Introduction
Silicium nanodraad veldeffecttransistoren (SNWFETs) hebben de voordelen van ultra-hoge gevoeligheid en directe elektrische responsen milieu ladingsverandering. In n-type SNWFETs bijvoorbeeld wanneer een negatief (of positief) geladen molecuul zal het silicium nanodraad (SNW), de dragers in de SNW uitgeput (of stapel). Bijgevolg is de geleidbaarheid van de SNWFET afneemt (of verhogingen) 1. Daarom kan een geladen molecuul SNW nabij het oppervlak van het apparaat SNWFET gedetecteerd. Essentiële biomoleculen zoals enzymen, eiwitten, nucleotiden en vele moleculen op het celoppervlak zijn ladingsdragers en kan worden gecontroleerd met behulp SNWFETs. Met de juiste aanpassingen, in het bijzonder het immobiliseren van een biomoleculaire sonde op het SNW, kan een SNWFET worden ontwikkeld tot een label-free biosensor.
Surveillance gebruik biomarkers is cruciaal voor de diagnose van ziekten. Zoals getoond in Tabel 1, hebben verscheidene studies gebruikt NWFET-gebaseerde biosensoren voor label-free, ultra-hoge gevoeligheid en real-time detectie van verschillende biologische doelwitten, waaronder een virus 2, adenosine trifosfaat en kinasebinding 3, neuronale signalen 4, metaalionen 5,6, bacteriële toxinen 7, dopamine 8, 9-11 DNA, RNA 12,13, enzym en kanker biomarkers 14-19, 20 hormonen en cytokinen 21,22. Deze studies hebben aangetoond dat NWFET gebaseerde biosensoren vormen een krachtig detectieplatform voor een breed scala aan biologische en chemische species in een oplossing.
In SNWFET gebaseerde biosensoren, de probe geïmmobiliseerd op het oppervlak van SNW herkent het apparaat een specifieke biotarget. Immobiliseren van een bioprobe gewoonlijk een aantal stappen, en is het essentieel dat elke stap goed wordt uitgevoerd om de goede werking van de biosensor te waarborgen. Verscheidene technieken zijn ontwikkeld voor het analyseren van de surface samenstelling, waaronder X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS), ellipsometrie, Contacthoekmeting, atomic force microscopie (AFM), en scanning elektronenmicroscopie (SEM). Methoden zoals AFM en SEM directe bewijs van bioprobe immobilisatie van de nanodraad apparaat, terwijl methoden zoals XPS, ellipsometrie en contact hoekmeting afhankelijk zijn van parallelle experimenten uitgevoerd op andere soortgelijke materialen. In dit rapport beschrijven we de bevestiging van een modificatiestap door twee onafhankelijke methoden. XPS wordt toegepast om de concentraties van specifieke atomen aan polysilicium wafers onderzoeken, en variaties in de elektrische eigenschappen van de inrichting worden gemeten direct naar ladingsverandering op SNW oppervlak te bevestigen. We maken gebruik van DNA biosensoren met behulp van polykristallijne SNWFETs (pSNWFETs) als een voorbeeld om dit protocol te illustreren. Immobiliseren van een DNA-probe op het SNW oppervlak bestaat uit drie stappen: aminegroep modificatie op de inheemse hydroxyl oppervlak van de SNW, aldehyde groep modificatie, en 5'-aminomodified DNA-probe immobilisatie. Bij elke wijziging stap, kan het apparaat rechtstreeks te detecteren de variatie in de lading van de functionele groep geïmmobiliseerd op het SNW oppervlak, omdat het oppervlak lasten veroorzaken lokale grensvlak potentiële veranderingen over het hek diëlektricum dat het kanaal huidige en geleiding 1 te veranderen. Kosten rond de SNW oppervlak kan elektrisch moduleren van de elektrische eigenschappen van de pSNWFET apparaat; dus de oppervlakte-eigenschappen van de SNW spelen een cruciale rol bij de bepaling van de elektrische eigenschappen van pSNWFET apparaten. In de gerapporteerde procedures, kan de immobilisatie van een bioprobe op SNW oppervlak direct worden bepaald en bevestigd door middel van elektrische metingen, en de inrichting wordt voorbereid voor biosensoren toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage en Conservering van pSNWFET Devices
- Device Fabrication
Opmerking: De pSNWFET werd vervaardigd onder toepassing van een zijwand afstandhouder techniek zoals eerder beschreven 23,24.- Bereid de poort diëlektrische laag.
- Cap een 100-nm dikke thermische oxide (SiO 2) laag op een Si-substraat met de natte oxydatie 25 (O 2 en H 2 procesgas bij 980 ° C gedurende 4 uur).
- Storten een 50-nm dikke nitride (Si 3N 4) laag met lage druk deposition (LPCVD) 25 chemische damp bij 980 ° C gedurende 4 uur.
- Stort een 100-nm dikke tetraethylorthosilicaat (TEOS) laag 25 door LPCVD bij 780 ° C gedurende 4 uur.
- Voer standaard lithografie met behulp van een I-lijn stepper aan de oxide dummy structuren te definiëren.
- De vacht van de wafer oppervlak met een 830-nm-dikke fotoresistlaag.
- iknsert een patroon gedefinieerd fotomasker in de I-lijn stepper.
- Verwerk de belichting via de I-lijn stepper (golflengte: 365 nm) met een sterkte van 1980 J bij kamertemperatuur.
- Ontwikkelen van de wafer binnen een ontwikkelaar gedurende 5 minuten.
- Voer het isotroop etsproces met behulp van een standaard inductief gekoppeld plasma 25 etser met HBr en Cl plasmagas gedurende 1 min.
- Stort een 100-nm dikke amorf silicium (α-Si) laag 25 door LPCVD.
- Voer een gloeistap bij 600 ° C in N2 omgevingstemperatuur gedurende 24 uur aan de α-Si te vormen tot een polykristallijne structuur.
- Implantaat fosfor ionen door source / drain (S / D) doping bij lage energie (5E 15 cm -2) 25.
- Voer standaard lithografie met behulp van de I-lijn stepper aan de poly-Si-laag te verwijderen en de polysilicium nanodraad (pSNW) 25.
Opmerking: Herhaal stap 1.1.3 om dop implanterenmieren anders dan S / D regio plaatsen met poly-Si verwijdering en vormen de zijwand Si kanalen in een zelfregistrerende wijze. - Voer de passivatie (200-nm dikke oxidelaag TEOS) met LPCVD bij 780 ° C gedurende 5 uur 25.
- Voer standaard lithografie met behulp van de I-lijn stepper aan de nanodraad kanalen en vorm testen pads bloot te leggen met behulp van de twee-staps droog / nat etsproces.
- Herhaal stap 1.1.3.
- Voer het natte etsproces (DHF: HF / H2O gedurende 1 min).
- Bereid de poort diëlektrische laag.
- wafer behoud
- Verzegeling van de wafer in een vacuüm opbergtas en op te slaan in een elektronische droge kast (relatieve vochtigheid <40% bij kamertemperatuur).
2. Voorbehandeling van de Device
- apparaat reinigen
- Spoel het apparaat met pure aceton.
- Ultrasone trillingen (46 kHz, 80 W) van het apparaat in pure aceton gedurende 10 min. <li> Ultrasone trillingen (46 kHz, 80 W) de inrichting in zuivere ethanol (99,5%) gedurende 5 min.
- Föhn het oppervlak van de inrichting met stikstof.
- Behandel het apparaat met O2 plasma bij 18 W gedurende 30 seconden.
3. Immobilisatie van de DNA-probe op het apparaat Surface
- Aminegroep modificatie
- Dompel het apparaat in een 2,0% (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) / ethanol oplossing gedurende 30 min.
- Was het apparaat met ethanol drie keer, en ultrasone trillingen (46 kHz, 80 W) de inrichting in ethanol gedurende 10 minuten.
- Verwarm het apparaat op een hete plaat bij 120 ° C gedurende 10 minuten tot amine groepen op SNWs.
- Aldehydegroep modificatie
- Dompel het apparaat in 12,5% glutaaraldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aldehyde groepen op het oppervlak. Vermijd blootstelling aan licht.
- Was het apparaat with 10 mM natriumfosfaatbuffer (Na-PB, pH 7,0) driemaal en föhn het oppervlak van de inrichting met stikstof.
- DNA probe immobilisatie
- Dompel het apparaat in een oplossing die 1 uM DNA probes nacht.
- Dompel het apparaat in 10 mM Tris buffer (pH 8,0) met 4,0 mM NaBH3CN gedurende 30 min om de ongereageerde aldehydegroepen blokkeren.
- Was het apparaat met Na-PB (pH 7,0) driemaal en föhn het oppervlak van de inrichting met stikstof.
4. Bevestiging en de analyse van het oppervlaktewater Wijziging op pSNWFET
- pH-profiel na elke stap van oppervlaktemodificatie
- Bereid 10 mM Na-PB pH 3,0-9,0.
- Bereid 10 mM natriumfosfaat tribasisch dodeca- (Na 3 PO 4) in gedeïoniseerd water (pH 11,60).
- Bereid 10 mM fosforzuur (H 3 PO 4) in gedemineraliseerd water(PH 2,35).
- Plaats de pH elektrode in 500 ml 10 mM Na 3 PO 4 buffer en meng deze oplossing met verschillende volumes 10 mM H 3 PO 4 buffer tijdens het meten van de pH buffers met een pH van 3,0, 4,0, 5,0 te verkrijgen, 6,0 , 7,0, 8,0 en 9,0.
- AC geleidingsmeting
Opmerking: De meetschakeling omvatte een kleine AC-signaalgenerator en een Au Microdraaden die diende als de vloeistof poortelektrode.- Bepaal de optimale vloeistof gate spanning (V LG) voor de meting 26 bij elke wijziging stap (stappen 2.2, 3.1, 3.2 en 3.3).
Opmerking: De elektrische eigenschappen van de inrichting na vier oppervlakmodificaties op SNW werden gemeten zoals beschreven in dit hoofdstuk. In stap 2,2 wordt het ongemodificeerde pSNWFET met de natuurlijke oxidelaag gewijzigd; stap 3.1 met zich meebrengt, het wijzigen van het apparaat met de aminegroep van APTES; stap 3.2 omvat modificatie met de ongeladenfunctionele groep glutaaraldehyde; en stap 3.3 gaat om DNA-probe modificatie.- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) oplossing van het SNW oppervlak met een injectiepomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur) voor direct contact met de SNW.
- Meet de real-time geleiding van het apparaat tijdens het vegen V LG 0,80-1,30 V.
- Uitvoeren geleidingsmeting via de lock-in techniek 27 bij kamertemperatuur.
- Converteren de AC stroom signalen in een wisselspanning signaal met behulp van een low-noise huidige voorversterker.
- Verzamel gegevens over de geleiding (G) bij toenemende V LG 0,80-1,30 V (interval = 0,02 V).
- Bepaal de optimale V LG (gevoeligste LG V) van de inrichting 26.
- Zet de LG GV curves van stap 4.1.2.1.2.3 om de vergelijking van de curve te verkrijgen.
- Differentiate de vergelijking, en bereken de waarden in elk punt van V LG.
- Verdeel de waarde uit stap 4.1.2.1.3.2 door G, en bepaalt de optimale V LG volgens het maximumaantal.
- Meet de real-time geleiding van het pH-profiel bij elke stap van de oppervlaktemodificatie.
- Uitvoeren geleidingsmeting via de lock-in techniek 27 bij kamertemperatuur.
- Reken de wisselstroom signaal in wisselspanning signalen met behulp van een low-noise huidige voorversterker.
- Stel de optimale V LG voor elke stap van oppervlaktemodificatie (stap 2,2 V LG = 1,02, stap 3.1: V LG = 0,98, stap 3.2: V LG = 0,98, en stap 3.3: V LG = 1,0).
- Lever de 10 mM Na-PB-oplossing met pH-waarden 3,0-9,0 om de SNW oppervlak (debiet: 5,0 ml / uur), En gegevens verzamelen over conductantie bij een drain spanning van 0,01 V.
- Bepaal de optimale vloeistof gate spanning (V LG) voor de meting 26 bij elke wijziging stap (stappen 2.2, 3.1, 3.2 en 3.3).
- Bereid 10 mM Na-PB pH 3,0-9,0.
- Meting van mechanische eigenschappen (I D -V BG curve) van de inrichting in 10 mM Na-PB (pH 7,0) na iedere stap van oppervlaktemodificatie (stap 2,2, 3,1, 3,2 en 3,3).
Opmerking: De elektrische eigenschappen van de inrichting na vier oppervlakmodificaties op SNW gemeten: in stap 2.2, wordt het ongemodificeerde pSNWFET met de natuurlijke oxidelaag gewijzigd; 3,1 stap omvat aanpassen van het apparaat met de aminegroep van APTES; 3,2 stap houdt modificatie met ongeladen functionele groep glutaaraldehyde; en stap 3.3 met zich meebrengt DNA-probe wijziging.- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) oplossing van het SNW oppervlak (stappen 2,2, 3,1, 3,2 en 3,3) via een injectiepomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur) voor direct contact met de SNW.
- Meet de I D
- Selecteer de "nMOSFET" mode.
- Selecteer "I D - V BG" modules.
Opmerking: I D is de drain / source huidige en V BG is de back gate spanning. - Stel een constante voorspanning (VD = 0,5 V) tijdens het vegen de gatepotentiaal (V BG) van -1 tot 3,0 V (interval = 0,2 V).
- Klik op het pictogram Uitvoeren om I D te verkrijgen - V BG bochten.
5. DNA Biosensing
Opmerking: In een typisch experiment I D - is VB G curve driemaal zodat geen verdere variant is bepaald observed.
- Bepaling van de basislijn
- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) aan de DNA-probe geïmmobiliseerd SNW oppervlak gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur), en incubeer de SNW gedurende 30 min.
- Meet de I D van het apparaat (herhaal stap 4.2.2).
- Sensing DNA / DNA hybridisatie
- Belasting 22:00 complementaire doelwit DNA op de DNA-probe geïmmobiliseerd SNW oppervlak gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur), en incubeer de SNW gedurende 30 min.
- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) op het oppervlak SNW gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / h) teneinde de ongebonden doelwit DNA weg te wassen.
- Herhaal stap 4.2.2 op de I D van de inrichting te meten.
- Herbevestigen het signaal van DNA / DNA-hybridisatie.
- Load 1 nM herstel van DNA op tHij DNA probe geïmmobiliseerd SNW oppervlak gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur), en incubeer de SNW gedurende 30 min.
- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) op het oppervlak SNW gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur).
- Herhaal stap 4.2.2 op de I D van de inrichting te meten.
- negatieve controle
- Belasting 100 pM non-complementair DNA op de DNA-probe geïmmobiliseerd SNW oppervlak gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur), en incubeer de SNW gedurende 30 min.
- Lever de 10 mM Na-PB (pH 7,0) op het oppervlak SNW gedurende 10 min via een injectiespuit pomp (stroomsnelheid: 5,0 ml / uur).
- Herhaal stap 4.2.2 op de I D van de inrichting te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende SNWFETs gemeld om als transducers van biosensoren (tabel 1). Enkelkristallijne SNWFETs (sSNWFETs) en pSNWFETs tonen vergelijkbare mechanische eigenschappen als transductors in waterige oplossingen, en beide zijn gerapporteerd bij vele toepassingen biosensoren. Een voordelig kenmerk van het pSNWFET inrichting die in deze studie is het eenvoudige en goedkope fabricage procedure. Figuur 1a toont de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij het vervaardigen van de pSNWFET. Een optisch beeld van een matrijs van de 6-inch wafel (figuur 1b) en SEM afbeeldingen (figuur 1c) van een inrichting (twee SNWs ongeveer 100 nm breed en 1,6 um lang) werden verkregen.
Figuur 2a illustreert de procedure van DNA probe immobilisatie op het oppervlak SNW. Elke modificatiestap werd bevestigd met XPS (figuur 2b (figuur 2c, d) getoond in verschillende stadia van SNW oppervlaktemodificatie. Voor de niet-gemodificeerde pSNWFET met de inheemse oxidelaag op het SNW oppervlak, werden de hydroxylgroepen (OH) geïoniseerd om geladen groepen te vormen (-O -) met toenemende pH-waarden (zwarte lijn). De afname van geleiding bij pH 6,0-9,0 aan dat de zure dissociatieconstante (pKa) van de hydroxylgroep kan worden ingesteld op ongeveer 7,0. Conductantie verhoogt waarschijnlijk bij pH 3,0-6,0 door de toename van de ionsterkte beïnvloeden apparaatkenmerken 1. Na de APTES modificatie liet de reactie op de geleiding van de APTES-gemodificeerde inrichting aantallen verschillen (rode lijn). De aminegroep (pKa = 4,0) van APTES geprotoneerd kan worden bij een lage pH een positieve lading 28 te produceren. Dus de SNW geleidbaarheid af met discrete veranderingen in pH3,0-9,0. Na het SNW werd gemodificeerd met glutaaraldehyde, de respons was relatief stabiel geleiding bij een pH variërend 3,0-9,0 (blauwe lijn). Dit kan worden toegeschreven aan de niet-geladen functionele groep die ongevoelig is voor de verandering van de pH-omgevingen. Uiteindelijk, na het negatief geladen DNA probe werd geïmmobiliseerd, conductantie licht af met een toename van pH (groene lijn).
De verandering in de elektrische eigenschappen van de inrichting (figuur 2e) met verschillende modificaties bevestigt de verandering van de SNW oppervlak. In dergelijke experimenten I D G-V curve van het ongemodificeerde pSNWFET werd gebruikt als basis (zwarte lijn). Na het SNW werd ondergedompeld in APTES, I D G -V kromme van de inrichting naar links (verhoogde stroom) door de positieve lading op het oppervlak SNW caused door de aminogroep op APTES (zwart naar rode lijn). Na conjugatie glutaaraldehyde op APTES de gemodificeerde inrichting, de I-V D G curve verschoven naar rechts door de vorming imidebinding. De huidige daalde omdat de positief geladen amine werd omgezet in neutraal geladen imide (rood naar blauw lijn). Tenslotte werd de 5'-amnimodified DNA probe geïntroduceerd te binden aan de APTES glutaaraldehyde gemodificeerde inrichting. De suiker-fosfaatskelet van DNA veroorzaakt de I-V D G curve te verschuiven naar de rechterkant (blauw naar groene lijn), wat overeenkomt met het effect van negatieve ionen van n-type FET.
De detectie van DNA / DNA-hybridisatie op het pSNWFET is weergegeven in figuur 3. De sonde, doel, herstel en niet-complementaire DNA-sequenties ontworpen voor het detecteren van het vogelgriepvirus (AIV) 29,30 tabel 2. De I-V D G curve van de DNA-probe gemodificeerd pSNWFET verkregen in 10 mM Na-PB (pH 7,0) werd gebruikt als basis (zwart). Vervolgens werd 22:00 doelwit DNA geïntroduceerd hybridiseren met de geïmmobiliseerde DNA-probe op de SNW oppervlak en een duidelijke afname in de afvoerstroom van de inrichting waargenomen (rode lijn). De afname van I D in het n-type SNWFET impliceerde een verhoogde negatieve lading (veroorzaakt door de fosfaat backbone) op het oppervlak SNW. Herstel DNA werd ontworpen om rehybridize met het doel DNA en te bevrijden van de DNA-probe 31. Als de DNA herstel goed ontworpen, de reactie begunstigt thermodynamisch de herhybridisatie van de doelwit-DNA-duplex herstel, omdat meer nucleotiden complementair zijn tussen de twee DNA strengen (Tabel 1) dan tussen de probe en target DNA. Het toevoegen van 1 nM herstel DNA (blauwe lijn) Verder bevestigd dat de elektrische respons van het doelwit DNA werd door de hybridisatie van de probe-target DNA en bevrijdde de DNA-probe, die herbruikbaar volgende experimenten. Als negatieve controle, niet-complementair DNA [AIV subtype H5 doel DNA] (100 pM) werd geïnjecteerd en gemengd met de DNA-probe, en de I-V D G kromme ongewijzigd gebleven. De DNA probe geïmmobiliseerd op het pSNWFET ongevoelig voor niet-complementair DNA. Alleen richten op DNA leidt tot een aanzienlijke verschuiving in de I D - V G curve. I D - V G bocht terug naar de basislijn na incubatie met de DNA herstel.
Figuur 1. Voorbereiding van de pSNWFET apparaat. (A) Regeling van het apparaat Fabrikation. (I) Een 6-inch Si-wafel werd afgedekt met een 100 nm dikke thermische oxidelaag. Vervolgens werd 50-nm dikke nitride en 100-nm dikke TEOS lagen werden afgezet als uitgangsmaterialen via LPCVD. (Ii) A TEOS dummy structuur gedefinieerd en gevormd met standaard lithografie; isolator twee lagen (oxide en nitride) diende als poortdielektrikum. (Iii) A 100-n dikke α-Si laag werd afgezet via LPCVD en annealing werd vervolgens uitgevoerd om de α-Si zetten in poly-Si. (Iv) S / D doping werd vervolgens uitgevoerd door middel van fosfor ionenimplantatie. (V) De zijwand Si kanalen werden in een zelfregistrerende wijze gevormd door standaard lithografie. (Vi) Bovenaanzicht van de gefabriceerde inrichting structuur met pSNW. (B) Optische beelden van een pSNWFET biosensor chip. SEM beeld van een enkele pSNWFET apparaat (c). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De oppervlakte modificatie en validatie op pSNWFET. (A) Regeling van de oppervlakte functionalisering van DNA en DNA / DNA-hybridisatie. (B) XPS-spectra van C1s, O1s en N1S signalen van de siliciumwafel (bemonsteringsdiepte = 7,5 nm), waarbij de sequentiële stapsgewijze oppervlaktemodificatie van het geïmmobiliseerde DNA-probe werd uitgevoerd. Hoge-resolutie spectra werden verkregen, en de totale energie-resolutie is ingesteld op 0,1 eV. (C) real-time curve bij verschillende pH-waarden bij elke stap van de oppervlaktemodificatie; 10 mM Na-PB geïnjecteerd in de volgende volgorde: pH 7,0 → pH 6,0 → pH 5,0 → pH 4,0 → pH 3,0 → pH 4,0 → pH 5,0 → pH 6,0 → pH 7,0 → pH 8,0 → pH 9,0 → pH 8,0 → pH 7,0 . (D) Gemiddeld Conducafstand bij pH 3,0-9,0 met 10 mM Na-PB na elke stap van oppervlaktemodificatie. (E) De elektrische eigenschappen (I D - V BG curves) van de pSNWFET bij elke stap van modificatie van het oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. DNA biosensoren op pSNWFET. De I-V D G krommen van de DNA-probe-gemodificeerde pSNWFET verkregen in 10 mM Na-PB (pH 7) (zwarte lijn). De I-V D G curve na hybridisatie van de probe en doel DNA (rode lijn) werd verkregen door het introduceren 22:00 doelwit DNA en wassen met 10 mM Na-PB (pH 7). De DNA-probe (blauwe lijn) werd gewonnen door het toevoegen van 1 nM herstel van DNA om het doel DNA te verwijderen. Niet-complementair DNA werd gebruikt als negatieve controle in het experiment (groene lijn).
| Bio-target | Gevoeligheid | kristallijn | Type | Referentie |
| pH | single | p | 35 | |
| Cystic fibrosis ΔF508 | 3 bases deletie | single | p | 9 |
| influenza A | enkel virus | single | p | 2 |
| ATP sensing | 13:00 | single | p | 3 |
| telomerase | 10 Hela cel | single | p | 14 |
| PSA / CEA / mucine-1 | <1,4 / 2/5 pg / ml | single | n / p | 14 |
| neuronale signaal | single | n / p | 4 | |
| Ca2 + | 100 nM | single | n | 5 |
| Bacterieel toxine (SEB) | 10 fM | poly | p | 7 |
| dopamine | 1 fM | poly | n | 8 |
| Troponine-T | 1 fg / ml | single | n | 19 |
| Vasculaire endotheliale groeifactor | 1,04 / 0,104 nM | single | n / p | 18 |
| BRAF V599E | 1-base-mismatch | single | n | 11 |
| 1 fM | poly | n | 10 | |
| Avidine / streptavidine | 1,48 nM / 167 FM | poly | n | 37 |
| Ca 2+ / troponine I | 1 uM / 7 nM | single | p | 6 |
| Dengue serotype 2 RNA | <10 fM | single | n | 12 |
| CaM proteïne kinase | uitgedrukt cellysaat | single | p | 16 |
| Matrix metalloproteinase-2 | 100 fM | single | p | 15 |
| MicroRNA (miR-21 / miR-205) | 1 zeptomole (ca. 600 exemplaren) | single | p | 13 |
| Vasculaire endotheliale groeifactor | 1,25 pg / ml | poly | n | |
| Human schildklier stimulerend hormoon | 12:11 | single | n | 20 |
| Apolipoproteïne A II eiwit | 6,7 pg / ml | poly | n | 17 |
| Interleukine 8 / tumornecrosefactor α | 10 fg / ml | single | n | 22 |
Tabel 1. gedeeltelijke lijst van biotargets onderzocht met behulp van SNWFET apparaten.
| oligonucleotiden | Volgorde |
| AIV H1 5'-aminomodified probe DNA | 5'-NH2 C6 -CACACTCTGTCAACCTAC-3 ' |
| AIV H1 doelwit DNA | 5'-CCATTGTGACTGTCCTCAAGTAGGTTGACAGAGTGTG-3 ' |
| AIV H1 herstel van DNA | 5'-CACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGG-3 ' |
| Non-complementair DNA (AIV H5 target DNA) | 5'-TGATAACCAATGCAGATTTG-3 ' |
Tabel 2. Sequenties van synthetische oligonucleotiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Commercialiseren van de top-down en bottom-up fabricage benaderingen voor sSNWFETs wordt moeilijk beschouwd vanwege de kosten 32,33, SNW positie controle 34,35, en de geringe omvang van de productie 36. Daarentegen fabriceren pSNWFETs is eenvoudig en lage kosten 37. Via de top-down benadering en combinatie met de zijwand afstandhouder formatie techniek (figuur 1), kan de grootte van de SNW worden geregeld door de duur van reactieve plasma-etsen. De procedures voor het bereiden van nanodraden van de pSNWFET in figuur 1a kan eenvoudig worden aangepast voor commerciële halfgeleidende inrichting. Bijgevolg pSNWFETs hebben verschillende voordelen waaronder de kosteneffectiviteit, een eenvoudige bouwtechniek, en een CMOS-compatibele fabricageproces en kan dus in biosensoren worden toegepast.
In tegenstelling tot de vervaardiging van de halfgeleiderinrichting, een proces goed gedefinieerd in commercial faciliteiten, kan de immobilisatie van de bioprobe op het apparaat variëren voor elke specifieke toepassing. De immobilisatie van de probe op de DNA SNW oppervlak is geïllustreerd in figuur 2a als voorbeeld. Andere bioprobes, zoals antilichamen, aptameren en enzymen, kunnen ook worden geïmmobiliseerd op het oppervlak SNW voor het detecteren van verschillende doelen. De volgende stappen zijn cruciaal voor het succesvol immobiliseren van het DNA probe. In ons protocol, is het zo vervaardigde pSNWFET apparaat gereinigd en behandeld met zuurstofplasma en vervolgens ondergedompeld in een APTES / ethanoloplossing om aminegroepen op het SNWs maken. Vervolgens wordt de inrichting ondergedompeld in een oplossing van glutaaraldehyde aldehyde groepen op het oppervlak. Deze groepen later geconjugeerd met het 5'-aminomodified DNA probe. Meerfase-conjunctie tussen crosslinkende moleculen en de bioprobe moesten de halfgeleiderinrichting te vormen naar een biosensor. Het is dus van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat elke stap succesvol is. Bij elke stapDNA probe immobilisatie werd XPS gebruikt voor het analyseren en de samenstelling en chemie van het oppervlak te bevestigen. De atomaire concentratie van koolstof, zuurstof en stikstof werden vastgesteld op basis van XPS scans van de respectievelijke pieken, zoals getoond in figuur 2b. Na toevoeging van de DNA probe, de meest opvallende veranderingen zou toenemen koolstof en stikstof concentraties. Een toenemende trend werd waargenomen in de koolstof- en stikstof concentraties bij elke stap van de DNA probe immobilisatieprocedure. De zuurstofconcentratie daalde in de procedure, omdat de inheemse hydroxylgroep werd gedekt via oppervlaktemodificatie. Deze resultaten bleek dat de DNA-probe was geïmmobiliseerd, wat overeenkomt met de verandering in de elektrische eigenschappen, zoals getoond in figuur 2c, d en e. Voornoemde procedures zijn nuttig voor het oplossen bij mislukte oppervlaktemodificatie. Ze worden echter meestal uitgevoerd op een aparte wafer bekleed met een materiaal vergelijkbaar met dat op het oppervlak nanodraad. Direct bewijs van veranderingen in de elektrische eigenschappen van de gemodificeerde inrichting is vereist om het resultaat van oppervlaktemodificatie van het apparaat bevestigd, zoals beschreven in de volgende paragrafen.
Een van de meest gebruikte methoden voor het direct bewaken veranderingen in het oppervlak FET inrichting pH sensing, zie figuur 2d en d. Verschillende oppervlaktemodificaties met een wijziging in de lading op het oppervlak SNW, de oppervlaktepotentiaal van de pSNWFET onder verschillende omstandigheden sterk beïnvloeden. We gebruikten breed scala pH bufferoplossingen veranderingen in geleiding die overeenkomt met de functionele groepen op het oppervlak SNW detecteren. Uit mechanistisch oogpunt de stijging van geleiding met veranderende pH (toename van waterstofionen) is in overeenstemming met de toename van de positieve oppervlaktelading, die "ingeschakeld" het n-type FET via accumulatiop elektronen. De real-time elektrische reacties op de geleiding van de pSNWFET kan worden gemeten bufferoplossingen bij pH waarden variërend 3,0-9,0. De in dit rapport beschreven werkwijzen zijn bruikbaar voor de behandeling of halfgeleiders gebaseerde sensor bereid voor biosensoren toepassing.
Figuur 2e toont een geschikte werkwijze voor het bepalen van de uitkomst van de oppervlaktemodificatie door directe meting van de elektrische eigenschappen van de inrichting. De veranderingen in I D - V G curves getoond in figuur 2e stroken met elk stadium van DNA probe immobilisatie op het oppervlak SNW. Volgens de resultaten, kan pSNWFETs direct worden aangebracht om de procedure in elke fase van bioprobe immobilisatie bevestigen. Dit resultaat geeft ook aan dat de gemodificeerde pSNWFET wordt voorbereid voor biosensoren toepassing. Deze procedures zijn bijzonder nuttig wanneer de immobilisatie procedures zijn goed ingeburgerd. De functie van een pSNWFET gebaseerde biosensor werd onderzocht door detectie AIV subtype H1 DNA als voorbeeld (figuur 3). Gebruik probe en doelwit-DNA is geschikt voor het illustreren van de ontwikkeling van een nieuwe biosensor vanwege de stabiliteit van de DNA moleculen en de voor gemakkelijk verkrijgen van de gewenste DNA sequentie technieken. Naast het gebruik van niet-complementair DNA als een negatieve controle toonden wij DNA-hybridisatie op het pSNWFET een terugwinningssysteem. Dit is bijzonder nuttig wanneer een nieuw systeem of hardware wordt gebruikt voor biosensoren experimenten. Vele stappen zijn betrokken bij het proces van apparaat fabricage tot biosensoren toepassing. Elke stap van invloed op het uiteindelijke resultaat. Bovendien zijn vals positieve of vals negatieve resultaten gewoonlijk verkregen in biosensoren experimenten vanwege de complexiteit van de biosensoren milieu. Zo gecontroleerde experimenten zijn kritisch, en het herstel systeem aangetoond in deze studie kan sterk facilmakkelijken het identificeren van onverwachte factoren die interfereren met de experimentele resultaten.
De belangrijkste beperkingen Voor gangbare pSNWFET-gebaseerde biosensor zijn de beschikbaarheid van het pSNWFET inrichting en wordt gebruikt voor de meting. Echter, deze twee beperkingen gemakkelijk worden opgelost in de nabije toekomst. Veel soorten SNWFETs zijn gerapporteerd in de literatuur. De pSNWFET aangetoond in deze studie wordt nu al vervaardigd met behulp van de standaard halfgeleider-proces en kan massa geproduceerd worden met slechts kleine aanpassingen aan het commerciële wafer fabricageproces. De instrumenten voor het meten in deze studie was een standaard halfgeleiderchip analyzer. Dit houdt in dat, met een geïntegreerd circuit op het apparaat, kan draagbare instrumenten zijn ontworpen en vervaardigd met behulp van de huidige elektronische technologie.
Concluderend beschrijven we de volledige procedure voor DNA detectie op pSNWFET. Omdat de Immobilization procedure sterk van invloed op het vermogen van een biosensor om effectief biomoleculen te detecteren, dit protocol biedt stap-voor-stap bevestiging van bioprobe immobilisatie en de bereidheid van het apparaat voor DNA biosensoren toepassingen. Vergelijkbare procedures kunnen worden aangepast van dit rapport voor vele soortgelijke biosensoren toepassingen, welke aanpassingen nodig zijn. Dit rapport beschrijft ook protocollen voor het bevestigen en het oplossen van problemen van de immobilisatie van het bioprobe en het apparaat oppervlak wijzigingen. De vraag naar verschillende biosensoren toeneemt. De in dit rapport beschreven methoden passend referentiepunt voor de voorbereiding en ontwikkeling van halfgeleider-gebaseerde biosensoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | ECHO | AH-3102 | |
| (3-Amonopropyl)triethoxysilane (APTES), ≥98% | Sigma-Aldrich | A3648 | Danger |
| Ethanol, anhydrous, 99.5% | ECHO | 484000203108A-72EC | |
| Glutaraldehyde solution (GA), 50% | Sigma-Aldrich | G7651 | Avoid light |
| Sodium cyanoborohydride, ≥95.0% | Fluka | 71435 | Danger and deliquescent |
| Sodium phosphate tribasic dodecahydrate, ≥98% | Sigma | 04277 | |
| Phosphoric acid, ≥99.0% | Fluka | 79622 | Deliquescent |
| Photoresist (iP3650) | Tokyo Ohka Kogyo Co., LTD | THMR-iP3650 HP | |
| Synthetic oligonucleotides, HPLC purified | Protech Technology | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), ≥99.8% | USB | 75825 | |
| Keithley 2636 System SourceMeter | Keithley | ||
| SR830 DSP Lock-In Amplifier | Stanford Research Systems | ||
| SR570 Low-noise Current Preamplifier | Stanford Research Systems | ||
| Ni PXI Express | National Instruments |
References
- Lin, C. H., et al. Surface composition and interactions of mobile charges with immobilized molecules on polycrystalline silicon nanowires. Sensor Actuat B-Chem 211. 211, 7-16 (2015).
- Patolsky, F., et al. Electrical detection of single viruses. P Natl Acad Sci USA. 101, 14017-14022 (2004).
- Wang, W. U., Chen, C., Lin, K. H., Fang, Y., Lieber, C. M. Label-free detection of small-molecule-protein interactions by using nanowire nanosensors. P Natl Acad Sci USA. 102, 3208-3212 (2005).
- Patolsky, F., et al. Detection, stimulation, and inhibition of neuronal signals with high-density nanowire transistor arrays. Science. 313, 1100-1104 (2006).
- Bi, X., et al. Development of electrochemical calcium sensors by using silicon nanowires modified with phosphotyrosine. Biosens Bioelectron. 23, 1442-1448 (2008).
- Lin, T. W., et al. Label-free detection of protein-protein interactions using a calmodulin-modified nanowire transistor. P Natl Acad Sci USA. 107, 1047-1052 (2010).
- Mishra, N. N., et al. Ultra-sensitive detection of bacterial toxin with silicon nanowire transistor. Lab on a chip. 8, 868-871 (2008).
- Lin, C. H., et al. Ultrasensitive detection of dopamine using a polysilicon nanowire field-effect transistor. Chem Commun. , 5749-5751 (2008).
- Hahm, J., Lieber, C. M. Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors. Nano Lett. 4, 51-54 (2004).
- Lin, C. H., et al. Poly-silicon nanowire field-effect transistor for ultrasensitive and label-free detection of pathogenic avian influenza DNA. Biosens Bioelectron. 24, 3019-3024 (2009).
- Wu, C. C., et al. Label-free biosensing of a gene mutation using a silicon nanowire field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 25, 820-825 (2009).
- Zhang, G. -J., et al. Silicon nanowire biosensor for highly sensitive and rapid detection of Dengue virus. Sensor Actuat B-Chem. 146, 138-144 (2010).
- Lu, N., et al. CMOS-compatible silicon nanowire field-effect transistors for ultrasensitive and label-free microRNAs sensing. Small. 10, 2022-2028 (2014).
- Zheng, G., Patolsky, F., Cui, Y., Wang, W. U., Lieber, C. M. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays. Nat Biotechnol. 23, 1294-1301 (2005).
- Choi, J. H., Kim, H., Choi, J. H., Choi, J. W., Oh, B. K. Signal enhancement of silicon nanowire-based biosensor for detection of matrix metalloproteinase-2 using DNA-Au nanoparticle complexes. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 12023-12028 (2013).
- Lin, T. Y., et al. Improved silicon nanowire field-effect transistors for fast protein-protein interaction screening. Lab Chip. 13, 676-684 (2013).
- Chen, H. C., et al. A sensitive and selective magnetic graphene composite-modified polycrystalline-silicon nanowire field-effect transistor for bladder cancer diagnosis. Biosens Bioelectron. 66, 198-207 (2015).
- Lee, H. S., Kim, K. S., Kim, C. J., Hahn, S. K., Jo, M. H. Electrical detection of VEGFs for cancer diagnoses using anti-vascular endotherial growth factor aptamer-modified Si nanowire FETs. Biosens Bioelectron. 24, 1801-1805 (2009).
- Chua, J. H., Chee, R. E., Agarwal, A., Wong, S. M., Zhang, G. J. Label-free electrical detection of cardiac biomarker with complementary metal-oxide semiconductor-compatible silicon nanowire sensor arrays. Anal Chem. 81, 6266-6271 (2009).
- Lu, N., et al. Label-free and rapid electrical detection of hTSH with CMOS-compatible silicon nanowire transistor arrays. ACS Appl Mater Interfaces. 6, 20378-20384 (2014).
- Chen, H. C., et al. Magnetic-composite-modified polycrystalline silicon nanowire field-effect transistor for vascular endothelial growth factor detection and cancer diagnosis. Anal Chem. 86, 9443-9450 (2014).
- Zhang, Y. L., et al. Silicon Nanowire Biosensor for Highly Sensitive and Multiplexed Detection of Oral Squamous Cell Carcinoma Biomarkers in Saliva. Anal Sci. 31, 73-78 (2015).
- Lin, H. C., et al. A simple and low-cost method to fabricate TFTs with poly-Si nanowire channel. Ieee Electr Device L. 26, 643-645 (2005).
- Lin, H. C., Lee, M. H., Su, C. J., Shen, S. W. Fabrication and characterization of nanowire transistors with solid-phase crystallized poly-Si channels. Ieee T Electron Dev. 53, 2471-2477 (2006).
- Doering, R., Nishi, Y. Handbook of semiconductor manufacturing technology. , 2nd, CRC Press. (2008).
- Lu, M. P., Hsiao, C. Y., Lai, W. T., Yang, Y. S. Probing the sensitivity of nanowire-based biosensors using liquid-gating. Nanotechnology. 21 (425505), (2010).
- Gaspar, J., et al. Digital lock in amplifier: study, design and development with a digital signal processor. Microprocess Microsy. 28, 157-162 (2004).
- Vezenov, D. V., Noy, A., Rozsnyai, L. F., Lieber, C. M. Force titrations and ionization state sensitive imaging of functional groups in aqueous solutions by chemical force microscopy. J Am Chem Soc. 119, 2006-2015 (1997).
- Townsend, M. B., et al. Experimental evaluation of the FluChip diagnostic microarray for influenza virus surveillance. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, L. C., et al. Simultaneous detection and differentiation of Newcastle disease and avian influenza viruses using oligonucleotide microarrays. Vet Microbiol. 127, 217-226 (2008).
- Lin, C. -H., et al. Recovery Based Nanowire Field-Effect Transistor Detection of Pathogenic Avian Influenza DNA. Jpn J Appl Phys. 51 (02BL02), (2012).
- Lee, K. N., et al. Well controlled assembly of silicon nanowires by nanowire transfer method. Nanotechnology. 18 (445302), (2007).
- Li, Z., et al. Sequence-specific label-free DNA sensors based on silicon nanowires. Nano Lett. 4, 245-247 (2004).
- McAlpine, M. C., et al. High-performance nanowire electronics and photonics on glass and plastic substrates. Nano Lett. 3, 1531-1535 (2003).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire nanosensors for highly sensitive and selective detection of biological and chemical species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
- Patolsky, F., Zheng, G., Lieber, C. M. Nanowire-based biosensors. Anal Chem. 78, 4260-4269 (2006).
- Hsiao, C. Y., et al. Novel poly-silicon nanowire field effect transistor for biosensing application. Biosens Bioelectron. 24, 1223-1229 (2009).
