Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) широко используется для лучшего понимания клеточных функций в живых клетках с высоким временным и пространственным разрешением 1. В FRET, энергия из возбужденного донора флуорофора передается акцептора флуорофора. FRET эффективность сильно зависит от расстояния между донором и акцептором флуорофора и их ориентации, и поэтому является чувствительным считывания конформационных изменений, которые влияют на два флуорофоры. Это явление использовано для генерации FRET-основанные биосенсоры для визуализации малых молекул. Изменение их концентрации может контролироваться, как увеличение / уменьшение в соотношении интенсивности излучения акцептора по сравнению с донорской флуорофора 2. Например, биосенсоры кальция FRET основе позволяют быстро и стабильного обнаружения концентрации свободного кальция в живых клетках 3. Другие преимущества биосенсоров лобзики основанные визуализации в одиночных живых клеток, тНаследник не-инвазивности, их способность быть направлены на различные типы клеток и клеточных компартментах 4.
Многие аспекты динамики внутриклеточного желчных кислот до сих пор плохо изучены. Например, мало известно о механизме регулирования основного сопряженного и неконъюгированного транспорта желчных кислот. Существующие методы для мониторинга транспорта, прежде всего, это использовать люциферазных основе журналистами, меченных желчных кислот, или аналогов люминесцентных желчных кислот. Последнее требует модификации желчных кислот, возможно, влияющих на их свойства. Люциферазы основе репортеры имеют плохое разрешение по времени. Кроме того, эти методы привести к потере образца и не применимы для работы с изображениями в отдельных клеток. Таким образом, было бы полезно использовать методы, позволяющие живой одного ячейки изображения транспортной активности с помощью FRET биосенсоров, тем более, что она включает в себя преимущество логометрической обнаружения 5, 6. В то время как варианты CFР / YFP форма наиболее часто используется FRET пары, новые стратегии, используя MORANGE и mCherry проведения самоассоциация вызывающие мутации привели к расширению инструментов ладу новых датчиков, в том числе красное смещение датчика желчных кислот 7.
Мы ранее создали генетически закодированного FRET сенсор желчных кислот (BAS), который состоит из доноров флуорофора (небесно-голубого цвета) и акцептора флуорофора (цитрин), которые были присоединены с farnesoid X рецепторов (FXR) лиганда связывающего домена (FXR-LBD) и пептид, содержащий мотив LXXLL 8. Этот пептид связывает с FXR-LBD в кислой-зависимым образом с желчью. После активации FXR, расстояние между цитрин и Лазурная изменит из-за изменения конформации. В клеточных линий млекопитающих, FXR активация приводит четко обнаруживаемым увеличением цитрин / небесно-голубого цвета, а соотношение, очищенный датчик работает в обратном направлении и приводит к снижению коэффициента FRET после активации FXR. Этот датчик (CytoBAS)позволяет осуществлять мониторинг динамики цитоплазмы желчных кислот. По карбоксильной-концевой того субклеточных нацеленных мотивов, БАС конструкция может быть направлена к ядру (NucleoBAS) и пероксисом (PeroxiBAS), что позволяет измерять концентрации желчных кислот в различных клеточных отсеках. Несмотря на то, что добавление пероксисомальной направленную мотив не ухудшает его способность реагировать на желчных кислот, клеточных проницаемые FXR-лиганды не вызывает какой-либо FRET изменения PeroxiBAS внутри пероксисом 8. Как природа этого расхождения неизвестна, протокол ниже ориентирован на CytoBAS и NucleoBAS.
Использование этого генетически кодируемых датчика FRET недавно была продемонстрирована в клетках, содержащих печеночные транспортеры желчных кислот Na + / таурохолат совместно транспортировки полипептид (НПБТ) и органических растворенных веществ транспортера альфа / бета (OSTαβ) 8. НПБТ является основным импортером печени желчных кислот и OSTαβ является базолатеральный кишечного желчикислоты транспортер, который может функционировать как в качестве импортера и экспортера в зависимости от градиента концентрации электрохимического желчных кислот 9, 10. Последние данные показали, что при транспортировке желчных кислот по НПБТ и / или OSTαβ, надежный и быстрый ответ в соотношении FRET в результате лиганд-FXR-LBD взаимодействия можно наблюдать.
Здесь мы опишем подробные протоколы методов измерения FRET, таких как конфокальной микроскопического анализа и флуоресцентной активированный сортировки клеток FACS (), выделите важных шагов, устранения потенциальных проблем и обсудить альтернативные методы. Используя эту генетически кодируемых датчик FRET, взаимодействие желчных кислот с FXR-LBD может быть количественно и контролироваться непосредственно в живых клетках, и обеспечивает быстрый и простой способ визуализации транспорта желчи кислоты и динамику в реальном времени. Млекопитающих плазмиды экспрессии, кодирующие CytoBAS и NucleoBAS имеются в продаже. Таким образом, этот биосенсор может вносить дальнейший вклад впонимание перевозчиков желчных кислот или соединений, которые активируют FXR и обеспечить более глубокое понимание биологии желчных кислот и сигнализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем подробный протокол для использования нового генетически закодированы датчика желчных кислот, способным контролировать динамику пространственно-временные транспорта желчных кислот в живых клетках. Это биосенсор состоит из лазурными и цитрин белков флуоресцен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
