Introduction
Кремний нанопроволок полевые транзисторы (SNWFETs) имеют преимущества ультра-высокой чувствительности и прямых электрических ответов на изменения окружающей среды заряда. В SNWFETs п-типа, например, когда отрицательно (или положительно) заряженная молекула приближается к нанопроволоки кремния (SNW), несущие в SNW истощаются (или накапливать). Следовательно, проводимость SNWFET уменьшается (или увеличивается) 1. Таким образом, можно обнаружить любой заряженная молекула вблизи SNW поверхности SNWFET устройства. Жизненно важные биомолекулы, включая ферменты, белки, нуклеотиды, а также многих молекул на поверхности клетки являются носителями заряда и могут быть проверены с помощью SNWFETs. С помощью соответствующих модификаций, в частности иммобилизации биомолекулярной зонд на SNW, A SNWFET может быть развит в этикеточной свободной биосенсора.
Наблюдение с помощью биомаркеров имеет решающее значение для диагностики заболеваний. Как показано в таблице 1, несколько исследований использовали NWFET на основе биосенсоров для этикетки , свободной, ультра-высокой чувствительности, а также обнаружение в реальном времени различных биологических мишеней, в том числе одного вируса 2, аденозинтрифосфата и киназы связывания 3, нейронные сигналы 4, ионы металлов 5,6, бактериальные токсины 7, 8 допамина, ДНК 9-11, РНК 12,13, ферментные и биомаркеров рака 14-19, человеческие гормоны 20 и цитокины 21,22. Эти исследования показали, что NWFET основе биосенсоры представляют собой мощную платформу для обнаружения для широкого спектра биологических и химических частиц в растворе.
В биосенсоров SNWFET основе, зонд, иммобилизованный на поверхности SNW устройства распознает специфическую biotarget. Иммобилизации bioprobe обычно включает в себя ряд этапов, и это очень важно, чтобы каждый шаг правильно выполняется для обеспечения надлежащего функционирования биосенсора. Различные методы были разработаны для анализа Surface состав, в том числе и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС), эллипсометрии, измерения угла контакта, атомно-силовой микроскопии (АСМ) и сканирующей электронной микроскопии (SEM). Такие методы, как атомно-силовой микроскопии и SEM обеспечивают прямое доказательство bioprobe иммобилизации на нанопроволоки устройства, в то время как методы, такие как XPS, эллипсометрии и измерения угла смачивания зависят от параллельных экспериментов, выполненных на других подобных материалов. В этом докладе мы описываем подтверждение каждой стадии модификации с помощью двух независимых методов. XPS используется для изучения концентрации специфических атомов на поликремния вафель, а также изменения в электрических свойствах устройства измеряются непосредственно, чтобы подтвердить изменение заряда на поверхности SNW. Мы используем биодат- ДНК с использованием поликристаллических SNWFETs (pSNWFETs) в качестве примера, чтобы проиллюстрировать этот протокол. Иммобилизации ДНК-зонд на поверхности SNW включает три этапа: модификация группы амина на нативного гидроксила поверхности SNW, алмодификация группы вого альдегида и 5'-aminomodified ДНК-зонд иммобилизации. На каждом этапе модификации, устройство может непосредственно обнаружить изменение заряда функциональной группы , иммобилизованным на поверхности SNW, поскольку поверхностные заряды вызывают локальные межфазных потенциальные изменения над диэлектрик затвора , которые изменяют ток канала и проводимость 1. Обвинения, окружающие поверхности SNW могут электрически модулировать электрические свойства pSNWFET устройства; Таким образом, поверхностные свойства SNW играют решающую роль в определении электрических характеристик устройств pSNWFET. В сообщенных процедурах, иммобилизация в bioprobe на поверхности SNW может быть непосредственно определена и подтверждена с помощью электрического измерения и устройство подготовлено к биодат- приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление и сохранение pSNWFET устройств
- Изготовление устройств
Примечание: pSNWFET был изготовлен с использованием технологии боковина распорную как сообщалось ранее 23,24.- Подготовьте ворота диэлектрический слой.
- Закрывают 100-нм толщиной термического оксида (SiO 2) слоя на подложке Si с помощью (технологического газа O 2 и Н 2 при 980 ° С в течение 4 ч) процесс влажного окисления 25.
- Депозит 50 нм толщиной нитрид (Si 3 N 4) слой с использованием низкого давления , химического осаждения из паровой фазы (LPCVD) 25 при температуре 980 ° С в течение 4 часов.
- Осажденного слоя 100 нм толщиной тетраэтоксисилана (ТЭОС) с использованием LPCVD 25 при 780 ° С в течение 4 часов.
- Выполните стандартную литографию с помощью шагового I-линии для определения оксида фиктивных структур.
- Нанести на поверхность пластины с 830-нм толщиной слоя фоторезиста.
- яnsert рисунком определенных фотошаблона в I-линии степпере.
- Процесс экспозиции с помощью I-линии степпер (длина волны: 365 нм) при прочности 1,980 Дж при комнатной температуре.
- Разработка пластины внутри разработчика в течение 5 мин.
- Выполните изотропный процесс травления с использованием стандарта с индуктивно связанной плазмой 25 офортистом с HBr и Cl плазменного газа в течение 1 мин.
- Осаждение слоя 100 нм толщиной аморфного кремния (α-Si) с помощью LPCVD 25.
- Выполнение стадии отжига при 600 ° С в N 2 окружающей среды в течение 24 часов , чтобы превратить альфа-Si в поликристаллическую структуру.
- Ионы Implant фосфорные через источник / стоком (S / D) легирования при низкой энергии (5E 15 см -2) 25.
- Выполните стандартную литографию с помощью шагового I-линии , чтобы удалить слой поли-Si и образуют поликремния нанопроволоки (pSNW) 25.
Примечание: Повторите шаг 1.1.3 имплантировать DOPмуравьи в отличных от S / D регионов местах с удалением поли-Si и образуют каналы боковина Si в самостоятельной манере выровнен. - Выполните процесс пассивации (200 нм толщиной ТУС оксидного слоя) с помощью LPCVD при 780 ° С в течение 5 часов 25.
- Выполните стандартную литографию с помощью шагового I-линии, чтобы выставить нанопроволоки каналы и формы тестовых подушечки с помощью двухступенчатый сухой / влажный процесс травления.
- Повторите шаг 1.1.3.
- Выполнение процесса влажного травления (DHF: HF / H 2 O в течение 1 мин).
- Подготовьте ворота диэлектрический слой.
- сохранение вафельные
- Уплотнение пластины в сумке вакуум хранения и хранить его в электронном сухом шкафу (относительная влажность <40% при комнатной температуре).
2. Предварительная обработка устройства
- очистка устройства
- Ополосните устройство с чистым ацетоном.
- Разрушать ультразвуком (46 кГц, 80 Вт) устройство в чистом ацетоне в течение 10 мин. <литий> Разрушать ультразвуком (46 кГц, 80 Вт) устройство в чистом этаноле (99,5%) в течение 5 мин.
- Укладкой поверхность устройства с азотом.
- Рассматривать устройство с O 2 плазмы при 18 Вт в течение 30 сек.
3. Иммобилизация ДНК-зонд на поверхности устройства
- Модификация аминогруппе
- Погрузить устройство в 2,0% (3-аминопропил) триэтоксисиланом (APTES) / раствор этанола в течение 30 мин.
- Промыть устройство с этанолом три раза, а затем гомогенат (46 кГц, 80 Вт) устройство в этаноле в течение 10 мин.
- Нагреть устройство на горячей плите при 120 ° С в течение 10 мин для создания аминогруппы на SNWs.
- Альдегидная группа модификация
- Опустить устройство в 12,5% глутаральдегида в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы создать альдегидных групп на поверхности. Избегайте попадания света.
- Вымойте остроумие устройствач 10 мМ натрий-фосфатного буфера (Na-ПБ; рН 7,0) три раза, а затем сушить поверхность устройства с помощью азота.
- ДНК - зонд иммобилизации
- Погрузить устройство в растворе, содержащем 1 мкМ ДНК зондов в течение ночи.
- Погрузите устройство в 10 мМ трис - буфера (рН 8,0) с 4,0 мМ NaBH 3 CN в течение 30 мин , чтобы блокировать непрореагировавшие альдегидные группы.
- Вымойте устройство с Na-PB (рН 7,0) в три раза, а затем сушите поверхность устройства с азотом.
4. Подтверждение и анализ модификации поверхности на pSNWFET
- профиль рН после каждой стадии модификации поверхности
- Готовят 10 мМ Na-PB рН 3.0-9.0.
- Готовят 10 мМ фосфата натрия трехосновная додекагидрат (Na 3 PO 4) в деионизированной воде (рН 11,60).
- Готовят 10 мМ фосфорной кислоты (H 3 PO 4) в деионизированной воде(РН 2,35).
- Поместите электрод рН в 500 мл 10 мМ Na 3 PO 4 буфера, и смешать это решение с различными объемами 10 мМ H 3 PO 4 буфера при измерении величины рН , чтобы получить буферы со значениями рН 3,0, 4.0, 5.0, 6.0 , 7,0, 8,0 и 9,0.
- измерение проводимости AC
Примечание: Измерительный контур включен небольшой генератор сигналов переменного тока и микропровода Au, который служил в качестве жидкого электрода затвора.- Определение оптимальной жидкости напряжения на затворе (V LG) для измерения 26 на каждой стадии модификации (шаги 2.2, 3.1, 3.2 и 3.3).
Примечание: Электрические свойства устройства после того, как четыре модификации поверхности на SNW измеряли, как описано в данном разделе. На этапе 2.2, неизмененной pSNWFET, содержащей нативный оксидного слоя изменяется; шаг 3.1 изменяющие регистрация требует устройство с аминогруппой APTES; шаг 3.2 включает в себя модификацию с незаряженнымфункциональная группа глутаровый альдегид; и шаг 3.3 включает в себя модификацию ДНК-зонда.- для непосредственного контакта с SNW: Доставьте 10 мМ Na-PB (рН 7,0), раствор на поверхность SNW с помощью шприцевого насоса (5,0 мл / ч расход).
- Измерьте в реальном времени электрическую проводимость устройства в то время как подметание V LG от 0,80 до 1,30 В.
- Выполните измерения проводимости с использованием технологии 27 блокировки в при комнатной температуре.
- Преобразование сигналов тока переменного тока в сигнал напряжения переменного тока с помощью тока предусилитель с низким уровнем шума.
- Сбор данных по проводимости (G) при увеличении V LG от 0,80 до 1,30 В (интервал = 0,02 V).
- Определить оптимальный V LG (наиболее чувствительным V LG) устройства 26.
- Изобразите кривые GV LG от стадии 4.1.2.1.2.3 получить уравнение кривой.
- Difсовыми уравнение и вычислить значения в каждой точке V LG.
- Разделить значение из шага 4.1.2.1.3.2 с помощью G, и определить оптимальное V LG в соответствии с максимальным числом.
- Мера в реальном времени электрическую проводимость профиля рН на каждом этапе модификации поверхности.
- Выполните измерения проводимости с использованием технологии 27 блокировки в при комнатной температуре.
- Преобразование токового сигнала переменного тока в сигналы напряжения переменного тока с помощью тока предусилитель с низким уровнем шума.
- Установите оптимальный V LG для каждого шага модификации поверхности (шаг 2.2: V LG = 1,02, шаг 3.1: V LG = 0,98, шаг 3.2: V LG = 0,98, и шаг за шагом 3.3: V LG = 1,0).
- Доставьте раствора 10 мМ Na-PB со значениями рН от 3,0 до 9,0 м до поверхности SNW (расход: 5,0 мл / час), А также собирать данные о проводимости при напряжении сливного 0,01 В.
- Определение оптимальной жидкости напряжения на затворе (V LG) для измерения 26 на каждой стадии модификации (шаги 2.2, 3.1, 3.2 и 3.3).
- Готовят 10 мМ Na-PB рН 3.0-9.0.
- Измерение электрических свойств (кривая I D -V BG) устройства в 10 мМ Na-PB (рН 7,0) после каждой стадии модификации поверхности (шаги 2.2, 3.1, 3.2 и 3.3.)
Примечание: Электрические свойства устройства после того, как четыре модификации поверхности на SNW измеряли: на шаге 2.2, неизмененной pSNWFET, содержащей нативный оксидного слоя изменяется; шаг 3.1 включает модификацию устройства с аминогруппой APTES; шаг 3.2 влечет за собой модификацию с незаряженной функциональной группой глутаральдегид; и шаг 3.3 влечет за собой модификацию ДНК-зонда.- Доставьте 10 мМ Na-PB (рН 7,0) раствор на поверхность SNW (шаги 2,2, 3,1, 3,2 и 3,3) с помощью шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч) для прямого контакта с SNW.
- Измерьте I D
- Выберите режим "nMOSFET".
- Выберите "I D - V BG" модули.
Примечание: I D является ток стока / источника, и V BG является обратно напряжение затвора. - Установить постоянное напряжение смещения (V D = 0,5 В) в то время как подметание потенциал затвора (V BG) от -1 до 3,0 В (интервал = 0,2 В).
- Нажмите на значок Run для получения I D - кривые V BG.
5. ДНК биодат-
Примечание: В типичном эксперименте I D - V B G кривой определяется три раза , чтобы гарантировать , что никаких дальнейших вариации не OBSErved.
- Определение базовой линии
- Доставьте 10 мМ раствора Na-PB (рН 7,0) с ДНК с иммобилизованными зондами SNW поверхности в течение 10 мин при помощи шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч), а затем инкубировать SNW в течение 30 мин.
- Измерьте I D устройства (повторите шаг 4.2.2).
- Почувствовав ДНК гибридизация / ДНК
- Нагрузка 10 вечера комплементарной ДНК-мишень на ДНК с иммобилизованными зондами SNW поверхности в течение 10 мин с использованием шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч), а затем инкубировать SNW в течение 30 мин.
- Доставьте 10 мМ раствора Na-PB (рН 7,0) на поверхность SNW в течение 10 мин при помощи шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч), чтобы промыть несвязанный ДНК-мишени прочь.
- Повторите шаг 4.2.2 для измерения I D устройства.
- Reconfirm сигнал гибридизации ДНК / ДНК.
- Нагрузка 1 нмоль ДНК на восстановление тон ДНК с иммобилизованными зондами поверхность SNW в течение 10 мин с помощью шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч), а затем инкубировать SNW в течение 30 мин.
- Доставьте 10 мМ раствора Na-PB (рН 7,0) на поверхность SNW в течение 10 мин при помощи шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч).
- Повторите шаг 4.2.2 для измерения I D устройства.
- Отрицательный контроль
- Нагрузка 100 пМ некомплементарны ДНК на ДНК с иммобилизованными зондами SNW поверхности в течение 10 мин с использованием шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч), а затем инкубировать SNW в течение 30 мин.
- Доставьте 10 мМ раствора Na-PB (рН 7,0) на поверхность SNW в течение 10 мин при помощи шприцевого насоса (скорость потока: 5,0 мл / ч).
- Повторите шаг 4.2.2 для измерения I D устройства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различные SNWFETs Сообщалось , что служат в качестве преобразователей биосенсоров (таблица 1). Монокристаллического SNWFETs (sSNWFETs) и pSNWFETs показывают сопоставимые электрические свойства, как преобразователей в водных растворах, и оба, как сообщается, имеют много приложений биодат-. Преимущественный особенностью устройства pSNWFET , используемого в данном исследовании , является простым и изготовление недорогих процедура. На рисунке 1а показаны основные этапы изготовления pSNWFET. Оптическое изображение фильеру с 6-дюймовой пластины (рис 1b) и СЭМ - изображениях (рис 1в) одного устройства (два SNWs, приблизительно 100 нм в ширину и 1,6 мкм в длину) , были получены.
На рисунке 2а показана процедура ДНК зонда иммобилизации на поверхности SNW. Каждый шаг модификация была подтверждена с помощью XPS (Рисунок 2b (рис проводимости 2с, d) показаны на различных этапах SNW модификации поверхности. Для немодифицированного pSNWFET , содержащей нативный оксидного слоя на поверхности SNW, гидроксильные группы (-ОН) ионизовались с образованием заряженных групп (-O -) при увеличении значений рН (черная линия). Уменьшение проводимости при рН от 6,0 до 9,0 указывает на то, что кислота , константа диссоциации (рК а) гидроксильной группы может быть установлено равным приблизительно 7,0. Проводимость вероятно увеличивается при рН 3,0 до 6,0 , из - за увеличения ионной силы, влияющие характеристики устройства 1. После модификации APTES, ответ на проводимости APTES-модифицированного устройства показали высокую вариацию (красная линия). Группа амина (рК а = 4,0) из APTES может быть протонирована при низком рН , чтобы получить положительный заряд 28. Таким образом, проводимость SNW уменьшается с дискретными изменениями в значениях рНот 3,0 до 9,0. После того, как SNW был модифицирован с помощью глутаральдегида, ответ был относительно стабильным в течение проводимости при рН от 3,0 до 9,0 (синяя линия). Это может быть связано с незаряженной функциональной группой, которая нечувствительна к изменению рН среды. Наконец, после того, как отрицательно заряженная ДНК-зонд был иммобилизован, проводимость слегка уменьшается с увеличением значений рН (зеленая линия).
Сдвиг в электрических свойствах устройства (Рисунок 2e) с различными модификациями подтверждает изменение поверхности SNW. В таких экспериментах I D -V G кривая немодифицированного pSNWFET использовалась в качестве базовой линии (черная линия). После того , как SNW был погружен в APTES, то I D -V G кривая устройства смещено влево (увеличение тока) из - за положительного заряда на поверхности Caus SNWред аминогруппе на APTES (черный с красной линии). После сопряжения глутаральдегиду к APTES-модифицированного устройства, то I D -V G кривая сдвигается назад вправо из - за образования имида облигаций. Ток уменьшился, потому что положительно заряженный амин превращали в нейтрально заряженный имид (красный синяя линия). И, наконец, 5'-amnimodified ДНК-зонд был введен, чтобы связываться с APTES-глютаральдегиду модифицированного устройства. Сахарофосфатная основой ДНК вызвала кривая I D -V G , чтобы перейти в крайнее правое (синий цвет к зеленой линии), что согласуется с эффектом отрицательных ионов на п-типа полевого транзистора.
Обнаружение гибридизации ДНК / ДНК на pSNWFET показано на рисунке 3. Зонд, цель, восстановление и некомплементарные ДНК - последовательности , предназначенные для обнаружения вируса птичьего гриппа (ВГП) 29,30 таблице 2. I D -V G кривой ДНК - зонд , модифицированный pSNWFET , полученного в 10 мМ Na-PB (рН 7,0) использовали в качестве базовой линии (черный). Впоследствии, 10 вечера ДНК-мишень была введена для гибридизации с иммобилизованным зондом ДНК на поверхности SNW, и наблюдалось явное уменьшение тока стока устройства (красная линия). Пониженная I D в п-типа SNWFET подразумевает повышенный отрицательный заряд (вызванный остова) на поверхности SNW. ДНК восстановления был разработан , чтобы rehybridize с ДНК - мишенью и освободить ДНК - зонд 31. Если ДНК восстановления правильно разработана, реакция термодинамически способствует перегибридизации дуплекса ДНК-мишени восстановления, так как более комплементарные нуклеотиды доступны между этими двумя нитями ДНК (таблица 1) , чем между зондом и ДНК - мишенью. Добавление 1 нМ ДНК восстановления (синяя линия) Также подтвердил, что электрический отклик ДНК-мишени, было связано с гибридизацией зонд-мишень ДНК и освобождали ДНК-зонд, который можно повторно использовать для последующих экспериментов. В качестве отрицательного контроля, некомплементарной ДНК [ВГП мишень подтипа Н5 ДНК] (100 мкМ) также вводят и смешивают с ДНК - зондом, а кривая I D -V G осталась без изменений. ДНК-зонд, иммобилизованным на pSNWFET нечувствительна к некомплементарной ДНК. Только ДНК - мишени вызывает заметный сдвиг в I D - V G кривой. I D - G кривая V возвращается к базовой линии после инкубации с ДНК восстановления.
Рисунок 1. Приготовление pSNWFET устройства. (А) Схема устройства Фабрикатион. (I) 6-дюймовый кремниевую пластину закрывали 100 нм толщиной теплового оксидного слоя. Далее, 50-нм толщиной нитрид и 100 нм, толстые слои ТЭОС были сданы на хранение в качестве исходных материалов с использованием LPCVD. (II) Структура манекена ТУС была определена и сформирована с использованием стандартной литографии; два слоя изолятора (оксид и нитрид) служил в качестве диэлектрика затвора. (III) 100-н-толстый слой α-Si, осаждали с помощью LPCVD, и отжиг был впоследствии проведен для преобразования альфа-Si в поли-Si. (IV) S / D легирование Затем проводили через ионов фосфора имплантации. (V) боковине каналы Si были сформированы в себя выровненных способом, с использованием стандартного литографию. (VI) Вид сверху сфабрикованному структуры устройства с pSNW. (Б) оптические изображения чипа pSNWFET биосенсора. (С) SEM изображение одного устройства pSNWFET. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Модификация поверхности и проверка на pSNWFET. (А) Схема поверхности функционализации ДНК и гибридизации / ДНК - ДНК. (Б) РФЭС - спектры C1s, O1s и сигналов n1s из кремниевой пластины (выборки глубина = 7,5 нм), где была выполнена последовательная ступенчатое модификация поверхности с иммобилизованным ДНК - зонда. спектры высокого разрешения получали, и общее энергетическое разрешение было установлено на 0,1 эВ. (С) в режиме реального времени кривая при различных значениях рН , при каждом шаге модификации поверхности; 10 мМ Na-PB впрыскивали в следующем порядке: рН 7,0 → рН 6,0 → рН 5,0 → рН 4,0 → рН 3,0 → рН 4,0 → рН 5,0 → рН 6,0 → 7,0 → рН 8,0 → рН 9,0 → рН 8,0 → рН 7,0 , (D) Среднее ПОВЕДЕНИЯстояние при значениях рН от 3,0 до 9,0 с помощью 10 мМ Na-PB после каждой стадии модификации поверхности. (Д) Электрические свойства (I D - V BG Кривые) от pSNWFET на каждом шаге модификации поверхности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. ДНК биодат- на pSNWFET. Кривые I D -V G ДНК зонда-модифицированного pSNWFET были получены в 10 мМ Na-PB (рН 7) (черная линия). I D -V G кривой после гибридизации зонда и ДНК - мишени (красная линия) была получена путем введения 10 мкМ ДНК - мишени и промыванием 10 мМ Na-PB (рН 7). ДНК-зонд (синяя линия) была восстановлена путем добавления 1 нМ ДНК восстановления для удаления ДНК-мишени. Некомплементарных ДНК использовали в качестве отрицательного контроля в этом эксперименте (зеленая линия).
| Био-мишень | чувствительность | кристаллический | Тип | Справка |
| pH | Один | п | 35 | |
| Муковисцидоз ΔF508 | 3 основания удаление | Один | п | 9 |
| Грипп A | один вирус | Один | п | 2 |
| чувствительный ATP | 1:00 вечера | Один | п | 3 |
| Теломераза | 10 Хела клеток | Один | п | 14 |
| PSA / CEA / муцин-1 | <1,4 / 2/5 пг / мл | Один | п / р | 14 |
| Нейрональная сигнал | Один | п / р | 4 | |
| Ca 2+ | 100 нмоль | Один | N | 5 |
| Бактериальный токсин (SEB) | 10 Fm | поли | п | 7 |
| допамин | 1 Fm | поли | N | 8 |
| Тропонина-Т | 1 фг / мл | Один | N | 19 |
| Сосудистый эндотелиальный фактор роста | 1,04 / 0,104 нМ | Один | п / р | 18 |
| BRAF V599E | 1-базовый несоответствие | Один | N | 11 |
| 1 Fm | поли | N | 10 | |
| Авидин / стрептавидин | 1,48 нмоль / 167 Fm | поли | N | 37 |
| Ca 2+ / тропонина I | 1 мкМ / 7 нМ | Один | п | 6 |
| Денге серотипа 2 РНК | <10 фм | Один | N | 12 |
| CaM протеинкиназы | выражается клеточный лизат | Один | п | 16 |
| Матрица металлопротеиназы-2 | 100 Fm | Один | п | 15 |
| MicroRNAs (MIR-21 / микроРНК-205) | 1 zeptomole (около 600 экземпляров) | Один | п | 13 |
| Сосудистый эндотелиальный фактор роста | 1,25 пг / мл | поли | N | |
| Человеческого тиреотропного гормона | 12:11 вечера | Один | N | 20 |
| Белок аполипопротеина A II | 6,7 пг / мл | поли | N | 17 |
| Интерлейкин 8 / фактор некроза опухоли α | 10 фг / мл | Один | N | 22 |
Таблица 1. Частичный список биомишеней исследовали с использованием SNWFET устройств.
| Олигонуклеотиды | Последовательность |
| ВГП H1 5'-aminomodified ДНК-зонд | 5'-NH 2 -C 6 -CACACTCTGTCAACCTAC-3 ' |
| ВГП H1 ДНК-мишени | 5'-CCATTGTGACTGTCCTCAAGTAGGTTGACAGAGTGTG-3 ' |
| ДНК восстановление ВГП H1 | 5'-CACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGG-3 ' |
| Non-комплементарной ДНК (ВГП Н5 ДНК-мишень) | 5'-TGATAACCAATGCAGATTTG-3 ' |
Таблица 2. Последовательности синтетических олигонуклеотидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Коммерциализация сверху-вниз и изготовление снизу вверх подходит для sSNWFETs считается трудным из - за своей стоимости 32,33, SNW управления положением 34,35, и его низкой масштабах производства 36. В противоположность этому , фабрикации pSNWFETs проста и низкая стоимость 37. С помощью подхода сверху вниз и комбинации с боковой стенкой разделительного методика формирования (рисунок 1), размер SNW можно регулировать путем регулирования продолжительности реактивного плазменного травления. Процедуры подготовки нанопроволок на pSNWFET показано на рисунке 1а может быть легко адаптирована для коммерческих полупроводниковых объектов. Следовательно, pSNWFETs имеют несколько преимуществ, включая эффективность затрат, простой технологии строительства, а также процесса изготовления КМОП-совместимыми и, таким образом, могут быть применены в биодатчиков.
В отличие от изготовления полупроводникового устройства, процесс хорошо определены в Commercial объектов, иммобилизация bioprobe на устройстве могут отличаться для каждого конкретного применения. Иммобилизации ДНК - зонда на поверхности SNW показана на рисунке 2а в качестве примера. Другие bioprobes, такие как антитела, аптамеры, и ферменты, также могут быть иммобилизованы на поверхности SNW для обнаружения различных целей. Следующие шаги являются критически важными для успешной иммобилизации ДНК-зонда. В нашем протоколе, в панельном pSNWFET устройство очищают и обрабатывают плазмой кислорода, а затем погружают в раствор / этанол APTES для создания аминных групп на SNWs. Далее, устройство погружают в раствор глутарового альдегида для создания альдегидных групп на поверхности. Эти группы впоследствии конъюгированный с ДНК-зондом, 5'-aminomodified. Многоступенчатая конъюнкции между молекулами сшивающего линкера и bioprobe требовалось для преобразования полупроводникового устройства к биосенсора. Таким образом, крайне важно, чтобы гарантировать, что каждый шаг является успешным. На каждом шагеДНК-зонда иммобилизации, РФЭС был использован для анализа и подтвердить состав и химический состав поверхности. Атомные концентрации углерода, кислорода и азота определяли на основе XPS сканов соответствующих пиков, как это показано на рисунке 2b. После добавления ДНК-зонда, наиболее заметные изменения были увеличение концентрации углерода и азота. Увеличивается тенденция наблюдалась в концентрации углерода и азота, при каждом шаге процедуры иммобилизации ДНК-зонд. Концентрация кислорода уменьшилось во время процедуры, так как родная гидроксильная группа покрывались за счет модификации поверхности. Эти результаты показали , что ДНК - зонд был иммобилизован, что согласуется с изменением электрических свойств, как показано на фиг.2с, D, и е. Вышеуказанные процедуры полезны для устранения неполадок в случае неудачной модификации поверхности. Тем не менее, они, как правило, выполняются на отдельной WАВЭС покрыт материалом, подобным тому, что на поверхности нанопроводов. Прямые доказательства изменений в электрических свойствах модифицированного устройства необходимо для подтверждения результатов модификации поверхности на устройстве, как описано в следующих параграфах.
Одним из наиболее часто используемых методов для мониторинга изменений непосредственно на поверхности FET устройства является чувствительный рН, как показано на рисунке 2d и д. Различные модификации поверхности приводит к изменению заряда на поверхности SNW, в значительной степени влияет на поверхностный потенциал pSNWFET при различных условиях. Мы использовали широкий дальности буфер рН растворов для обнаружения изменений в проводимости, соответствующих функциональных групп на поверхности SNW. С механистической точки зрения, увеличение проводимости при изменении рН (увеличение ионов водорода) согласуется с увеличением положительного заряда поверхности, которая «включает» в п-типа полевого транзистора через accumulatiна электронов. В режиме реального времени электрические ответы на проводимости pSNWFET можно измерить в буферных растворах с рН в пределах от 3,0 до 9,0. Методы, описанные в настоящем докладе, являются полезными для изучения ли готов к применению биодат- датчик на базе полупроводников.
Рисунок 2е иллюстрирует удобный способ определения результатов модификации поверхности путем прямого измерения электрических свойств устройства. Изменения в I D - кривые V G , показанные на рисунке 2e соответствуют каждой стадии ДНК - зонда иммобилизации на поверхности SNW. Согласно результатам, pSNWFETs могут быть непосредственно использованы для подтверждения процедуры на каждом шаге bioprobe иммобилизации. Этот результат также показывает, что модифицированный pSNWFET готов к применению биодат-. Эти процедуры особенно полезны, когда иммобилизация procedurэс хорошо известны. Функция биосенсора на основе pSNWFET исследовали путем обнаружения ВГП подтипа H1 ДНК в качестве примера (рисунок 3). С помощью зонда и ДНК-мишень подходит для иллюстрации разработка нового биосенсора из-за стабильности ДНК-молекул и методов, доступных для простого получения желаемой последовательности ДНК. В дополнение к использованию некомплементарных ДНК в качестве отрицательного контроля, мы продемонстрировали, ДНК-гибридизации на pSNWFET с системой рекуперации. Это особенно полезно, когда новая система или новое устройство используется для биодат- экспериментов. Многие шаги участвуют в процессе от изготовления устройства для применения биодат-. Каждый шаг влияет на конечный результат. Кроме того, ложные положительные или ложноотрицательных результатов, как правило, получены в опытах биодат- из-за сложности среды биодат-. Таким образом, контрольные опыты имеют решающее значение, и система восстановления продемонстрировано в данном исследовании, могут значительно Facilitate выявления неожиданных факторов, которые мешают с экспериментальными результатами.
Основные ограничения для используемых в настоящее время pSNWFET на основе биосенсора являются наличие pSNWFET устройства и приборы, используемые для измерения. Тем не менее, эти два ограничения могут быть легко преодолены в ближайшем будущем. Многие виды SNWFETs были описаны в литературе. PSNWFET показано в этом исследовании уже изготовлены с использованием стандартного процесса производства полупроводников и может быть массового производства с небольшими корректировками в процессе коммерческого изготовления пластин. Приборы, используемые для измерения в данном исследовании был стандартный анализатор полупроводниковых чипов. Это означает, что, с надлежащей интегральной схемы, установленной на устройстве, портативные измерительные приборы могут быть разработаны и изготовлены с использованием современных электронных технологий.
В заключение, мы опишем полную процедуру зондирования ДНК на pSNWFET. Поскольку IMMOBПроцедура ilization сильно влияет на способность биосенсоров для эффективного обнаружения биомолекул, этот протокол обеспечивает шаг за шагом подтверждение bioprobe иммобилизации и готовность устройства к ДНК биодат- приложений. Аналогичные процедуры могут быть адаптированы из этого отчета для многих подобных приложений биодат-, для которых необходимы корректировки. Этот отчет также описывает протоколы для подтверждения и устранения неисправностей иммобилизации модификации поверхности bioprobe и устройств. Спрос на различных биосенсоров возрастает. Методы, описанные в настоящем докладе, являются адекватным ориентиром для подготовки и разработки на основе полупроводников биосенсоров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | ECHO | AH-3102 | |
| (3-Amonopropyl)triethoxysilane (APTES), ≥98% | Sigma-Aldrich | A3648 | Danger |
| Ethanol, anhydrous, 99.5% | ECHO | 484000203108A-72EC | |
| Glutaraldehyde solution (GA), 50% | Sigma-Aldrich | G7651 | Avoid light |
| Sodium cyanoborohydride, ≥95.0% | Fluka | 71435 | Danger and deliquescent |
| Sodium phosphate tribasic dodecahydrate, ≥98% | Sigma | 04277 | |
| Phosphoric acid, ≥99.0% | Fluka | 79622 | Deliquescent |
| Photoresist (iP3650) | Tokyo Ohka Kogyo Co., LTD | THMR-iP3650 HP | |
| Synthetic oligonucleotides, HPLC purified | Protech Technology | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), ≥99.8% | USB | 75825 | |
| Keithley 2636 System SourceMeter | Keithley | ||
| SR830 DSP Lock-In Amplifier | Stanford Research Systems | ||
| SR570 Low-noise Current Preamplifier | Stanford Research Systems | ||
| Ni PXI Express | National Instruments |
References
- Lin, C. H., et al. Surface composition and interactions of mobile charges with immobilized molecules on polycrystalline silicon nanowires. Sensor Actuat B-Chem 211. 211, 7-16 (2015).
- Patolsky, F., et al. Electrical detection of single viruses. P Natl Acad Sci USA. 101, 14017-14022 (2004).
- Wang, W. U., Chen, C., Lin, K. H., Fang, Y., Lieber, C. M. Label-free detection of small-molecule-protein interactions by using nanowire nanosensors. P Natl Acad Sci USA. 102, 3208-3212 (2005).
- Patolsky, F., et al. Detection, stimulation, and inhibition of neuronal signals with high-density nanowire transistor arrays. Science. 313, 1100-1104 (2006).
- Bi, X., et al. Development of electrochemical calcium sensors by using silicon nanowires modified with phosphotyrosine. Biosens Bioelectron. 23, 1442-1448 (2008).
- Lin, T. W., et al. Label-free detection of protein-protein interactions using a calmodulin-modified nanowire transistor. P Natl Acad Sci USA. 107, 1047-1052 (2010).
- Mishra, N. N., et al. Ultra-sensitive detection of bacterial toxin with silicon nanowire transistor. Lab on a chip. 8, 868-871 (2008).
- Lin, C. H., et al. Ultrasensitive detection of dopamine using a polysilicon nanowire field-effect transistor. Chem Commun. , 5749-5751 (2008).
- Hahm, J., Lieber, C. M. Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors. Nano Lett. 4, 51-54 (2004).
- Lin, C. H., et al. Poly-silicon nanowire field-effect transistor for ultrasensitive and label-free detection of pathogenic avian influenza DNA. Biosens Bioelectron. 24, 3019-3024 (2009).
- Wu, C. C., et al. Label-free biosensing of a gene mutation using a silicon nanowire field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 25, 820-825 (2009).
- Zhang, G. -J., et al. Silicon nanowire biosensor for highly sensitive and rapid detection of Dengue virus. Sensor Actuat B-Chem. 146, 138-144 (2010).
- Lu, N., et al. CMOS-compatible silicon nanowire field-effect transistors for ultrasensitive and label-free microRNAs sensing. Small. 10, 2022-2028 (2014).
- Zheng, G., Patolsky, F., Cui, Y., Wang, W. U., Lieber, C. M. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays. Nat Biotechnol. 23, 1294-1301 (2005).
- Choi, J. H., Kim, H., Choi, J. H., Choi, J. W., Oh, B. K. Signal enhancement of silicon nanowire-based biosensor for detection of matrix metalloproteinase-2 using DNA-Au nanoparticle complexes. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 12023-12028 (2013).
- Lin, T. Y., et al. Improved silicon nanowire field-effect transistors for fast protein-protein interaction screening. Lab Chip. 13, 676-684 (2013).
- Chen, H. C., et al. A sensitive and selective magnetic graphene composite-modified polycrystalline-silicon nanowire field-effect transistor for bladder cancer diagnosis. Biosens Bioelectron. 66, 198-207 (2015).
- Lee, H. S., Kim, K. S., Kim, C. J., Hahn, S. K., Jo, M. H. Electrical detection of VEGFs for cancer diagnoses using anti-vascular endotherial growth factor aptamer-modified Si nanowire FETs. Biosens Bioelectron. 24, 1801-1805 (2009).
- Chua, J. H., Chee, R. E., Agarwal, A., Wong, S. M., Zhang, G. J. Label-free electrical detection of cardiac biomarker with complementary metal-oxide semiconductor-compatible silicon nanowire sensor arrays. Anal Chem. 81, 6266-6271 (2009).
- Lu, N., et al. Label-free and rapid electrical detection of hTSH with CMOS-compatible silicon nanowire transistor arrays. ACS Appl Mater Interfaces. 6, 20378-20384 (2014).
- Chen, H. C., et al. Magnetic-composite-modified polycrystalline silicon nanowire field-effect transistor for vascular endothelial growth factor detection and cancer diagnosis. Anal Chem. 86, 9443-9450 (2014).
- Zhang, Y. L., et al. Silicon Nanowire Biosensor for Highly Sensitive and Multiplexed Detection of Oral Squamous Cell Carcinoma Biomarkers in Saliva. Anal Sci. 31, 73-78 (2015).
- Lin, H. C., et al. A simple and low-cost method to fabricate TFTs with poly-Si nanowire channel. Ieee Electr Device L. 26, 643-645 (2005).
- Lin, H. C., Lee, M. H., Su, C. J., Shen, S. W. Fabrication and characterization of nanowire transistors with solid-phase crystallized poly-Si channels. Ieee T Electron Dev. 53, 2471-2477 (2006).
- Doering, R., Nishi, Y. Handbook of semiconductor manufacturing technology. , 2nd, CRC Press. (2008).
- Lu, M. P., Hsiao, C. Y., Lai, W. T., Yang, Y. S. Probing the sensitivity of nanowire-based biosensors using liquid-gating. Nanotechnology. 21 (425505), (2010).
- Gaspar, J., et al. Digital lock in amplifier: study, design and development with a digital signal processor. Microprocess Microsy. 28, 157-162 (2004).
- Vezenov, D. V., Noy, A., Rozsnyai, L. F., Lieber, C. M. Force titrations and ionization state sensitive imaging of functional groups in aqueous solutions by chemical force microscopy. J Am Chem Soc. 119, 2006-2015 (1997).
- Townsend, M. B., et al. Experimental evaluation of the FluChip diagnostic microarray for influenza virus surveillance. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, L. C., et al. Simultaneous detection and differentiation of Newcastle disease and avian influenza viruses using oligonucleotide microarrays. Vet Microbiol. 127, 217-226 (2008).
- Lin, C. -H., et al. Recovery Based Nanowire Field-Effect Transistor Detection of Pathogenic Avian Influenza DNA. Jpn J Appl Phys. 51 (02BL02), (2012).
- Lee, K. N., et al. Well controlled assembly of silicon nanowires by nanowire transfer method. Nanotechnology. 18 (445302), (2007).
- Li, Z., et al. Sequence-specific label-free DNA sensors based on silicon nanowires. Nano Lett. 4, 245-247 (2004).
- McAlpine, M. C., et al. High-performance nanowire electronics and photonics on glass and plastic substrates. Nano Lett. 3, 1531-1535 (2003).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire nanosensors for highly sensitive and selective detection of biological and chemical species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
- Patolsky, F., Zheng, G., Lieber, C. M. Nanowire-based biosensors. Anal Chem. 78, 4260-4269 (2006).
- Hsiao, C. Y., et al. Novel poly-silicon nanowire field effect transistor for biosensing application. Biosens Bioelectron. 24, 1223-1229 (2009).
