Summary

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

Published: January 04, 2016
doi:

Summary

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

Introduction

Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è ampiamente utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle funzioni cellulari in cellule viventi con alta risoluzione temporale e spaziale 1. In FRET, l'energia da un fluoroforo donatore eccitato è trasferita ad un fluoroforo accettore. Efficienza FRET è fortemente dipendente dalla distanza tra il donatore e accettore fluoroforo e il loro orientamento ed è quindi una lettura sensibile cambiamenti conformazionali che influenzano i due fluorofori. Questo fenomeno viene sfruttato per generare biosensori basati FRET per l'imaging di piccole molecole. Cambiamenti nella loro concentrazione può essere monitorato come aumenta / diminuisce nel rapporto di intensità di emissione del fluoroforo accettore rispetto al donatore 2. Ad esempio, biosensori a base di calcio-FRET consentono il rilevamento veloce e stabile di concentrazioni di calcio liberi nelle cellule viventi 3. Altri vantaggi di biosensori basati su FRET sono imaging singole cellule viventi, terede non invasività, la loro capacità di essere mirata a diversi tipi di cellule e compartimenti cellulari 4.

Molti aspetti della dinamica degli acidi biliari intracellulare sono ancora poco conosciuti. Ad esempio, poco si sa circa il meccanismo di regolazione di base del trasporto degli acidi biliari coniugati e non coniugata. Tecniche esistenti per monitorare questo trasporto in primo luogo fanno uso di giornalisti basati luciferasi-, acidi biliari radioattivi, o gli analoghi degli acidi biliari fluorescenti. Quest'ultima richiede la modifica degli acidi biliari, possibilmente che interessano le loro proprietà. Giornalisti basato luciferasi-hanno scarsa risoluzione temporale. Inoltre, queste tecniche comportano la perdita del campione e non sono applicabili per l'imaging in cellule singole. Pertanto, sarebbe utile usare metodi che consentano vivo imaging cellulare unico di attività di trasporto utilizzando biosensori FRET, soprattutto dal momento che comprende il vantaggio di rilevamento raziometrici 5, 6. Mentre varianti del CFP / form YFP utilizzato più frequentemente coppie FRET, nuove strategie utilizzando Morange e mCherry trasportano mutazioni auto-associazione-inducono hanno portato ad un ampliamento della toolbox FRET con nuovi sensori, tra cui un sensore di acido biliare rosso-spostato 7.

Abbiamo già creato un FRET bile sensore acido geneticamente codificato (BAS), che consiste in un fluoroforo donatore (ceruleo) e un fluoroforo accettore (citrino) che si fonde con il recettore X farnesoid (FXR) ligando dominio di legame (FXR-LBD) e un peptide contenente un motivo LXXLL 8. Questo peptide si associa con il FXR-LBD in maniera acido-dipendente biliari. Dopo l'attivazione FXR, la distanza tra citrino e ceruleo cambierà a causa di un cambiamento conformazionale. In linee cellulari di mammifero, FXR risultati di attivazione in un aumento chiaramente rilevabile nel / rapporto di ceruleo citrino, mentre il sensore purificato opera nella direzione opposta e porta ad un rapporto di FRET diminuita al momento dell'attivazione FXR. Questo sensore (CytoBAS)consente il monitoraggio delle dinamiche degli acidi biliari citosoliche. Con carbossi-terminale aggiunta di motivi di targeting subcellulare, il costrutto BAS può essere mirata al nucleo (NucleoBAS) e perossisomi (PeroxiBAS), consentendo misurazioni delle concentrazioni di acidi biliari nei diversi compartimenti cellulari. Anche se l'aggiunta del motivo di targeting perossisomale non altera la sua capacità di risposta agli acidi biliari, cellulari permeabili FXR-ligandi non ha indotto alcun Fret cambiamenti di PeroxiBAS dentro perossisomi 8. Come la natura di questa discrepanza non è noto, il protocollo seguito è focalizzata su CytoBAS e NucleoBAS.

L'uso di questo sensore FRET geneticamente codificato è stato recentemente dimostrato in cellule contenenti i trasportatori epatici acidi biliari Na + polipeptide / taurocolato co-trasportatore (NTCP) e organica soluto trasportatore alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP è il principale importatore epatica acidi biliari e OSTαβ è un bile intestinale basolateraletrasportatore acido che può funzionare sia come importatore ed esportatore dipende dal gradiente di concentrazione degli acidi biliari elettrochimico 9, 10. Dati recenti hanno mostrato che al trasporto degli acidi biliari da NTCP e / o OSTαβ, risposte robuste e veloci in rapporto FRET come risultato dell'interazione ligando-FXR-LBD possono essere osservati.

Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i metodi per misurare FRET quali confocale analisi microscopica e la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), segnalano passaggi critici, affrontare potenziali problemi e discutere metodi alternativi. L'utilizzo di questo sensore FRET geneticamente codificato, l'interazione degli acidi biliari con FXR-LBD può essere quantificata e monitorata direttamente nelle cellule viventi e fornisce un metodo rapido e semplice di visualizzare trasporto degli acidi biliari e le dinamiche in tempo reale. Plasmidi di espressione di mammifero che codificano CytoBAS e NucleoBAS sono disponibili in commercio. Pertanto, questo biosensore in grado di contribuire ulteriormente allacomprensione dei trasportatori degli acidi biliari o composti che attivano FXR e fornire una più profonda comprensione della biologia e la segnalazione degli acidi biliari.

Protocol

1. Trasfezione transitoria Nota: CytoBAS e NucleoBAS (Vedere materiali Tabella) sono utilizzati con successo in diversi tipi di cellule, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e cellule HEK293T). Il requisito principale di utilizzare il sensore è che deve essere espressa, richiede il DNA codifica per entrare nella cellula. Celle di raccolta da un confluenti 80% 25 cm 2 pallone. Diluire le cellule nel mezzo di coltura completo adatti per la linea cellulare (10% FBS, 1% L-glutamm…

Representative Results

Il sensore FRET-BAS presentato si basa sul dominio di FXR (LBD-FXR) legame ligando attaccato a due fluorofori citrino e cerulee) e un motivo LXXLL. Questo sensore permette indagini trasporto degli acidi biliari in cellule con alta risoluzione spaziale e temporale (Figura 1 A) vivono. Mutazioni in ceruleo e citrino sono stati applicati per promuovere la formazione del complesso intramolecolare (Figura 1 <…

Discussion

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un romanzo geneticamente codificato sensore acido biliare capace di monitorare le dinamiche spazio-temporali di trasporto degli acidi biliari in cellule viventi. Questo biosensore è costituito da proteine ​​fluorescenti cerulee e citrino che sono fusi per FXR-LBD, formando così un sensore acido biliare basato FRET-(BAS).

Bile Acid sensore è relativamente semplice e conveniente in uso quando si ha esperienza di base con co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

Materials

CytoBAS  Addgene 62860
NucleoBAS  Addgene 62861
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) Lonza BE12-614F High glucose without L-glutamine
Penicillin-Streptomycin (pen/strep) Lonza 17-602E
L-glutamine (200mM) Lonza 17-605E
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 102-70
Trypsin-EDTA (10x) Lonza CC-5012
T-25 cell culture flask VWR international 392-0253 Laminin coated
T-175 cell culture flask VWR international 392-0238 Laminin coated
6-well plate VWR international 734-0229 Poly-L-lysine and Laminin coated
10cm dish VWR international 392-0243 Laminin coated
Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran Sigma-Aldrich D9885
Polyethylenimine (PEI)  Brunschwig 23966-2
G418 (geneticin) 50 mg/ml Invitrogen 10131-027
Hygromycin B, 50 mg / ml Invitrogen 10687-010
Cloning cylinder (6×8 mm) Bellco 2090-00608
L-15 Leibovitz culture medium Invitrogen 21083-027 No phenol red
Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube Falcon BD 352008 No cap, non-sterile
Falcon 2063 tubes (5 ml) Falcon BD 352063 Snap cap, sterile
Nunc Lab-Tek 8 well coverglass Thermo scientific 155409 Sterile
Charcoal-filtered FBS Life technologies 12676011
GW4064 Sigma-Aldrich G5172
TCDCA Sigma-Aldrich T6260
CDCA Sigma-Aldrich C9377
Other chemicals Sigma-Aldrich n.v.t.

References

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Cite This Article
Van de Wiel, S., Merkx, M., Van de Graaf, S. Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor. J. Vis. Exp. (107), e53659, doi:10.3791/53659 (2016).

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