי נוקאאוט Hdac1,2 עם 233 או 898 לא לגרום לעלייה נוספת בכל H4K5ac המאשר כי 233 ולעכב 898 Hdac1,2 ולא Hdac3 בתאים אלה. לעומת זאת, תוספת של 233 או 898 לתאי נוקאאוט Hdac3 הביאה לעלייה משמעותית בH4K5ac לעומת העלייה ראתה בתאי נוקאאוט Hdac3 בשל השפעה נוספת על רמות H4K5ac כתוצאה מעיכוב של Hdac1,2 ו3. לפיכך, 233 והם 898 Hdac1, מעכבי 2 סלקטיבי. תוצאות אלו מוצגות באיור 1.
כדי לאמת את טכניקת BrdU-שבב חריץ, ניתוח מרדף BrdU הדופק בוצע להסתכל על קינטיקה של טעינת PCNA ל- DNA המתהווה בתאי הלה. התוצאות שלנו הראו כי עמותת PCNA עם DNA המתהווה מתרחשת במהירות תוך 15 דקות ונעלם לאחר מרדף 30 דקות בהסכם עם תוצאות שפורסמו בעבר 13. תוצאות אלו מוצגות באיור 2.
טכניקת BrdU-H4K16ac שבב חריץ-המערבי שימשה לקביעת הסכום של H4K16ac קשור עם DNA המתהווה בהעדר פונקצית HDAC1,2. העשרה חזקה בH4K16ac קשורה עם DNA המתהווה נצפתה בהשוואה לשליטת IgG הארנב (איורים 3 א ו 3 ב). העלייה בH4K16ac הקשורים DNA המתהווה בעקבות עיכוב של פעילויות HDAC1,2 או מציאה של Hdac1,2 מוצגת באיור 3 ג 3D, ו3E.
רמת remodeler הכרומטין SMARCA5 על ה- DNA המתהווה נקבעה באמצעות BrdU-SMARCA5 טכניקת שבב חריץ-מערבי. התוצאות שלנו הראו כי SMARCA5 מקורבים עם DNA המתהווה בתאי יונקים. יתר על כן, עיכוב HDAC1,2 או מציאה של Hdac1,2 לא לשנות את כמות remodeler הכרומטין המתהווה הקשורים DNA SMARCA5 כפי שמוצג באיור 4.
אישור איור 1. ספציפי של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי. ניתוח מערבי של lysates תא השלם שהוכן מHdac1 פלורידה / פלורידה Hdac2 פלורידה / פלורידה או תאי fibrosarcoma Hdac3 פלורידה / פלורידה בעקבות זיהום Ad-Cre וטיפול עם 898 אוטופלו 233. תאים עם 3 מיקרומטר 898 או 233 למשך 24 שעות לאחר זיהום Ad-Cre 48 שעות. נתון זה נגזר מעבודת 6 פרסמו הקודמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דינמיקה של PCNA התאחדות עם DNA ינוקא בתאי הלה. תאי הלה תויגו עם bromodeoxyuridine (BrdU) למשך 30 דקות. תאים אז נשטפו להסיר BrdU ותרבותי בתקשורת מאוגדים ללא BrdU לתקופות נקובות של זמן (מרדף). immunoprecipitation הכרומטין (שבב) בוצע עם אנטיגן גרעין התא אנטי-מתרבה נוגדן (PCNA). ה- DNA שכותרת BrdU הנוכחי בDNA קלט ואלה הקשורים PCNA הוערך בניתוח כתם חריץ באמצעות אנטי-BRDנוגדן U כפי שמוצג באיור 2. נתון זה נגזר מעבודת 6 פרסמו הקודמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אובדן היסטון deacetylase 1 ו -2 עליות H4K16ac במרדף דופק DNA. (AB) Bromodeoxyuridine (BrdU) ינוקא בוצע בתאי הלה וNIH3T3 לקבוע איגוד H4K16ac עם DNA המתהווה בנקודות זמן המצוינות. טופלו תאי NIH3T3 (CD) עם או DMSO או מעכב HDAC1,2 סלקטיבי (898 או 233) למשך 24 שעות. תאים (E) NIH3T3 היו transfected גם עם לא-מיקוד (NT) או Hdac1,2 (H12) siRNA. תאים מ( C - E) תויגו עם BrdU ומשמשיםלשבב עם אנטי-H4K16ac אחרי סופג חריץ. הקרום היה נחקר עם נוגדן אנטי BrdU. מספרים מצביעים לכימות J תמונה של אות BrdU הממוצעת של נפח גבוה ובינוני של השבב ה- DNA הבחין. נתון זה נגזר מעבודת 6 פרסמו הקודמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. SMARCA5 Associates עם ינוקא DNA. כמות SMARCA5 על הכרומטין המתהווה הבאה אובדן תפקוד HDAC1,2 מוצגת. טופלו תאי NIH3T3 או עם מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי (898) או transfected עם ללא מיקוד (NT) או Hdac1,2 (H12) siRNA. תאים תויגו עם BrdU הבא טיפולים הנ"ל ושבב עם אנטי-SMARCA5 או IgG ארנב (ג השליליontrol) בוצע. כרכים גוברים של השבב ה- DNA זוהה על כתם החריץ והקרום היה נחקר עם נוגדן אנטי BrdU. נתון זה נגזר מעבודת 6 פרסמו הקודמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולוגית iPOND האלגנטית 13. בטכנולוגית iPOND, DNA מסונתז חדש שכותרתו עם deoxyuridine אתיל (edu). המצומד ביוטין הוא הוסיף לאחר מכן על edu באמצעות הכימיה לחץ. ה- DNA המתהווה מתויג ביוטין אז immunoprecipitated באמצעות חרוזים streptavidin וחלבוני שיתוף טיהור מזוהה על ידי מערבי סופג. מצד השני, בטכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי שלנו, חלבון או צורה שונה שלה קשור עם DNA המתהווה הוא immunoprecipitated באמצעות חלבון ספציפי או נוגדן צורה ספציפית שונה וכמות ה- DNA המתהווה שכותרת BrdU חייבת החלבון הוא הen נקבע כמותית ידי סופג חריץ-מערבי באמצעות נוגדן אנטי BrdU.
ישנם צעדים קריטיים בפרוטוקול זה שזקוק לתשומת לב מיוחדת. זה קריטי כדי להבטיח שהנוגדן של עניין עובד היטב במבחני שבב סטנדרטיים עם יעילות גבוהה. חשוב לבדוק את היעילות של נוגדן במבחני שבב על ידי כמותיים-PCR לפני ביצוע assay BrdU-CHIP-חריץ-מערבי. על מנת לכמת את טכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי להיות מדויק, דילול סדרתי של ה- DNA שכותרתו BrdU צריך להיות מוחל על כתם חריץ וניתוח מערבי באמצעות הנוגדן אנטי BrdU יש לבצע תחילה כדי לקבוע את הטווח ליניארי של זיהוי. קביעת ריכוז ה- DNA של השבב ו- DNA הקלט מאפשר אחד כדי להבטיח את כמות ה- DNA שכותרת BrdU נמצאת בטווח ליניארי של זיהוי בסופג מערבית. לדוגמא, קבענו 50 ng 12.5 ng של קלט DNA להיות בהטווח ליניארי בניסוי הפיילוט שלנו. כמו כן, אם הריכוז של דגימות השבב הוא גבוה מאוד, זה הכרחי כדי לדלל את ה- DNA השבב לפני ביצוע חריץ. המגבלה של שיטה זו היא ברזולוציה שלה, שהוא תלוי ביעילות של גז הכרומטין. הגז של הכרומטין ידי sonication קובע את קרבתו של חלבון מסוים או הצורה שונה שלה לDNA מסונתז החדש.
בעבר, המחקר של שינויים בהכרומטין ואנזימי שינוי הכרומטין בעת שכפול ה- DNA בתאי יונקים נותר שאלה קשה להתייחס בשל חוסר הזמינות של טכניקות מתאימות. יתר על כן, מאז מעצר תאי Hdac1,2-null בשלב G1, זה היה קשה לבחון פונקציות לHdac1,2 בתוך S-שלב. במחקר שלנו, שהראינו פונקציות לשני Hdacs אלה בעת שכפול ה- DNA באמצעות שילוב של מעכבים בררניים הראשונים מסוגם כדי לעכב את פעילותם בתוך S-שלב וBrdU השבב-S הרומןהרבה-מערבי טכניקה. בעתיד, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הדינמיקה של חלבוני תגובת נזק לדנ"א ותיקון DNA במזלג נתקע בנוסף ללימוד שינויי היסטון ואנזים שינוי הכרומטין במזלג. יתר על כן, טכניקה זו אינה מוגבלת לתאי NIH3T3 העכבר. טכניקה זו יכולה לשמש בהצלחה בשורות תאים אחרות כדי לחקור כיצד מעכבים אחרים של אנזימים או חלבונים משפיעים שכפול הדנ"א ושינויי הכרומטין מתח מושרה שכפול במזלג השכפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג'ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד"ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
