Abstract
Histondeacetylaser 1 och 2 (HDAC1,2) lokaliseras till platserna för DNA-replikation. I den tidigare studien, med användning av en selektiv inhibitor och en genetisk knockdown-system visade vi nya funktioner för HDAC1,2 i replikationsgaffeln progression och begynnande kromatin underhåll i däggdjursceller. Dessutom använde vi en BrdU-Chip-Slot-västerländsk teknik som kombinerar kromatin immunoprecipitation (chip) av brom-deoxiuridin (BrdU) -märkt DNA med slot blot och västra analyser kvantitativt mäta proteiner eller histon modifiering i samband med begynnande DNA.
Aktivt delande celler behandlades med HDAC1,2 selektiv inhibitor eller transfekterade med siRNA mot Hdac1 och HDAC2 och sedan nysyntetiserade DNA märktes med tymidinanalog bromodeoxiuridin (BrdU). BrdU märkningen gjordes vid en tidpunkt då det inte fanns någon signifikant cellcykelstopp eller apoptos till följd av förlusten av HDAC1,2 funktioner. Efter labeling av celler med BrdU, kromatin immunoprecipitation (chip) i histonacetylering märken eller kromatin-remodeler utfördes med specifika antikroppar. BrdU-märkta input DNA och immunoprecipiterades (eller chiped) DNA därefter fläckvis på ett membran med hjälp av facket blot-tekniken och immobiliserade med hjälp av UV. Mängden i nascent DNA i varje slits därefter kvantitativt utvärderas med hjälp av Western-analys med en anti-BrdU-antikropp. Effekten av förlusten av HDAC1,2 funktioner på nivåerna av nysyntetiserade DNA-associerad histonacetylering märken och kromatin remodeler bestämdes sedan genom att normalisera BrdU-ChIP signal erhållen från de behandlade proverna till kontrollprov.
Introduction
Defekt DNA-reparation och / eller DNA-replikation är en viktig orsak till genomet instabilitet, som kan utlösa celldöd. En enda oreparerad dubbel strängbrott är tillräcklig för att orsaka celldöd 1. Chromatin organisation gående ändras under både replikering och reparera 2,3, och underlåtenhet att upprätthålla epigenetisk information under dessa processer kommer att leda till ett hot mot genomet integritet. Förlust av HDAC3 eller HDAC1,2 funktion hindrar S-fas progression, DNA-replikation och reparation som leder till genotoxisk stress (DNA-skada) och celldöd 4-9. Det är därför en praktisk strategi för att använda selektiva inhibitorer HDAC att störa replikation, reparation och kromatin i cancerceller och orsakar skador på DNA, vilket i sin tur kan stoppa tillväxt och inducera celldöd selektivt i snabbt växande cancerceller.
Under DNA-replikation, är kromatin snabbt isär och sedan ihop efter DNA dubbelarbete. Nyligen synthesized histon H4 acetyleras på K5 och K12 rester (H4K5K12ac) och efter avsättning på kromatin, de snabbt deacetyleras av histondeacetylaser (HDAC) 10,11. Fel i celler för att upprätthålla nascent kromatin integritet genom histon deacetylering kan leda till gaffel kollaps, vilket i sin tur kan leda till DNA-skada och celldöd. Vi visade nyligen att selektiv hämning av HDAC1,2 ökar histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac och H4K16ac) och hämmar SMARCA5 kromatin remodeler aktivitet på begynnande kromatin, som korrelerar med reducerad replikationsgaffeln progression, ökade gaffel kollaps och ökad replikerings stressinducerad DNA-skada 6 . Sålunda kan behandlingen HDAC-inhibitor förändra nascent kromatinstruktur att utlösa DNA-skada och död mycket snabbt i cancerceller, eftersom dessa celler cykel snabbt och passerar många gånger genom S-fasen. Det är därför viktigt att förstå hur HDAC fungerar för att reglera histonacetylering och protein Binding att upprätthålla DNA-replikation i däggdjursceller.
För att kvantitativt mäta mängden histonacetylering och SMARCA5 kromatin remodeler samband med begynnande DNA under DNA-replikation, utarbetade vi en modifierad ChIP analys kallas BrdU-Chip-Slot-västerländsk teknik. Efter kromatin immunoprecipitation (chip) av ett önskat protein eller histon modifiering, mängden i nascent DNA (märkt med användning av tymidinanalogen, BrdU) i spån provet kan detekteras med användning av Western-analys av BrdU-märkta ChIP-DNA överfördes på ett membran med användning av en slot blot-apparat. Med användning av denna teknik, visade vi att H4K16ac (ett varumärke som deltar i kromatin förpackning) och ISWI familjemedlemmen SMARCA5 (SWI / SNF relaterad matris-associerat aktin beroende regulator av kromatin) kromatin remodeler är associerade med begynnande DNA i S-fas-celler 6. Vi fann också att den begynnande H4K16ac märket deacetyleras av HDAC1,2 under DNA-replikation 6. H4K16ac inhiberarkromatin remodeler aktiviteten för ISWI familjemedlemmen SMARCA5 12. Om man använder BrdU-CHIP-Slot-västerländsk teknik, kan vi koppla funktionerna för HDAC1,2 vid reglering av kromatin remodeling under DNA-replikation. Därför är BrdU-Chip-Slot-Western Blot-tekniken en kraftfull metod för att kvantitativt mäta associations- och dissociations dynamik proteiner eller deras posttranslationella modifieringar som är bundna till begynnande DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kromatin immunoprecipitation (chip) efter BrdU märkning
- Kultur NIH3T3-celler i närvaro av antingen DMSO eller HDAC1,2-selektiva inhibitorer som beskrivits tidigare sex.
- Efter behandling med DMSO eller HDAC1,2 selektiva inhibitorer, lägg BrdU till cellerna i en steril vävnadsodling huva. Inkubera 2 x 10 6 NIH3T3 celler utstrukna i 10 ml NIH3T3 media med en 20 | iM slutkoncentration av bromodeoxiuridin (BrdU) under 60 min i en steril 37 ° C vävnadsodlingsinkubator.
- Tvär intracellulära proteiner till DNA genom tillsats av formaldehyd direkt till odlingsmediet vid en slutlig koncentration av 1%. Inkubera 2 x 10 6 NIH3T3-celler med formaldehyd vid RT under 10 min på en skakanordning.
- Släck tvärbindning genom tillsats av glycin till en slutkoncentration av 125 mM. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min på en skakanordning.
- Ta bort materialet och samla upp celler i PBS i en 15 ml centrifugrör. Spin cells vid 956 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Tvätta cellpelleten två gånger med iskall PBS. Ta PBS från röret. Förvara tvärbundna cellpelleten utan PBS (supernatanten) vid -80 ° C fram till användning.
- Förbered lysatet från den tvärbundna cellpelleten genom tillsats 500 pl FA140 buffert (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 och 0,1% natriumdeoxikolat) kompletterat med proteashämmare cocktail.
- Skeva kromatinet genom sonikering proven fem gånger vid 35% effekt och med 15 sekunder puls, 0,9 sekunder på och 0,1 sekund av inställningen. Håll rören på is efter varje runda av sonikering för att undvika upphettning av proverna.
- Kontrollera klippning på en DNA-gel som skäreffektiviteten kommer att variera mellan olika sonicators. För att kontrollera ultraljudsbehandling, omvänd tvärbindning genom tillsats av NaCl till en koncentration av 0,16 M och utför steg 1.17.1. - 1,22. Kör eluerade 10 | il DNA på en 1,5% agarosgel för att kontrollera om skjuvningen ärmellan 300-700 bp med en medelintensitet på 500 bp.
- Efter ultraljudsbehandling, centrifugera prover för 10 min vid 17.949 xg vid 4 ° C och överför supernatanten till ett nytt rör.
- Utför protein uppskattning med hjälp av kommersiella proteinanalyskitet enligt tillverkarens protokoll. Använd lika stor mängd lysat för chip kontroll och experimentella prover. Generellt använder 1 mg av den totala lysat per Chip reaktion.
- Förbered 50% slurry av protein A-agaros hjälp FA140 buffert innehållande proteashämmare cocktail. Lägg 1/10 volym av proteasinhibitorcocktail den. Beräkna volymen av pärlor som krävs baserat på antalet sampel totalt.
- Tvätta Protein A-agarospärlor med FA140 buffert två gånger för att ta bort lagringsbufferten och tillsätt en lika stor volym till FA140 buffert för pärlorna att göra 50% slurry.
- För att ta bort proteiner som icke-specifikt binder till pärlorna, tillsätt 50 pl av 50% uppslamning av protein A-agaros och icubate proverna vid 4 ° C med konstant ände-över-ände rotation i en spett-blandare under 30 minuter.
- Snurra proverna vid 956 xg vid 4 ° C under en minut. Samla upp supernatanten och utföra immunoutfällning genom tillsats av antingen 8 pl H4K16ac antikropp eller 5 pl (5 ng) av en mg / ml SMARCA5 antikropp till supernatanten. Inkubera vid 4 ° CO / N med konstant ände-över-ände rotation i en spett bländare.
- Spara 1 / 10th av extraktet för "input" kontroll och ställa in den som åt sidan vid -20 ° C. Ingången måste vara omvänd tvärbundna tillsammans med IP-proverna.
- Använd lika stor mängd kanin-IgG (5 pl av en mg / ml) som den negativa kontrollen immunoutfällning prov.
- Följande dag, tillsätt 50 pl av 50% protein A-agaros uppslamning till extraktet och inkubera i 1 timme vid 4 ° C med rotation.
- Pellets agarospärlor genom centrifugering vid 956 xg under 2 minuter vid 4 ° C, försiktigt bort supernatanten och wash pärlorna med följande buffertar sekventiellt. I beredningar buffert, lägga proteashämmare precis innan användning.
- Tvätta med låg salthalt immunkomplex tvättbuffert (FA140, slutkoncentration av 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 och 0,1% natriumdeoxikolat) för 5 min vid 4 ° C med ände-över-ände rotation.
- Tvätta med höga saltimmunkomplex tvättbuffert (FA500, slutkoncentration av 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 och 0,1% natriumdeoxikolat) för 5 min vid 4 ° C med ände-över-ände rotation.
- Tvätta med LiCl immunkomplex tvättbuffert (slutkoncentration av 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 och 0,5% natriumdeoxikolat) under 5 min vid 4 ° C med ände-över-ände rotation.
- Efter tvättningar, såsom beskrivits ovan, tillsätt 200 pl elueringslösning (slutkoncentration av 1% SDS och 100 mM natriumvätekarbonat) och incubate vid RT under 15 min med ände-över-ände rotation vid RT.
- Snurra proverna vid 956 xg vid rumstemperatur och överföra eluatet till en ny 1,5 ml rör. Upprepa steg 1,15 med ytterligare 200 pl elueringslösningen.
- Till 400 | il av eluatet, lägga NaCl till en koncentration av 0,16 M och blanda väl.
- Dessutom till 400 pl elueringslösning till 10 ^ ingång som avsattes (steg 1.11) och tillsätt NaCl till en koncentration av 0,16 M för att vända tvär insampel också. Omvänd tvärbinda proverna genom inkubering i 65 ° C vattenbad i 5 timmar.
- Tillsätt 1 ml 100% EtOH för omvänd-tvärbundna eluatet. Blanda väl och inkubera vid -80 ° C i 2 - 3 timmar eller vid -20 ° CO / N. Snurra proverna vid 17.949 x g under 15 min och kasta etanol.
- Lägg 800 pl 70% etanol för att tvätta pelleten. Snurra vid 17.949 xg under 15 minuter vid 4 ° C och kasta etanol. Snurra kort för att avlägsna eventuell kvarvarande etanol. Lufttorka proverna vid 37 ° C under en0 min för att avlägsna rester av etanol.
- Upplös DNA i 90 ^ il RNas och DNas fritt vatten och tillsätt 2 pl 10 mg / ml RNas vid en 0,2 mg / ml slutkoncentration. Inkubera vid 37 ° C i vattenbad i 30 minuter.
- Lägg 10 pl 10x Proteinas K-buffert (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS). Blanda väl och tillsätt 1 pl proteinas K. Inkubera vid 42 ° C under 1 timme.
- Rena ingång och ChIP DNA med kommersiella PCR-reningskit enligt tillverkarens protokoll och eluera DNA i 50 pl vatten. Butiks DNA vid -20 ° C tills vidare användning.
2. Slot Blot analys av chip DNA
- Mät utbytet av indata och Chip-DNA eluerades i 50 | al vatten såsom beskrivits i steg 1,22 med användning av en spektrofotometer vid 280 nm, enligt tillverkarens protokoll.
- Ta lika stora volymer (50 | il) för ingående eller immunoprecipiterade DNA som finns inom det linjära området för upptäckt.
- Till exempel, om ingångDNA avkastning är 1,5 ng / l, sedan ta 30 pl (eller 45 ng totalt DNA) och gör volymen till 50 pl med vatten. För faktor Chip, ta hela 50 il eluat från steg 2,1 och fortsätt till steg 2.3.
- Denaturera 50 pl ingång eller immunutfälldes DNA genom tillsats av 2,5 volymer av 0,4 N NaOH, kort virvel och centrifugera i 956 xg under 10 sek, och inkubera vid RT i 30 min.
- Neutralisera denaturerat DNA genom att tillsätta 175 pl av 1 M Tris-HCl, pH 6,8, virvel, centrifugera för 956 x g under 10 sek och placera proven på is.
- Bered en serieutspädning av input och immunutfälldes DNA för slöt blot-analys såsom beskrivs nedan.
- Följ steg 2,3-2,4 för att få en total provvolym på 350 ul (dvs 50 ul Input / ChIP DNA, 125 pl 0,4 N NaOH, 175 pl 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
Obs! För den instans som anges ovan, kommer 45 ng ingångs DNA hamna 0,129 ng / l. - För inmatning DNA, märka tre rörar som 100, 50 och 25 och tillsätt 100 | il, 50 | il och 25 pl av den denaturerade och neutraliserade DNA-prov. Gör den slutliga volymen till 100 pl med nukleasfritt vatten. För ChIP DNA, etikett tre rör som 200, 100 och 50 och tillsätt 200 pl, 100 pl och 50 pl av den denaturerade och neutraliserade DNA-prov. Gör slutliga volymen till 200 pl med nukleasfritt vatten.
- Följ steg 2,3-2,4 för att få en total provvolym på 350 ul (dvs 50 ul Input / ChIP DNA, 125 pl 0,4 N NaOH, 175 pl 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
- Skär membranet till storleken på slöt blot-apparat. Pre-väta membranet och läskpapper i 20x SSC före och innan du lägger DNA. Montera dem i Slot Blöt apparat enligt tillverkarens protokoll.
- Pipet DNA från steg 2.5.2 i lämpliga platser. Applicera vakuum långsamt för att dra DNA på zeta-sondmembran. Stoppa vakuum efter alla prover har passerat genom apparaten.
- Demontera apparaten och omedelbart immobilisera DNA på membranet med hjälp av en UV-tvärbindningsmedel. Ha DNA sidan upp i UV tvärbindningsmedel och använda autocrosslink inställning i tvärbindningsmedlet. Följ tillverkarens protokoll.
- Detect BrdU på slöt blöt genom att utföra western blotting.
- Blockera membranet med 5% fettfri torrmjölk i PBS innehållande 0,1% Tween-20 (PBST) under 1 h vid RT för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar till membranet.
- Lägg primära anti BrdU-antikropp (1: 500 utspädning) utspädd i 1% fettfri torrmjölk i PBST och inkubera blotten med den primära antikroppen för 3 h vid RT på en skakare. Tvätta membranet med PBST tre gånger efter den primära antikroppen inkubation.
- Lägg HRP-konjugerad anti-mus sekundär antikropp till blotten (1: 5000 spädning) och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Tvätta membranet med PBST tre gånger efter den sekundära antikroppen inkubation.
NOTERA: Använd tillräckligt med volym av antikropparna för att helt täcka membranet under primära och sekundära inkuberingar antikropps.
- Förbered ECL mix och lägga till den i blöt acligt tillverkarens protokoll. Inkubera membranet med ECL-mix för 5 min vid RT.
- Placera membranet i en röntgenkassett, exponera membranet för röntgenfilm och utveckla blotten med användning av tillverkarens protokoll.
- Kvantifiera den signal som erhålls för inmatning och chiped DNA efter skanning blott hjälp av Image J programvara enligt tillverkarens protokoll. För kvantifiering, använder den signal som ligger inom det linjära området för detektering, för att säkerställa noggrannhet vid mätning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma specificiteten för HDAC1,2-selektiva hämmare var Hdac1,2 FL / FL och Hdac3 FL / FL fibrosarkomceller används. Adenovirus-innehållande Cre-rekombinas (Ad-Cre) användes för att ta bort Hdac1,2 och Hdac3 i dessa celler. Efter Ad-Cre infektion av Hdac1,2 FL / FL celler, en robust ökning av H4K5ac observerats. Behandling av Hdac1,2 knockout-celler med 233 eller 898 resulterade inte i någon ytterligare ökning av H4K5ac bekräftar att 233 och 898 hämmar Hdac1,2 och inte Hdac3 i dessa celler. I motsats därtill tillsats av 233 eller 898 till Hdac3 knockout-celler resulterade i en signifikant ökning av H4K5ac jämfört med ökningen ses i Hdac3 knockout-celler på grund av en additiv effekt på H4K5ac nivåer som ett resultat av hämning av Hdac1,2 och 3. Följaktligen, 233 och 898 är Hdac1, 2-selektiva hämmare. Dessa resultat visas iFigur 1.
För att validera BrdU-Chip-Slot teknik, var BrdU-puls chase analys för att titta på kinetiken av PCNA lastades på den begynnande DNA i HeLa-celler. Våra resultat visade att PCNA association med begynnande DNA sker snabbt inom 15 minuter och försvinner efter en 30 minuters chase i samförstånd med tidigare publicerade resultat 13. Dessa resultat visas i figur 2.
BrdU-H4K16ac Chip-slot-väst teknik användes för att bestämma mängden H4K16ac associerade med begynnande DNA i frånvaro av HDAC1,2 funktion. En robust anrikning i H4K16ac associerad med nascent DNA observerades jämfört med kanin-IgG-kontroll (Figur 3A och 3B). Ökningen av nascent DNA-associerad H4K16ac efter inhibering av HDAC1,2 aktiviteter eller knockdown av Hdac1,2 visas i fig 3C 3D och 3E.
Nivån på SMARCA5 kromatin remodeler på begynnande DNA bestämdes med användning av BrdU-SMARCA5 Chip-Slot-västerländsk teknik. Våra resultat visade att SMARCA5 förknippar med begynnande DNA i däggdjursceller. Dessutom gjorde HDAC1,2 hämning eller knockdown av Hdac1,2 inte ändra mängden begynnande DNA-associerad SMARCA5 kromatin remodeler som visas i Figur 4.
Figur 1. Bekräftelse av specificitet HDAC1,2-selektiva hämmare. Western-analys av hela cellysat framställda från Hdac1 FL / FL HDAC2 FL / FL eller Hdac3 FL / FL fibrosarkomceller efter Ad-Cre-infektion och behandling med 898 eller233. Cellerna behandlades med 3 | iM 898 eller 233 för 24 h efter en 48 h Ad-Cre-infektion. Denna siffra kommer från våra tidigare publicerade arbeten 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Dynamics of PCNA Association med Nascent DNA i HeLa-celler. HeLa-celler märktes med bromodeoxiuridin (BrdU) under 30 minuter. Cellerna tvättades sedan för att avlägsna icke-inkorporerad BrdU och odlades i medium utan BrdU i angivna tidsperioder (chase). Kromatin immunoprecipitation (chip) utfördes med anti-pcna (PCNA) antikropp. BrdU märkt DNA närvarande i inmatnings DNA och de som är associerade med PCNA bedömdes i slöt blot-analys med användning av en anti-BrdU-antikropp som visas i Figur 2. Denna siffra kommer från våra tidigare publicerade arbeten 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Förlust av histondeacetylas 1 och 2 Ökningar H4K16ac på Nascent-DNA. (AB) Bromodeoxyuridine (BrdU) puls chase utfördes i HeLa- och NIH3T3-celler för att bestämma associationen av H4K16ac med begynnande DNA vid de angivna tidpunkterna. (CD) NIH3T3-celler behandlades med antingen DMSO eller en HDAC1,2-selektiv inhibitor (898 eller 233) för 24 timmar. (E) NIH3T3-celler antingen transfekterades med icke-inriktning (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler från (C - E) märktes med BrdU och användsför ChIP med anti-H4K16ac följt av Slot-blotting. Membranet sonderades med anti-BrdU-antikropp. Siffrorna anger till bild J kvantifiering av den genomsnittliga BrdU signal med hög och medelhög volym av Chip DNA fläckig. Denna siffra kommer från våra tidigare publicerade arbeten 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. SMARCA5 Associates med Nascent-DNA. Mängden SMARCA5 på begynnande kromatin efter förlust av HDAC1,2 funktionen visas. NIH3T3-celler behandlades antingen med en HDAC1,2-selektiv hämmare (898) eller transfekterade med icke-inriktning (NT) eller Hdac1,2 (H12) siRNA. Celler märktes med BrdU efter de ovan nämnda behandlingar och chip med anti SMARCA5 eller kanin-IgG (negativ cKONTROLL) utfördes. Ökande volymer av ChIP DNA fläckvis på slöt blöt och membranet sonderades med anti-BrdU-antikropp. Denna siffra kommer från våra tidigare publicerade arbeten 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta manuskript är en relativt snabb metod för att påvisa förekomsten av proteiner eller deras posttranslationellt modifierade former på nyligen replik eller begynnande DNA. Dessutom tillåter denna teknik en för att mäta association-dissociationskinetik av ett protein eller dess modifierade form med begynnande DNA. Denna teknik är komplementär till den eleganta iPOND teknik 13. I iPOND tekniken, är nyligen syntetiserat DNA märkt med etyl deoxiuridin (EDU). En biotinkonjugat sätts sedan på edu använder klickkemi. Biotin-märkta begynnande DNA sedan immunoprecipiteras använder streptavidinpärloma samt co-rening av proteiner detekteras genom western blotting. Å andra sidan, i vår BrdU-Chip-Slot-västerländsk teknik, är ett protein eller dess modifierad form i samband med begynnande DNA immunutfälldes med användning av protein specifika eller modifierad form-specifik antikropp och mängden BrdU-märkta begynnande DNA bunden till protein är then bestämd kvantitativt genom Slot-Western blotting med användning av en anti-BrdU antikropp.
Det finns viktiga steg i detta protokoll som kräver särskild uppmärksamhet. Det är kritiskt för att säkerställa att antikroppen av intresse fungerar bra i standard ChIP-analyser med en hög verkningsgrad. Det är viktigt att testa effektiviteten av en antikropp chip analyser av kvantitativa-PCR innan du utför BrdU-CHIP-Slot-Western analys. För kvantifiering av BrdU-CHIP-slot-väst teknik för att vara korrekt, bör en serieutspädning av BrdU-märkta DNA appliceras på slöt blöt och Western-analys med användning av anti-BrdU-antikropp bör inledningsvis göras i syfte att bestämma det linjära området för upptäckt. Fastställande av DNA-koncentration av ChIP och inmatning DNA möjliggör en för att säkerställa att mängden av BrdU-märkta DNA ligger inom det linjära området för detektering i Western blotting. Till exempel har vi fastställt 50 ng till 12,5 ng ingångs DNA att vara idet linjära området i vår pilot experiment. Även om koncentrationen av de flisprover är mycket hög, är det absolut nödvändigt att späda ChIP-DNA innan utför slits. Begränsningen av denna teknik är dess resolution, som är beroende av effektiviteten i kromatin klippning. Skjuvningen av kromatin genom sonikering bestämmer närhet av ett givet protein eller dess modifierad form till den nyligen syntetiserade DNA.
Förr i tiden, studiet av förändringar i kromatin och kromatin-modifierande enzymer under DNA-replikation i däggdjursceller förblev en svår fråga att ta itu med på grund av bristande lämpliga metoder. Eftersom Hdac1,2-nollceller gripande i G1-fasen, var det svårt att undersöka funktioner för Hdac1,2 inom S-fas. I vår studie visade vi funktioner för dessa två HDAC under DNA-replikation med en kombination av första-in-class selektiva hämmare för att inhibera sin verksamhet inom S-fasen och den nya BrdU-Chip-Sparti västerländsk teknik. I framtiden skulle denna teknik även användas för att studera dynamiken i DNA-skador respons och DNA-reparation proteiner vid den avstannade gaffel förutom att studera histon ändringar och kromatin-modifierande enzym vid vägskälet. Dessutom är denna teknik inte begränsat till mus-NIH3T3-celler. Denna teknik kan användas med framgång i andra cellinjer i syfte att undersöka hur andra hämmare av enzymer eller proteiner påverkar DNA-replikation och replikering stressinducerade kromatin ändras vid replikationsgaffeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbetet i detta manuskript stöddes av medel från Institutionen för strålningsonkologi och Huntsman Cancer Institute och National Institute of Health bidrag (R01-CA188520) till SB. Jag tackar Danielle Johnson och Steven Bennett i mitt labb för att visa protokollet och förklara dess fördelar. Jag är tacksam mot Dr Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) för kritiska synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
