Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é amplamente utilizado para obter uma melhor compreensão das funções celulares em células vivas com alta resolução temporal e espacial 1. Na FRET, a energia a partir de um fluoróforo dador animado é transferido para um fluoróforo aceitador. Eficiência de TERF é fortemente dependente da distância entre o fluoróforo dador e o aceitador e a sua orientação e é, por conseguinte, um visor sensível de mudanças conformacionais que afectam os dois fluoróforos. Este fenômeno é explorada para gerar biosensores baseados em FRET para a imagem de pequenas moléculas. Alterações na sua concentração pode ser monitorado à medida que aumenta / diminui na proporção de intensidade de emissão do aceitador em relação ao fluoróforo dador 2. Por exemplo, os biossensores de cálcio baseados em FRET permite a detecção rápida e estável de concentrações de cálcio livres nas células 3 viva. Outras vantagens de biosensores baseados em FRET são imagem latente em células vivas individuais, therdeiro não-invasivo, sua capacidade de ser direcionados para diferentes tipos de células e compartimentos celulares 4.
Muitos aspectos da dinâmica de ácidos biliares intracelular ainda são pouco conhecidos. Por exemplo, pouco se sabe sobre o mecanismo de regulação subjacente de transporte de ácido biliar conjugado e não conjugado. Técnicas existentes para monitorar este transporte fazer uso principalmente de repórteres à base de luciferase, ácidos biliares radiomarcados, ou fluorescentes análogos de ácidos biliares. O último requer a modificação de ácidos biliares, possivelmente afetando suas propriedades. Repórteres à base de luciferase tem resolução de tempo pobre. Além disso, estas técnicas de resultar em perda da amostra e não são aplicáveis para a imagem latente em células individuais. Por isso, seria benéfico utilizar métodos que permitem a imagiologia de célula única ao vivo da actividade de transporte de FRET utilizando biossensores, especialmente uma vez que inclui a vantagem de a detecção raciométrica 5, 6. Embora variantes de CFP / YFP forma mais frequentemente utilizada pares FRET, novas estratégias usando Morange e mCherry transportando mutações auto-associação indutores levaram a uma expansão da caixa de ferramentas FRET com novos sensores, incluindo um sensor de ácido biliar vermelho-deslocada 7.
Nós previamente criado um FRET do sensor geneticamente codificado ácido biliar (BAS), que consiste de um fluoróforo dador (azul celeste) e um fluoróforo aceitador (citrino) que estão fundidos com o receptor X farnesoid (FXR) ligando de domínio de ligação (FXR-LBD) e um péptido que contém um motivo LXXLL 8. Este péptido associados com o FXR-LBD de um modo dependente-ácidos biliares. Após a activação FXR, a distância entre o citrino e azul celeste irá alterar devido a uma alteração conformacional. Em linhas celulares de mamíferos, FXR resultados da activação de um aumento claramente detectável na relação de citrino / azul celeste, enquanto o sensor purificada funciona no sentido oposto e leva a uma diminuição do rácio de FRET após activação FXR. Este sensor (CytoBAS)permite o monitoramento da dinâmica dos ácidos biliares citosólicas. Através da adição do terminal carboxilo de motivos alvo subcelulares, a construção pode ser BAS encaminhada para o núcleo (NucleoBAS) e peroxissomas (PeroxiBAS), permitindo medições de concentrações de ácidos biliares em diferentes compartimentos celulares. Embora a adição do motivo de direccionamento peroxissomal não prejudicar a sua capacidade de resposta aos ácidos biliares, células permeáveis FXR-ligandos não induziu qualquer alteração de FRET PeroxiBAS dentro peroxissomas 8. Como a natureza dessa discrepância é desconhecida, o protocolo abaixo está focada em CytoBAS e NucleoBAS.
A utilização deste sensor de FRET geneticamente codificado foi recentemente demonstrada em células contendo os transportadores de ácido biliar hepáticas Na + / taurocolato de co-transporte polipéptido (NTCP) e soluto orgânico alfa / beta transportador (8) OSTαβ. PNCT é o principal importador de ácido biliar hepática e OSTαβ é um bile intestinal basolateraltransportador de ácido que pode funcionar tanto como um importador e exportador dependente do gradiente de concentração de ácido biliar eletroquímica 9, 10. Dados recentes mostraram que mediante transporte de ácido biliar por NTCP e / ou OSTαβ, respostas rápidas e robustas em relação FRET como um resultado da interacção ligando-FXR-LBD pode ser observada.
Aqui, descrevemos protocolos detalhados para métodos para medir FRET como a análise microscópica confocal e de células activada por fluorescência (FACS), realce passos críticos, face a eventuais problemas e discutir métodos alternativos. Usando este sensor de FRET geneticamente codificado, interacção de ácidos biliares com FXR-LBD pode ser quantificado e monitorada directamente em células vivas e proporciona um método rápido e simples de visualizar transporte de ácido biliar e dinâmica em tempo real. Plasmídeos de expressão de mamífero que codifica CytoBAS NucleoBAS e estão comercialmente disponíveis. Portanto, esse biosensor pode contribuir ainda mais para ocompreensão dos transportadores de ácidos biliares ou compostos que ativam FXR e fornecem uma visão mais profunda da biologia ácido biliar e sinalização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a utilização de um sensor de ácido biliar romance geneticamente codificado capaz de controlar a dinâmica espaço-temporais de transporte de ácido biliar em células vivas. Este biossensor consiste em proteínas fluorescentes cerúleas e citrino que são fundidos para FXR-LBD, formando deste modo um sensor de ácido biliar à base de FRET (BAS).
O Sensor Ácido Bile é relativamente simples e conveniente em uso quando se tem experiência b?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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