Introduction
Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) широко используется для лучшего понимания клеточных функций в живых клетках с высоким временным и пространственным разрешением 1. В FRET, энергия из возбужденного донора флуорофора передается акцептора флуорофора. FRET эффективность сильно зависит от расстояния между донором и акцептором флуорофора и их ориентации, и поэтому является чувствительным считывания конформационных изменений, которые влияют на два флуорофоры. Это явление использовано для генерации FRET-основанные биосенсоры для визуализации малых молекул. Изменение их концентрации может контролироваться, как увеличение / уменьшение в соотношении интенсивности излучения акцептора по сравнению с донорской флуорофора 2. Например, биосенсоры кальция FRET основе позволяют быстро и стабильного обнаружения концентрации свободного кальция в живых клетках 3. Другие преимущества биосенсоров лобзики основанные визуализации в одиночных живых клеток, тНаследник не-инвазивности, их способность быть направлены на различные типы клеток и клеточных компартментах 4.
Многие аспекты динамики внутриклеточного желчных кислот до сих пор плохо изучены. Например, мало известно о механизме регулирования основного сопряженного и неконъюгированного транспорта желчных кислот. Существующие методы для мониторинга транспорта, прежде всего, это использовать люциферазных основе журналистами, меченных желчных кислот, или аналогов люминесцентных желчных кислот. Последнее требует модификации желчных кислот, возможно, влияющих на их свойства. Люциферазы основе репортеры имеют плохое разрешение по времени. Кроме того, эти методы привести к потере образца и не применимы для работы с изображениями в отдельных клеток. Таким образом, было бы полезно использовать методы, позволяющие живой одного ячейки изображения транспортной активности с помощью FRET биосенсоров, тем более, что она включает в себя преимущество логометрической обнаружения 5, 6. В то время как варианты CFР / YFP форма наиболее часто используется FRET пары, новые стратегии, используя MORANGE и mCherry проведения самоассоциация вызывающие мутации привели к расширению инструментов ладу новых датчиков, в том числе красное смещение датчика желчных кислот 7.
Мы ранее создали генетически закодированного FRET сенсор желчных кислот (BAS), который состоит из доноров флуорофора (небесно-голубого цвета) и акцептора флуорофора (цитрин), которые были присоединены с farnesoid X рецепторов (FXR) лиганда связывающего домена (FXR-LBD) и пептид, содержащий мотив LXXLL 8. Этот пептид связывает с FXR-LBD в кислой-зависимым образом с желчью. После активации FXR, расстояние между цитрин и Лазурная изменит из-за изменения конформации. В клеточных линий млекопитающих, FXR активация приводит четко обнаруживаемым увеличением цитрин / небесно-голубого цвета, а соотношение, очищенный датчик работает в обратном направлении и приводит к снижению коэффициента FRET после активации FXR. Этот датчик (CytoBAS)позволяет осуществлять мониторинг динамики цитоплазмы желчных кислот. По карбоксильной-концевой того субклеточных нацеленных мотивов, БАС конструкция может быть направлена к ядру (NucleoBAS) и пероксисом (PeroxiBAS), что позволяет измерять концентрации желчных кислот в различных клеточных отсеках. Несмотря на то, что добавление пероксисомальной направленную мотив не ухудшает его способность реагировать на желчных кислот, клеточных проницаемые FXR-лиганды не вызывает какой-либо FRET изменения PeroxiBAS внутри пероксисом 8. Как природа этого расхождения неизвестна, протокол ниже ориентирован на CytoBAS и NucleoBAS.
Использование этого генетически кодируемых датчика FRET недавно была продемонстрирована в клетках, содержащих печеночные транспортеры желчных кислот Na + / таурохолат совместно транспортировки полипептид (НПБТ) и органических растворенных веществ транспортера альфа / бета (OSTαβ) 8. НПБТ является основным импортером печени желчных кислот и OSTαβ является базолатеральный кишечного желчикислоты транспортер, который может функционировать как в качестве импортера и экспортера в зависимости от градиента концентрации электрохимического желчных кислот 9, 10. Последние данные показали, что при транспортировке желчных кислот по НПБТ и / или OSTαβ, надежный и быстрый ответ в соотношении FRET в результате лиганд-FXR-LBD взаимодействия можно наблюдать.
Здесь мы опишем подробные протоколы методов измерения FRET, таких как конфокальной микроскопического анализа и флуоресцентной активированный сортировки клеток FACS (), выделите важных шагов, устранения потенциальных проблем и обсудить альтернативные методы. Используя эту генетически кодируемых датчик FRET, взаимодействие желчных кислот с FXR-LBD может быть количественно и контролироваться непосредственно в живых клетках, и обеспечивает быстрый и простой способ визуализации транспорта желчи кислоты и динамику в реальном времени. Млекопитающих плазмиды экспрессии, кодирующие CytoBAS и NucleoBAS имеются в продаже. Таким образом, этот биосенсор может вносить дальнейший вклад впонимание перевозчиков желчных кислот или соединений, которые активируют FXR и обеспечить более глубокое понимание биологии желчных кислот и сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Переходные трансфекции
Примечание: CytoBAS и NucleoBAS (См материалы таблицу) успешно используется в нескольких типов клеток, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK и HEK293T клеток). Главное требование использовать датчик в том, что она должна быть выражена, требуя ДНК, кодирующий, чтобы войти в клетку.
- Урожай клетки от 80% сливной 25 см 2 колбу. Развести клеток в полной культуральной среде, подходящих для конкретного клеточной линии (10% FBS, 1% L-глутамина, 1% Pen / стрептококкового для U2OS и клетках Huh7).
- Пластина клеток в желаемой плотности в стерильный 8 и патрон покровного стекла (0,8 см 2). Цель для суб-сливной (60-80% слияния) слой клеток на день эксперимента, хотя это не является обязательным.
- Добавить полной культуральной среде до конечного объема 400 мкл на лунку. Разрешить клетки приложить в течение 24 часов.
- Готовят смесь трансфекции в стерильную пробирку, добавляя 0,5 мкг NucleoBASили CytoBAS ДНК к 100 мкл культуральной среды (в сыворотке / антибиотик бесплатно). Вихрь хорошо. Добавить трансфекции реагента и перемешать встряхиванием. Трансфекции реагенты, которые дают максимальную эффективность являются тип клеток зависит и может потребовать предварительное тестирование.
- Например, можно использовать 2,5 мкл 1 мг / мл полиэтиленимина (PEI) и инкубируют ДНК / ПЭИ смешать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить трансфекции смесь капелек в клетках и перемешать аккуратно встряхивая планшет, вручную. Добавить 100 мкл смеси для колодца ~ 9,6 см 2. Использование 10 мкл смеси для трансфекции отдельных камер для визуализации временно трансфицированных клеток.
Примечание: После 24-48 часов, клетки будут экспрессировать датчик желчных кислот и могут быть использованы для экспериментов.
2. Стабильная трансфекция
- Урожай клетки от 80% сливной 25 см 2 колбу. Развести осадок в полной культуральной среде, подходящей для конкретной линии клеток (10% фетальной бычьей SErum, 1% L-глутамина, 1% пен / стрептококк для U2OS и клетках Huh7) до концентрации 150000 клеток на мл и добавляют около 300000 клеток на лунку в культуральной пластины 6-луночный (2 мл конечного объема).
- Разрешить клетки приложить в течение 24 часов.
- Готовят смесь трансфекции в стерильную пробирку, добавляя 0,5 мкг CytoBAS или NucleoBAS ДНК (См материалы таблицу) к 100 мкл культуральной среды (в сыворотке / антибиотик бесплатно). Вихрь хорошо. Добавить трансфекции реагента и перемешать встряхиванием.
- Например, можно использовать 2,5 мкл 1 мг / мл полиэтиленимина (PEI) и инкубируют ДНК / ПЭИ смешать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 100 мкл трансфекции смеси в капельках к клеткам и перемешать аккуратно встряхивая планшет, вручную. Всегда включать нетрансфецированной контроль при создании стабильной клеточной линии.
- Рост клеток O / N при 37 ° С, 5% СО 2.
- Trypsinize клетки в соответствии с протоколом производителя (Инкубируйте клетки при 37 ° С WIth 1,5 мл предварительно нагретого трипсина на 25 см 2 клеточной культуре) и спин их при 250 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют клеток в 13 мл полной культуральной среде. Разделите клетки по различным диаметром 10 см культуры блюд: 0,5 мл (низкой плотности), 1,5 мл (средняя плотность), и 4,5 мл (высокой плотности). Сделайте то же самое для оставшихся 6,5 мл.
- Добавить культуральную среду до конечного объема 10 мл. Для U2OS клеток, используют в дозе 800 мкг / мл G418 для плазмид с неомицина кластера резистентности, такие как CytoBAS и NucleoBAS конструкции, чтобы выбрать для положительных клеток. Это концентраций тип клеток зависит и может быть определена путем выбора наименьшей антибиотик (G418) Концентрация где нетрансфицированные клетки погибали в течение 2 до 10 дней (800 мкг / мл G418 для U2OS клеток).
- Обновить культуральной среды с соответствующей антибактериальной (G418) каждый час до тех пор, 72 нетрансфицированные клетки не мертвы.
- Осмотрите культуры пластины под микроскопом с целью 20X дляположительные колонии (флуоресценции можно контролировать с помощью большинства наборов фильтров, используемых для зеленого, голубого или желтого флуоресценции).
- Отметить положительные колонии, которые лежат изолирован от других колоний с ручкой на наружной нижней части чашки для культивирования.
- Промыть пластины в два раза фосфатно-солевым буфером (PBS) и аспирации его. Возьмите около 15 стерильных цилиндров клонирования и опустите их в стерильный силикон. Применяют их вокруг отобранных колоний легким нажатием против чашки Петри и убедитесь, что не более одной колонии входит в клонирующий кольца.
- Внесите 20 мкл подогретого трипсин (1x, 0,25%) в клонирования цилиндра и инкубировать при 37 ° С до тех пор, большинство клеток имеют округлые до (не наблюдать с помощью микроскопа).
- Добавить 150 мкл культуральной среды с сывороткой и соответствующий антибиотик (10% FBS и 800 мкг / мл G418 для U2OS и Huh7 клеток) в клонирования цилиндр и пипетки вверх и вниз несколько раз для ресуспендирования клеток и передаче в 96-а пластина. Обновить среду после 4-24 ч и позволяют клеткам расти сливающиеся в ближайшие несколько дней (37 ° C, 5% СО 2 в течение U2OS и Huh7 клеток).
- Обновить среду с антибиотиком каждые 3 или 4 дня. Когда клетки уже успели сливающийся, передавать их в большей луночного планшета. Повторите этот шаг, пока культура не является достаточно большим для экспериментов. Криоконсервируют некоторые флаконы для резервного копирования. Криоконсервация среда состоит из 20% FBS и 20% ДМСО в СМИ (DMEM) без добавок.
Примечание: Теперь, клеточная линия моноклональных и считается стабильным для выражения желчных кислот датчик. Половина концентрация антибиотиком G418 (400 мкг / мл), теперь достаточно, чтобы поддерживать экспрессию в стабильной клеточной линии.
3. Лентивирусов Трансдукция
Примечание: Некоторые клеточные линии, считаются трудными для трансфекции с помощью более традиционных методов, таких как метод полиэтиленимина (PEI). Вирусный трансдукция клеток является эффективной альтернативой инструмент еили ген-доставка и стабильная экспрессия трансгена.
- Урожай клетки от 80% сливной 25 см 2 колбу. Развести клетки в полной культуральной среде подходит для конкретной клеточной линии (10% FBS, 1% L-глутамина, 1% Pen / стрептококкового для U2OS и клетках Huh7) и добавить около 200000 клеток на лунку в культуральной пластины 6-луночного.
- Добавить культуральную среду до конечного объема 2 мл на лунку. Разрешить клетки приложить в течение 24 часов.
- Выполнение вирусных каскадов, путем инкубации клеток в течение 4-6 ч с 500 мкл CytoBAS лентивирусов, содержащие среду (предоставляется по запросу), заполненный до общего объема 1 мл с полным культуральной среде, содержащей 10 мкг / мл диэтиламиноэтил (DEAE) -dextran или другой лентивирусов трансдукция усилитель. Не забудьте включить в колодец с untransduced контрольных клеток.
- Удалить среду и добавляют 2 мл полной культуральной среды, содержащей требуемый антибиотик (500 мкг / мл гигромицину). Используйте Lentiviral конструкцию для CytoBAS трансдукции, которые обеспечиваютс гигромицину в клетки. Рост клеток при желаемых условиях.
- Обновить среду с (500 мкг / мл гигромицину) антибиотик раз в 3 дня и разделить клетки, когда 80% сливной, пока все негативные контрольные клетки не мертвы (занимает около 1-2 недель для большинства клеточных линий). Клеточная линия в настоящее время считается стабильным для выражения желчных кислот датчик.
- Кроме того, использование клеток для экспериментов 1-3 дней после вирусной трансдукции. Как живой вирус может присутствовать, это требует лобзики считывания оборудование в помещениях с соответствующим уровнем безопасности.
- Кроме того, для быстрого выделения стабильных клеточных линий, выполнить сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS).
- Урожай клетки от сливной 160 см 2 колбу.
- Развести клеток в культуральной среде Лейбовиц (L-15) с средних <5% сыворотки до концентрации не более 5 × 10 6 клеток на мл
- Для сбора сортированных клеток, FACS заполнения трубы с 1 мл среды (сбор L-15 среда + 1,5% перо / стрептококк, 1% L-перенасыщение и 20% сыворотки).
- Сортировать клетки для цитрин (520-580 нм) или Cerulean (450-520 нм), возбужденных с 405 лазера.
- После сортировки примерно 500000 клеток, спин вниз клеток (5 мин, 250 мкг) и ресуспендируют их в 5 мл нормального полной культуральной среде (10% FBS, 250 мкг / мл гигромицину для U2OS и Huh7 CytoBAS клеток) и пластины их в T25 культуры колбы. Рост клеток при желаемых условиях (37 ° С, 5% СО 2 в течение U2OS и клетках Huh7).
4. Живая изображений сотовый от желчных кислот датчика
Примечание: Клетки, содержащие транспортеров желчных кислот могут быть культивировали в среде с 1-10% активированным углем, который удаляет сыворотке липофильных соединений. Нормальная сыворотка часто содержит желчные кислоты, что может привести к накоплению внутриклеточного желчных кислот и насыщения желчных кислот датчика.
- FRET измерения с помощью конфокальной микроскопии
- Пластина клеток, стабильно или transiently выражения датчик на нужной плотности в стерильной 8 а покровное дном камеры слайд (0,8 см 2). Рост клеток в полной культуральной среде (с использованием активированным углем сыворотки), так что на день эксперимента, конфлюентности около 60-70%.
- Вымойте прилипшие клетки в камере слайд один раз 200 мкл 1X PBS или Лейбовиц L-15 культуральной среде.
- Аспирируйте и заменить 300 мкл L-15 культуральной среде Лейбовиц, так что никакого контроля СО 2 не является необходимым.
Примечание: DMEM без фенолового красного может также использоваться, но требует СО 2 в буфере условий. Шоу датчик желчных кислот (некоторые) рН-чувствительность так стремимся поддерживать постоянную рН в течение сбора данных. - Развести соединений, которые будут использоваться в эксперименте конфокальной изображений также в L-15 культуральной среде. Следует учитывать, что во время съемки, относительно большие количества жидкости в камерах должны быть добавлены, чтобы обеспечить быстрое перемешивание образца (50-100 мкл),поэтому убедитесь, 3-5x решения.
- Запустите программное обеспечение визуализации конфокальной микроскопии с 37 ° С инкубационной камере и включите нм лазера фиолетовый 405. Нанесите каплю иммерсионного масла на цели и разместить 8-камеру поверх него. Для одного сотового визуализации FRET, используйте масла цель 63x. Датчик был успешно использован при комнатной температуре, но поведение клеток может быть изменен.
- Установите параметры конфокальной микроскопии должным образом.
- Установить режим съемки: XYT (покадровой визуализации одного фокальной плоскости).
- Получение изображений на 20-секундными интервалами, чтобы соединения, которые будут добавлены между приобретений, не останавливаясь эксперимент.
- Установите спектральный диапазон для обнаружения излучения: Небесно-голубого цвета: 450-520 нм; Цитрин: 520-580 нм.
- Сосредоточьтесь на одном слое клеток с использованием просвечивания свет. Начните изображений и более точно настроить Z-позицию. Отрегулируйте усиления и смещения для каждого канала, чтобы отличить сигнал от фона пока остаютсяING ниже насыщения для всех пикселей в клетках интерес.
- Нарисуйте круги определить область интереса (ROI). Выберите ячейки, которые показывают аналогичную интенсивность флуоресценции. Избегайте клетки, которые, очевидно, отличается от среднего клетки по размеру и форме. Expose клетки к свету в течение времени, как можно короче, чтобы минимизировать фотообесцвечивания датчика. Желательно, чтобы обратить трансформирования не очень близко к клеточной периметру. Этот район является наиболее чувствительным к изменениям в интенсивности флуоресценции из-за фокусного дрейфа (клеток, движущихся в направлении оси г), что делает его более трудным для мониторинга изменений в соотношении флуоресценции во время эксперимента.
- Начните измерения с конфокальной микроскопии. Подождите, пока лазурный и цитрин флуоресценции не является стабильным.
- Добавить 50-100 мкл желчные кислоты или других соединений на выбранных временных точках при измерении. Относительно высокие количества жидкости (от одной пятой до одной трети конечного объема) необходимо смешать жидкости и (в течение 10 секунд) без встряхивания / рipetting вверх и вниз. Убедитесь, чтобы не прикоснуться к краю 8-а камера с кончика пипетки и добавить жидкость медленно, так что клетки не получают в фокусе. Не добавляйте новые соединения, прежде чем фаза плато достигается. Это занимает около 200 сек.
- Конец каждого эксперимента с добавлением 100 мкл GW4064, конечная концентрация 5-10 мкМ (датчик насыщения доза) и подождите, пока датчик не флуоресценции является стабильной.
- Сохранить эксперимент и экспортировать данные в виде файла .AVI.
- Открыть в ImageJ как файлы AVI (канал 00, лазурный, канал 01, цитрин), выбрав Плагины> Стеки> Stack перемежения. Кроме того, импорт конфокальной файл (например, .lsm или .lif файлы) непосредственно в Image J, используя соответствующие плагины (имеется в http://www.openmicroscopy.org) и переходите к шагу 4.1.14.
- Для Стек 1: использовать канал 01 (цитрин).
- Для Stack 2: использовать канал 00 (лазурный).
- Нажмите на Edit> Выбор> Добавитьменеджера, чтобы открыть окно менеджера ROI. Установите флажок "Показать все".
- Нарисуйте несколько регионов, представляющих интерес (трансформирования), охватывающих конкретные клетки овальной инструмента отбора. Также сделать один круг в зоне за пределами клеток или внутри клетки, что не выразить датчик для определения фонового сигнала. Желательно, чтобы обратить трансформирования не очень близко к клеточной периметру в экспериментах, когда изменения в интенсивности флуоресценции из-за фокусного дрейфа (клеток, движущихся в направлении оси г) или миграции клеток были очевидны.
- Выберите одну ячейку. Нажмите на Плагины> Ratio Profiler. Это приведет к 3 экранах: RAW, отношение и Ratio_Profile. RAW-окно показывает увеличение интенсивности цитрин (синяя линия) и уменьшение небесно-голубого цвета (красной линии), если есть ладу. Окно Коэффициент дает информацию о соотношении цитрине / небесно-голубого цвета, который будет увеличиваться с увеличением FRET. Окно Ratio_Profile дает реальные цифры интенсивности флуоресценции, измеренной в обоих каналах. Если микроскопиисправиться настройки конкретных файлов (например, .lsm или .lif вместо .avi) используются файлы порядок каналов может быть отменено.
- Копирование данных из окна Ratio_Profile в таблице прикрепленной в качестве дополнительных данных. Сделайте то же самое для всех других клеток (и фона ROI).
Примечание: В интернет-таблицы, все данные нормированы на состояния, при котором активация максимальная BAS ожидается. Учитывая, что GW4064 является самым мощным активатором FXR, отношение флуоресценции после инкубации с профицитом GW4064 устанавливается в 1. Поэтому важно, чтобы в конечном всех экспериментах с добавлением GW4064. Преимущество этого в том, что данные больше не зависит от интенсивности лазерного или усиления детектора и экспериментов в различные дни, можно сравнить более легко. Кроме того, в нижней графе таблицы, скользящее среднее может использоваться для сглаживания кривые экспериментального шума. Однако, не используйте этот график при анализе кинетических данных, поскольку работает AveraGE будет также гладкие быстро кинетические ответы.
- FRET измерения с помощью флуоресцентной Активированный сортировки клеток (FACS)
- Развести все соединения для эксперимента FACS в стерильные FACS буфере (поглощения 0,3 мМ ЭДТА, 0,5% BSA, 0,01% NaN 3 и 10 мМ D-глюкозы).
- Урожай клеток из см2 клеточной культуры колбы 80% сливной Т-160 с использованием 5 мМ ЭДТА в PBS. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 5 мин. Вымойте осадок клеток 2x в 5 мл FACS буфера захвата при комнатной температуре.
- Граф клеток с использованием счетчика частиц или Счетной палаты.
- Развести осадок в FACS буфере захвата до концентрации 1 × 10 6 клеток / мл. Пипетировать вверх и вниз, чтобы создать гомогенную суспензию отдельных клеток. Если клетки трудно выделить, положить образцы через ячейки сетчатого фильтра перед сортировкой, чтобы минимизировать засорение сопла.
- Внесите 200 мкл клеток на FACS трубы и защитить их от света.
- Добавить желаемой концентрации соединения (например,, Желчные кислоты, синтетические FXR лиганды, ингибиторы транспортера). Вихрь. Инкубируют в течение 20-30 мин при комнатной температуре при встряхивании (в темноте).
- Между тем, начать FACS (лазеры нужно время, чтобы разогреться).
- Установите проточной цитометрии параметров стробирующих для эксперимента (рисунок 3):
- Загрузите вокруг 100,000-200,000 NucleoBAS или CytoBAS трансфекции клеток, чтобы определить, ворота.
- Сначала настройте напряжения FSC и SSC для построения клеток в центре сюжета.
- Использование фиолетовый лазер, отрегулируйте Лазурная (450/40 нм) (525/20 нм) напряжения значение напряжения и цитрин и убедиться, что все NucleoBAS или CytoBAS позитивные клетки нанесены в диаграммы рассеяния.
- Установите правильные ворота (ворота P1 до P4) Ворота, рисунок 4.
- Используйте ворота P1, чтобы исключить мертвые клетки, как правило, отображаются в левом нижнем углу, выбрав основное население в середине SSC-A / FSC-сюжет.
- Используйте ворота P2 вФСБ-Н / FSC-окно для удаления duplets из анализа. Отдельные клетки представлены в более чем диагональной линии дублетов.
- Ворота Р3 в цитрин (525/20 нм) / лазурный (450/40 нм) окно можно использовать для выбора для NucleoBAS / CytoBAS положительных клеток, по стробирования цитрин и небесно-голубого цвета высокие клетки, население отображается по диагонали в верхнем правом углу сценарий.
- Нарисуйте ворот P4 в верхней левой части населения, как можно ближе и убедитесь, что не более чем 5% клеток попадают в эти ворота.
- Загрузите некоторые нетрансфицированные клетки (не выражение CytoBAS или NucleoBAS), чтобы определить, авто-флуоресценции. Нетрансфицированные населения не могут быть расположены в затворе P3. Отрегулируйте ворот P3, когда это необходимо, чтобы исключить авто-флуоресцентный клетки.
- Vortex образцы перед размещением трубы в FACS. Для каждого образца, измерения по меньшей мере 10000 клеток в затворе P3.
Примечание: Иерархия Окно Население дает ряд мероприятийотображается для каждого ворот и% от родительского ворот. В ворота 4,% от родителей утверждает, клетки с повышенным цитрин / небесно-голубого цвета соотношении в процентах от всех NucleoBAS положительных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Датчик FRET-BAS представлены на основе лигандсвязывающим доменом FXR (LBD-FXR), прикрепленной к двум флуорофоров цитрин и лазурными) и LXXLL мотива. Этот датчик позволяет расследования транспорта желчных кислот в живых клетках с высоким пространственным и временным разрешением (рис 1.). Мутации в лазурный и цитрин были применены к способствовать формированию внутримолекулярной комплекса (рис 1 б). Желчные кислоты и другие лиганды связываются с FXR FXR и тем самым изменять расстояние между цитрин и Лазурная конформационным изменения. В живых клеток млекопитающих, это приводит к увеличению эффективности FRET (увеличение лимонный, небесно уменьшение) (рис 1 С 1 D). Во время живых клеток количественного интенсивности на основе FRET эксперимента с конфокальной микроскопии, ят было отмечено, что таурохенодезоксихолевой кислоты (TCDCA) -обработанной (30 мкм) U2OS клетки, экспрессирующие NucleoBAS недостающие транспортеры желчных кислот не показывают каких-либо изменений в FRET, в то время как средняя лимонный / небесно соотношение увеличилось заметно после лечения GW4064 (5 мкм) (рис 1 С). В отличие от этого, U2OS клетки коэкспрессирующей NucleoBAS, НПБТ и OSTαβ же показывают явное увеличение цитрин / небесно-голубого цвета соотношении при добавлении TCDCA, и даже больший прирост в соотношении после добавления GW4064 (рис 1 D). Это показывает, что TCDCA не может пройти через клеточную мембрану и требует специальных транспортеры, чтобы проникать в клетку.
Клеточной локализации датчика определяется наличием специфических сигналов локализации. NucleoBAS предназначен для ядра по сигналу ядерной локализации (рис <сильный> 2 В), в то время как CytoBAS не содержит какой-либо сигнал локализации и поэтому остается в цитозоле (рисунок 2 A). Биосенсор также могут быть объединены с другими визуализации флуоресцентных белков, что позволяет измерять Экспрессия белка / локализации и активации FXR в одной камере. Например, на фиг.2 показан U2OS С клетки совместно трансфицируют NucleoBAS и НПБТ-mKate2. Кроме того, датчик может также сочетаться с другими датчиками для визуализации субклеточных более чем одного параметра одновременно. Например, было высказано NucleoBAS вместе с TGR5 (EST клона # 5221127 IMAGE) и датчиком цАМФ в цитозоле (Т ЕПАК В.В.) 11 для измерения TGR5 и активацию FXR в одной камере в то же время. После связывания TGR5, уровни цАМФ увеличилась в цитозоле, который обнаруживается датчиком цАМФ, в то время активации FXR в ядре было по отношениюualized одновременно. Цифры 2D-F показать временной ряд, состоящий из 6 конфокальных изображений клеток NucleoBAS-TGR5- T ЕПАК в.в. после лечения GW4064 (5 мкм) (Рисунок 2 D), с TCDCA (10 мкм) (рис 2) E или хенодезоксихолевой кислоты (CDCA) (10 мкм) (рис 2 F) при Т = 0. зеленый цвет обозначает районы, где уменьшается соотношение выбросов 525/450 нм (представляющих цАМФ повышение) и розового цвета представляет собой увеличение коэффициента излучения (активации) FXR, по сравнению с соотношения в начале эксперимента.
Кроме того, проточной цитометрии могут быть использованы для скрининга пула клеток на уровне одной клетки или как высокопроизводительного скрининга на всей популяции. U2OS клетки, экспрессирующие NucleoBAS были excitред с нм лазера фиолетовый 405 и флуоресценции, собирали в диапазоне 450/40 для небесно-голубого цвета и 525/20 диапазона цитрине. Для того, чтобы улучшить эффективность FRET экспериментов FACS основе, соответствующие ворота должны быть установлены (рисунок 3). Р1 ворота исключает остатков клеток и Р2 ворота удаляет duplets из анализа. Далее, анализ ограничен цитрин (возбужденного с 488 лазера) и небесно-голубого цвета (405 возбуждении лазером) положительных клеток по воротам 3. Наконец, ворота Р4 представляет собой процент клеток с небесно-голубого цвета высокой степенью цитрин / эмиссии (с помощью возбуждение лазурный с нм лазера 405). Для каждого образца, по меньшей мере, 10000 клеток, которые не выходят за рамки ворот 3 были измерены.
Впоследствии на основе FACS цитометрии потока FRET использовали для расчета увеличение FRET в живых клетках после 30 мин инкубации с TCDCA и GW4064. Необработанные U2OS клетки, экспрессирующие NucleoBAS показал <5% клеток в ворота P4 (цитрин / сerulean-высокие клетки). В отсутствие каких-либо транспортеров желчных кислот, такой же процент наблюдается в 30 мкм TCDCA клетках, обработанных (фиг.4 А). В противоположность этому, клетки, экспрессирующие совместно NucleoBAS, НПБТ и OSTαβ сделал показывают повышенное количество цитрин / небесно-высоких клеток около 38%. После добавления 10 мкМ GW4064, почти 90% клеток были лимонный / небесно-высокой независимо от экспрессии OSTαβ или НПБТ (рис 4 Б). Данные могут быть представлены в гистограммой (% клеток в ворота 4, 4) населения (рис 4 C, D) или в качестве населения гистограмм цитрин-лазурный соотношении (Рисунок 4 E, F).
Figure 1. Дизайн желчных кислот датчика (BAS). (А) структурного представления о механизме действия генетически закодированного желчных кислот датчика. Он состоит из доноров флуорофора (небесно-голубого цвета) и акцептора флуорофора (цитрин), связанного с помощью FXR-LBD и слитый с FXR-кофактора пептид (LXXLL мотив). (Б) Схематическое домена архитектура BAS. В Q204F / V224L флуорофорные мутации способствуют образованию внутримолекулярных взаимодействий между лазурный и цитрина. NucleoBAS конструкция содержит сигнал ядерной локализации С-концевой (NLS) и, следовательно, накапливается в ядре, в то время как конструкция CytoBAS отсутствуют какие-либо ориентации последовательность и, следовательно, показывает локализацию цитозольного. (С) Представитель конфокальной основе FRET эксперимент с БАС в качестве инструмента для мониторинга транспорта конъюгированного желчных кислот. Никаких изменений в цитрин / небесно-голубого цвета соотношении не наблюдается после 30 мкМ TCDCA того, в клетках только ехрressing NucleoBAS. Когда 5 мкМ GW4064 был добавлен, сильно увеличилась цитрин / лазурный соотношение наблюдалось. (D) Импорт TCDCA (30 мкМ) приводит к значительной активации датчика в НПБТ и OSTαβ котрансфицируют клеток. После GW4064 (5 мкМ) обработка приводит к дальнейшему увеличению цитрин / небесно-голубого цвета соотношении. Результаты выражены как среднее ± SD, п = 6 индивидуальных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Локализация FRET-BAS построить в живых клетках. Конфокальной микроскопии изображений U2OS клеток, трансфицированных CytoBAS (А) или NucleoBAS (B). (C) U2OS клетки со-Transfected с NucleoBAS и НПБТ-mKate2. Шкалы составляет 10 мкм. (D - F) Временной ряд NucleoBAS-TGR5- Т ЕПАК В.В. трансфицированных клеток. (D), GW4064 активирует FXR (увеличение соотношения 525/450 нм), но не TGR5. (Е) TCDCA активизирует TGR5 на мембране (снижение соотношение 525/450 нм), но не в состоянии проникнуть в клетку, чтобы активировать FXR в ядре. (F), CDCA активизирует TGR5 на мембране, а также FXR в ядре (увеличение соотношения 525/450 нм в ядре, снижение в цитоплазме). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Проточной цитометрии стробирования parameteRS. (A) Р 1 ворота в / FSC-окна SSC-A используется для исключения мертвых клеток. (Б) В FSC-H / FSC-окна, Р2 ворота обращается устранить дублетные события из анализа. (С) В цитрин выбирают (525/20 нм) / лазурный (450/40 нм) окна, NucleoBAS (и CytoBAS) позитивные клетки (Ворота Р3). (D), наконец, в цитрин (525/20 нм) / лазурный (450/40 нм) окна, Р4 ворота содержит цитрин / лазурный-высокие клетки эксперимента FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,
Рисунок 4. Представитель FACS эксперимент измерения транспорт кислоты желчи, используя NucleoBAS. (А >, В) FACS-участки, показывающие количество цитрина / лазурный-высокие живые NucleoBAS-выражающие U2OS клеток (А) и U2OS клеток коэкспрессирующей NucleoBAS, OSTαβ и НПБТ (Б) после лечения с буфером управления (слева), 30 мкМ TCDCA (средний) или 10 мкМ GW4064 (справа). (С, D) Бар график, показывающий процент цитрин / лазурными высокой клеток после 30 мин инкубации с TCDCA или GW4064 в U2OS клеток, экспрессирующих NucleoBAS и котрансфицируют (D) или без (C) OSTαβ и НПБТ. (E, F) Гистограмма, показывающая распределение цитрин / небесно-голубого цвета соотношении в популяции клеток, экспрессирующих U2OS NucleoBAS с или без OSTαβ и НПБТ после 30 мин инкубации с TCDCA (желтый), GW4064 (красный) или буфера управления (синий). Все условия были измерены три раза. Бары представляют средние значения + стандартное отклонение (SD) (п = 3).ТПД: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Справочная Файл 1:. Шаблон BAS целом Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Справочная файла. 2: Шаблон BAS Zeiss Leica импортированы данные Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем подробный протокол для использования нового генетически закодированы датчика желчных кислот, способным контролировать динамику пространственно-временные транспорта желчных кислот в живых клетках. Это биосенсор состоит из лазурными и цитрин белков флуоресцентными которые сплавлены с FXR-LBD, тем самым формируя датчик желчных кислот FRET основе (BAS).
Желчных кислот Датчик является относительно простым и удобным в использовании, имея базовый опыт с культурой клеток и FACS или (конфокальной микроскопии). Тем не менее, некоторые аспекты могут потребовать некоторые проблемы стрельбу. При использовании датчика желчных кислот в сочетании с транспортеров желчных кислот, рекомендуется культуры клеток в среде с активированным углем сыворотки. Древесный уголь дополнительно снижает уровень желчных кислот путем адсорбции из сыворотки. Особенно в присутствии импортеров, таких как НПБТ, это имеет решающее значение для предотвращения насыщения датчика в процессе культивирования, так как это наиболее распространенной причиной нечувствительным датчикав ходе экспериментов. Таким образом, другой датчик был создан (NucleoBAS N354K / I372V), содержащий мутации, изменяющие чувствительность для желчных кислот, создавая большую динамический диапазон 8. Чтобы определить, является ли датчик уже насыщен, то лимонный / небесно соотношение можно сравнить с отношением в контрольных клетках, экспрессирующих либо не транспортеры желчных кислот, так как эти клетки предполагается, имеют низкий уровень внутриклеточного желчных кислот. Кроме того, изображения флуоресценции жизни микроскопии (FLIM) измерения могут быть выполнены, чтобы исследовать FRET в интенсивности-независимым способом 12. Этот метод выходит за рамки данной статьи, и требует более специализированного оборудования. Другие причины нечувствительным датчика включают использование клеток, которые автоматически флуоресцентные и / или потеряли NucleoBAS выражение. Следует отметить, что колебания в интенсивности лазурный и цитрин (например, в результате координационных сдвигов) в течение эксперимента могут заслонить прямую визуализацию FRET изменений во время съемки, в то время какЛогометрический природа датчика по-прежнему позволяет для мониторинга динамики желчных кислот. Часто изменения абсолютной интенсивности скромные для отдельных флуорофоров при добавлении FXR лигандов, в то время как увеличение коэффициента очевидна.
Для анализа FRET в клетках, трансфицированных датчика BAS, должен быть выбран целесообразно лазерного света и фильтров. Увеличение интенсивности цитрин во FRET должна быть измерена с фиолетовым диод (405 нм) лазера с выбросами мониторинг за 450-520 (Cerulean) и 520-580 (цитрин). Важным аспектом принять во внимание, является чувствительность датчика к фотообесцвечивания. Когда интенсивность одного или обоих флуорофоров медленно снижается во времени без добавления лигандов, это часто указывает фотообесцвечивание. Это явление в основном происходит, когда мощность лазера слишком высока. Чтобы избежать этого нежелательного эффекта, сила лазера не должна превышать 5% от полной мощности, и клетки должны быть сохранены в темноте, насколько это возможно. ОграничьтеВремя искать правых клеток. Колебания интенсивности флуоресценции может также быть вызвано фокальной дрейфа в оси. Чтобы избежать этого, пинхол размер может быть увеличен, и желательно, чтобы привлечь трансформирования не очень близко к клеточной периметру.
Датчик FRET для желчных кислот было протестировано в нескольких типах клеток (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK и клетки HEK293T), которые могут быть трансфицированных и иметь стабильную фенотип. Тем не менее, первичные и дифференцированные клетки, такие как гепатоциты трудно трансфекции и поддерживать стабильным в терминах характеристик. Вирусный трансдукция может помочь с труднодоступных трансфекции клеток (построить по запросу). В настоящее время мы генерации линию мыши, чтобы разрешить использование датчика в свежевыделенных первичных клеток, которые быстро дедифференцироваться на изоляции.
Для выполнения эксперимента, описанного конфокальной, крайне важно, чтобы выбранная линия клеток является приверженцем культуральной чашке и растет в сиngle слой клеток. Однако клетки, которые растут в суспензии, или адгезивных клеток, которые могут быть достаточно легко трипсином, также могут быть измерены с помощью FACS. Наконец, он посоветовал, чтобы выбрать линию клеток без эндогенного транспорта желчных кислот или синтезе при анализе конкретного транспортного пути, т. Е, при измерении активности некоторых трансфектированных (мутантных) белков-переносчиков.
Представленная генетически закодированы люминесцентные биосенсора BAS является ценным инструментом для мониторинга одного живого транспорта клеток желчных кислот. БАС содержит FXR-LBD который активируется большим разнообразием желчных кислот, что позволяет визуализацию субклеточных динамики желчных кислот 8. Это дает большое преимущество по сравнению с использованием других методов. Например, в промоторных приводом репортера люциферазы анализов, сигнал люциферазы зависит от стабильности репортера в клетках, не поддерживает внутриклеточную информации, и требует разрушения образца
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B.
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
