We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
يستخدم بشكل واسع نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) للحصول على فهم أفضل للمهام الخلوية في الخلايا الحية مع ارتفاع القرار الزمني والمكاني 1. في الحنق، يتم نقل الطاقة من fluorophore المانحة متحمس لfluorophore المتقبلة. كفاءة الحنق تعتمد بشدة على المسافة بين الجهات المانحة وfluorophore متقبل وميولهم وبالتالي فهي قراءات حساسة للتغيرات متعلق بتكوين التي تؤثر على fluorophores اثنين. واستغلال هذه الظاهرة لتوليد أجهزة الاستشعار مقرها الحنق من أجل التصوير من جزيئات صغيرة. يمكن رصد التغيرات في التركيز، حيث الزيادات / النقصان في نسبة كثافة الانبعاثات من متقبل مقابل fluorophore المانحة 2. على سبيل المثال، أجهزة الاستشعار الكالسيوم تستند الحنق، تسمح للكشف سريع ومستقر تركيزات الكالسيوم الحرة في الخلايا الحية 3. المزايا الأخرى لهذه الأجهزة القائمة على الحنق، والتصوير في الخلايا الحية واحدة، روريث غير الغازية، قدرتها على أن تكون موجهة إلى أنواع مختلفة من الخلايا والأجزاء الخلوية (4).
لا تزال غير مفهومة العديد من ديناميات حامض الصفراء الخلايا الجوانب. على سبيل المثال، لا يعرف الكثير عن آلية التنظيم الأساسي للنقل حامض الصفراء مترافق واللامقترن. التقنيات المتاحة لرصد هذا النقل يجعل المقام الأول استخدام والصحفيين على luciferase المراسل، والأحماض الصفراوية رديولبلد، أو الفلورسنت النظير الحامض المراري. يتطلب هذا الأخير تعديل الأحماض الصفراوية، وربما تؤثر على ممتلكاتهم. الصحفيين على luciferase المراسل يكون الفقراء قرار الوقت. الى جانب ذلك، هذه التقنيات تؤدي إلى فقدان العينة وغير قابلة للتطبيق للتصوير في زنازين انفرادية. لذلك، قد يكون من المفيد استخدام الأساليب التي تسمح يعيش التصوير خلية واحدة من نشاط النقل باستخدام أجهزة الاستشعار الحنق، لا سيما وأنه يتضمن ميزة الكشف ratiometric 5، 6. بينما المتغيرات من CFP / شكل YFP الأكثر استخداما أزواج الحنق واستراتيجيات جديدة باستخدام شابك وmCherry تحمل طفرات جمعية الذاتي الذي يحفز أدت إلى التوسع في الأدوات الحنق مع أجهزة استشعار جديدة، بما في ذلك الأحمر تحول الصفراء استشعار حمض 7.
أنشأنا سابقا الحنق الصفراء استشعار حمض المشفرة وراثيا (BAS)، التي تتكون من fluorophore المانحة (أزرق) وfluorophore متقبل (السترين) التي تنصهر فيها مع farnesoid X مستقبلات (FXR) يجند مجال الربط (FXR-LBD) والببتيد تحتوي على عزر LXXLL 8. هذا الببتيد الزميلة مع FXR-الائتلاف الحزبي في الصفراوية التي تعتمد على حمض الطريقة. على تفعيل FXR، فإن المسافة بين السترين وأزرق يغير يرجع ذلك إلى تغيير متعلق بتكوين. في خطوط الخلايا الثديية، FXR النتائج التنشيط في زيادة كشفها بوضوح في السترين / نسبة أزرق، بينما يعمل جهاز استشعار النقي في الاتجاه المعاكس مما يؤدي إلى نسبة الحنق انخفضت على تفعيل FXR. هذا الاستشعار (CytoBAS)يسمح رصد عصاري خلوي ديناميات الحامض المراري. بإضافة-الكربوكسيل محطة الزخارف التي تستهدف التحت خلوية، ويمكن أن تستهدف بناء BAS إلى النواة (NucleoBAS) وperoxisomes (PeroxiBAS)، مما يسمح للقياسات تركيز الأحماض الصفراوية في مقصورات الخلوية المختلفة. على الرغم من أن إضافة استهداف عزر peroxisomal لا يضعف قدرته على الاستجابة للأحماض الصفراوية، فإن الخلية نفاذية FXR-بروابط لا تحفز أي الحنق تغيرات PeroxiBAS داخل peroxisomes 8. لأن طبيعة هذا التناقض غير معروفة، وبروتوكول أدناه يركز على CytoBAS وNucleoBAS.
وقد أظهرت استخدام هذا الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا مؤخرا في الخلايا التي تحتوي على النقل الكبد الحامض المراري نا + ببتيد / توروكولات المشارك نقل (NTCP) والعضوية نقل المذاب ألفا / بيتا (OSTαβ) 8. NTCP هو الرئيسي الكبدي المستورد الحامض المراري وOSTαβ هو الصفراوية في الأمعاء basolateralنقل الحمضية التي يمكن أن تعمل على حد سواء باعتبارها المستورد والمصدر يعتمد على حامض الصفراء الكهروكيميائية تركيز التدرج 9، 10. وأظهرت البيانات الأخيرة أن على نقل حامض الصفراء التي NTCP و / أو OSTαβ، ردود قوية وسريعة في نسبة الحنق نتيجة التفاعل يجند FXR-LBD يمكن ملاحظة.
هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة عن طرق لقياس الحنق مثل تحليل متحد البؤر المجهري ومضان خلية تنشيط الفرز (FACS)، تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة، معالجة المشاكل المحتملة ومناقشة طرق بديلة. استخدام هذا الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا، والتفاعل مع حامض الصفراء FXR-LBD يمكن قياس ومراقبة مباشرة في الخلايا الحية، ويوفر طريقة سريعة وبسيطة لتصور النقل الحامض المراري وديناميكية في الوقت الحقيقي. هي البلازميدات التعبير الثدييات ترميز CytoBAS وNucleoBAS المتاحة تجاريا. لذلك، يمكن هذا جهاز الاستشعار البيولوجي كذلك المساهمة فيفهم نقل حامض الصفراء أو المركبات التي تنشط FXR وتوفير أعمق البيولوجيا الحامض المراري والإشارات.
هنا نقدم بروتوكول مفصلة لاستخدام رواية المشفرة وراثيا استشعار الحامض المراري قادرة على رصد ديناميات الزمانية المكانية للنقل حامض الصفراء في الخلايا الحية. يتكون هذا جهاز الاستشعار البيولوجي من البروتينات الفلورية أزرق والسترين التي تنصهر فيها إلى FXR-الائتلاف الحز…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
CytoBAS | Addgene | 62860 | |
NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |