We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) används ofta för att få en bättre förståelse av cellulära funktioner i levande celler med hög tids- och rumsupplösning 1. I FRET är energi från en exciterad donatorfluorofor fördes till en acceptorfluorofor. FRET-effektiviteten är starkt beroende av avståndet mellan givaren och acceptorfluorofor och deras orientering och är därför en känslig avläsning av konformationsförändringar som påverkar de två fluoroforer. Detta fenomen utnyttjas för att generera FRET-baserade biosensorer för avbildning av små molekyler. Förändringar i deras koncentration kan övervakas som ökar / minskar i förhållandet emissionsintensiteten hos acceptorn kontra donatorfluoroforen 2. Till exempel, FRET-baserade kalcium biosensorer möjliggör snabb och stabil detektering av fria kalciumkoncentrationer i levande celler 3. Andra fördelar med FRET-baserade biosensorer avbildning i enskilda levande celler, tarvinge icke-invasivitet av deras förmåga att riktas mot olika celltyper och cellulära avdelningar 4.
Många aspekter av intracellulära Gallsyrebindande dynamik fortfarande dåligt kända. Till exempel, är lite känt om mekanismen underliggande regleringen av konjugerat och okonjugerat gallsyratransport. Befintliga metoder för att övervaka denna transport Främst av luciferas baserade reportrar, radiomärkta gallsyror, eller fluorescerande gallsyrabindande analoger. Det senare kräver en ändring av gallsyror, eventuellt påverkar deras egenskaper. Luciferas-baserade reportrar har dålig tidsupplösning. Förutom dessa tekniker resultera i förlust av provet och inte är tillämpliga för avbildning i enskilda celler. Därför skulle det vara fördelaktigt att använda metoder som möjliggör levande enda cell imaging transportaktivitet med hjälp av FRET biosensorer, särskilt eftersom det ingår fördelen med kvotmetriska upptäckt 5, 6. Även varianter av CFP / YFP formulär som används mest FRET par, nya strategierna genom mOrange och mCherry bär självassociation framkallande mutationer har lett till en utvidgning av FRET verktygslåda med nya sensorer, inklusive en röd-skiftat gallsyran sensor 7.
Vi har tidigare skapat en genetiskt kodad FRET-gallsyra sensor (BAS), som består av en donatorfluorofor (cerulean) och en acceptorfluorofor (citrin) som är sammansmälta med den farnesoid X-receptorn (FXR) ligandbindande domän (FXR-LBD) och en peptid innehållande en LXXLL-motivet 8. Denna peptid associerar med FXR-LBD i en gallsyra beroende sätt. Vid FXR aktivering, kommer avståndet mellan citrin och cerulean ändra på grund av en konformationsförändring. I däggdjurscellinjer, FXR aktivering resulterar i en klart detekterbar ökning i citrin / cerulean förhållande, medan det renade sensorn fungerar i motsatt riktning och leder till en minskad FRET förhållandet vid FXR aktivering. Denna sensor (CytoBAS)möjliggör övervakning av cytosoliska gallsyrabindande dynamik. Genom karboxylterminal tillsats av subcellulära inriktnings motiv, kan BAS konstruktionen målriktas mot kärnan (nukleobas) och peroxisomer (PeroxiBAS), vilket tillåter mätningar av gallsyra-koncentrationer i olika cellulära avdelningar. Även om tillsatsen av peroxisomal inriktning motivet inte försämra dess lyhördhet för gallsyror, gjorde cellpermeabla FXR-ligander inte framkalla någon FRET förändringar av PeroxiBAS inne peroxisomer 8. Arten av denna skillnad är okänd, under protokollet är inriktad på CytoBAS och nukleobas.
Användningen av detta genetiskt kodad FRET sensor demonstrerades nyligen i celler innehållande hepatiska gallsyrabindande transportörer Na + / taurokolat sam-transporterande polypeptid (NTCP) och organiskt löst ämne transportör alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP är den huvudsakliga lever gallsyran importör och OSTαβ är en basolaterala tarm gallasyra transportör som kan fungera både som importör och exportör beroende på elektro gallsyrakoncentrationen lutning 9, 10. Nya data visade att vid gallsyratransport av NTCP och / eller OSTαβ, kan observeras robusta och snabba svar i FRET-förhållande som ett resultat av ligand-FXR-LBD-interaktion.
Här beskriver vi detaljerade protokoll för metoder för att mäta FRET såsom konfokala mikroskopisk analys och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), markera kritiska steg, ta itu med potentiella problem och diskutera alternativa metoder. Med användning av denna genetiskt kodad FRET-sensorn, kan gallsyra interaktion med FXR-LBD kvantifieras och övervakas direkt i levande celler och ger en snabb och enkel metod för att visualisera gallsyratransporten och dynamik i realtid. Däggdjur expressionsplasmider som kodar CytoBAS och nukleobas är kommersiellt tillgängliga. Därför kan denna biosensor ytterligare bidra tillförståelse av galla syra transportörer eller föreningar som aktiverar FXR och ger en djupare inblick i gallsyror biologi och signalering.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för användning av en ny genetiskt kodad gallsyror sensor som kan övervaka Spatiotemporal dynamik gallsyratransport i levande celler. Denna biosensor består av cerulean och citrin fluorescerande proteiner som är fuserade till FXR-LBD, och därigenom bilda en FRET-baserad gallsyra sensor (BAS).
Gallsyran Sensor är relativt enkel och bekväm användning när man har grundläggande erfarenhet med cellodling och FACS eller (konfokal) mikroskopi. …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
CytoBAS | Addgene | 62860 | |
NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |