Monitoreo en tiempo real de intracelular del ácido biliar Dinámica El uso de un sensor de ácido biliar basada FRET-codificados genéticamente
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) es ampliamente utilizado para obtener una mejor comprensión de las funciones celulares en las células vivas con una alta resolución temporal y espacial 1. En FRET, la energía de un fluoróforo donante excitado se transfiere a un fluoróforo aceptor. Eficiencia de FRET es fuertemente dependiente de la distancia entre el donante y el fluoróforo aceptor y su orientación y por lo tanto es una lectura sensible de los cambios conformacionales que afectan a los dos fluoróforos. Este fenómeno se explota para generar biosensores basados en FRET para la obtención de imágenes de moléculas pequeñas. Los cambios en su concentración pueden ser monitoreados a medida que aumenta / disminuye en la proporción de intensidad de emisión del aceptor con respecto al fluoróforo donante 2. Por ejemplo, biosensores calcio basados en FRET permiten la detección rápida y estable de las concentraciones de calcio libres en las células 3 viviente. Otras ventajas de biosensores basados en FRET se Imaging en células vivas individuales, theredera no invasividad, de su capacidad para dirigirse a diferentes tipos de células y 4 compartimentos celulares.
Muchos aspectos de la dinámica de ácidos biliares intracelular son aún poco conocidos. Por ejemplo, se sabe poco sobre el mecanismo de regulación subyacente de transporte de ácidos biliares conjugada y no conjugada. Técnicas existentes para supervisar este transporte hacen principalmente el uso de reporteros basados en luciferasa, ácidos biliares radiomarcados, o análogos de ácidos biliares fluorescentes. Esto último requiere la modificación de los ácidos biliares, posiblemente afecte a sus propiedades. Periodistas basados en luciferasa tienen mala resolución de tiempo. Además, estas técnicas resultan en la pérdida de la muestra y no son aplicables para formación de imágenes en las células individuales. Por lo tanto, sería beneficioso utilizar métodos que permiten imágenes de células única en vivo de la actividad de transporte utilizando biosensores FRET, especialmente ya que incluye la ventaja de la detección radiométrica 5, 6. Mientras que las variantes de CFForma P / YFP usa más frecuentemente pares FRET, nuevas estrategias que utilizan Morange y mCherry que portan mutaciones auto-asociación inductores han dado lugar a una expansión de la caja de herramientas FRET con nuevos sensores, incluyendo un sensor de ácido biliar desplazada al rojo 7.
Hemos creado previamente una FRET bilis sensor ácido genéticamente codificado (BAS), que consiste en un fluoróforo donante (cerúleo) y un fluoróforo aceptor (citrino) que se fusiona con el dominio de unión a ligando de receptor X farnesoide (FXR) (FXR-LBD) y un péptido que contiene un motivo LXXLL 8. Este péptido se asocia con el FXR LBD-ácido de una manera dependiente de la bilis. Tras la activación de FXR, la distancia entre citrino y cerúleo alterará debido a un cambio conformacional. En líneas celulares de mamíferos, FXR activación resulta en un aumento claramente detectable en la proporción de citrino / cerúleo, mientras que el sensor purificada trabaja en la dirección opuesta y conduce a una relación de FRET disminuido tras la activación de FXR. Este sensor (CytoBAS)permite el monitoreo de la dinámica de ácidos biliares citosólicas. Mediante la adición carboxilo-terminal de motivos dirigidos subcelulares, el constructo de BAS puede ser dirigido al núcleo (NucleoBAS) y peroxisomas (PeroxiBAS), lo que permite mediciones de las concentraciones de ácidos biliares en diferentes compartimentos celulares. Aunque la adición del motivo focalización peroxisomal no perjudica su capacidad de respuesta a los ácidos biliares, de células permeables FXR ligandos no indujo cambios en cualquier traste PeroxiBAS dentro de los peroxisomas 8. Como la naturaleza de esta discrepancia no se conoce, el protocolo a continuación se centra en CytoBAS y NucleoBAS.
El uso de este sensor FRET codificados genéticamente se demostró recientemente en las células que contienen los transportadores de ácidos biliares hepáticos Na + polipéptido / taurocolato de co-transporte (PNCT) y orgánica alfa transportador de soluto / beta (OSTαβ) 8. PNCT es el importador de ácido biliar hepática principal e OSTαβ es una bilis intestinal basolateraltransportador de ácido que puede funcionar tanto como un importador y exportador depende del gradiente de concentración de ácidos biliares electroquímica 9, 10. Los datos recientes muestran que al transporte de ácidos biliares por PNCT y / o OSTαβ, las respuestas sólidas y rápidas en relación de FRET como un resultado de la interacción ligando-FXR-LBD se pueden observar.
A continuación, describimos protocolos detallados para los métodos para medir la FRET como el análisis microscópico y confocal de células activadas por fluorescencia (FACS), destacamos pasos críticos, abordamos los problemas potenciales y discutir métodos alternativos. El uso de este sensor FRET codificado genéticamente, la interacción de ácidos biliares con FXR-LBD se puede cuantificar y monitoreada directamente en las células vivas y proporciona un método rápido y simple de visualizar transporte de ácidos biliares y la dinámica en tiempo real. Plásmidos de expresión de mamíferos que codifican CytoBAS NucleoBAS y están disponibles comercialmente. Por lo tanto, este biosensor puede contribuir aún más a lala comprensión de los transportadores de ácidos biliares o compuestos que activan el FXR y proporcionan una visión más profunda de la biología de los ácidos biliares y la señalización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se presenta un protocolo detallado para el uso de un nuevo codificado genéticamente sensor de ácido biliar capaz de monitorizar la dinámica espacio-temporales de transporte de ácidos biliares en las células vivas. Este biosensor consta de proteínas fluorescentes azul cerúleo y citrino que se fusionan a FXR LBD-, formando de este modo un sensor de ácido biliar basado en FRET (BAS).
El sensor de Bile Acid es relativamente simple y conveniente en uso al tener experiencia básica c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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