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Chemistry

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

Questo protocollo descrive le specifiche tecniche utilizzate per la caratterizzazione di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans. De-inamidate pareti cellulari grano endosperma sono stati isolati come un residuo di alcool-solubile (AIR) 1 e in sequenza estratta con acqua (W-sol Fr) e 1 M KOH contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto da Ratnayake et al. (2014) 2. Due approcci diversi (vedi sintesi in figura 1) vengono adottati. Nel primo, intatti AX W-sol sono trattati con 2AB codificare il RE backbone residuo originale zucchero catena e poi trattati con un dell'endoxilanasi per generare una miscela di RE 2AB marcato e regione interna riducendo oligosaccaridi, rispettivamente. In un secondo approccio, il KOH-sol Fr viene idrolizzato con dell'endoxilanasi per generare prima una miscela di oligosaccaridi che vengono successivamente etichettati con 2AB. I enzimaticamente rilasciati ((ONU) con tag) oligosaccaridi da entrambiW- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata di entrambi gli oligosaccaridi nativi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS e ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito Koh-sol AX si caratterizzano anche per la risonanza magnetica nucleare (NMR) che fornisce anche informazioni sulla configurazione anomerico. Queste tecniche possono essere applicate ad altre classi di polisaccaridi utilizzando le appropriate endo-idrolasi.

Introduction

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Heteroxylans sono una famiglia di polisaccaridi che sono i polisaccaridi predominanti non cellulosici delle pareti primarie di erbe e pareti secondaria di tutti angiosperme 3-6. Le dorsali Xylan si differenziano per i loro tipi e modelli di sostituzione con glicosil (acido glucuronico (GlcA), arabinosio (Araf)) e residui seconda tipo di tessuto, stadio di sviluppo e le specie 7 non glicosil (O-acetil, acido ferulico).

Le pareti di grano (Triticum aestivum L.) endosperma sono composti principalmente da arabinoxilani (AXS) (70%) e (1 → 3) (1 → 4) -β glucani-D-(20%) con piccole quantità di cellulosa e heteromannans (2% ciascuno) 8. La dorsale xilano può essere variamente un-sostituito e prevalentemente mono-sostituito (principalmente O-2 posizioni e, in misura minore, O-3 posizioni) e (O-2 e O-3 posizioni) con α-L-Ara disostituito f residui 9. La fine di ridurre (RE) di eteroxilani da dicotiledoni (ad esempio, Arabidopsis thaliana) 10 e gimnosperme (ad esempio, abete rosso (Picea abies)) 11 contiene una caratteristica sequenza tetrasaccaride glycosyl; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl p. Per comprendere biosintesi e funzione (biologici ed industriali) heteroxylan, è importante sequenziare completamente backbone xilano di comprendere i tipi e modelli di sostituzione nonché la sequenza dell'estremità riducente (RE).

Tecniche specifiche utilizzate per la caratterizzazione strutturale di riduzione finale (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans sono descritti in questo manoscritto. Le tecniche si basano su fluoroforo tagging (con 2 aminobenzamide (2AB)) all'estremità riducente (RE) della catena heteroxylan prima enzimatica (dell'endoxilanasi) idrolisi. Questo approccio, in particolare per il sequenziamento RE, siaprima riportato dal laboratorio York 10,12-13 ma viene esteso per includere la sequenza regione interna ed è una combinazione di tecniche consolidate che è ugualmente adattabile a tutti heteroxylans indipendenti della loro fonte di isolamento. Questo approccio può essere applicato anche ad altre classi di polisaccaridi utilizzando (dove disponibile) le opportune endo-idrolasi.

Nel presente studio, pareti cellulari frumento endosperma de-inamidata stati isolati come un residuo di alcool insolubili (AIR) e sequenzialmente estratta con acqua (W-sol Fr) e KOH 1M contenente 1% NaBH 4 (KOH-sol Fr) come descritto in Ratnayake et al. (2014) 2. Gli oligosaccaridi rilasciate sia da W- e Frs KOH-sol sono poi metilato e l'analisi strutturale dettagliata sia dei nativi oligosaccaridi e denaturato viene eseguita utilizzando una combinazione di MALDI-TOF-MS, ESI-MS-QTOF-accoppiato con HPLC con il separazione cromatografica online utilizzando un C-18 colonna RPe ESI-MS n. Dell'endoxilanasi digerito KOH-sol AX è stato caratterizzato anche da risonanza magnetica nucleare (NMR).

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Protocol

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1. L'etichettatura della Fine Riduzione (RE) Zucchero Residuo di W-sol AX con 2-aminobenzamide (2AB)

  1. Incubare W-sol AX con 2AB (0,2 M) in presenza di 1 M NaBH 3 CN (sodiocianoboroidruro) (pH 5,5) per 2 ore a 65 ° C per convertire le estremità riducenti delle catene polisaccaride backbone ai loro derivati ​​fluorescenti.
    ATTENZIONE: La seguente operazione deve essere eseguita nella cappa come NaBH 3 CN rilascia gas cianuro tossico quando è in contatto con l'acqua.
    1. Pesare NaBH 3 CN (62,8 mg) e sciogliere in acqua (1 ml) in una provetta da microcentrifuga (1,5 ml) per preparare una soluzione 1 M NaBH 3 CN. Sciogliere 2AB reagente (27,2 mg) in soluzione 1 M NaBH 3 CN (1 ml) mediante riscaldamento a 65   ° C e regolare il pH della miscela di reazione (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) fino a pH 5,5 con acido acetico 10%.
    2. Aggiungere 200 pl di miscela di reazione (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) per W-soL AX (1 mg) in un tubo di vetro con un tappo e miscelare con un vortex. Incubare per 2 ore a 65   ° C in una cappa aspirante. Raffreddare la sospensione di RT e aggiungere 4 voll. di etanolo assoluto.
    3. Posizionare la sospensione in una cella frigorifera (4 ° C) O / N a precipitare polisaccaridi.
    4. Centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) per rimuovere il surnatante. Lavare il pellet a lungo con etanolo assoluto (4x), acetone (1x) e metanolo (1x), centrifugazione tra ogni lavaggio. secca sotto vuoto a 40 ° CO / N.
      Nota: il lavaggio esteso rimuove anche 2AB residua.

2. Generazione di Xylo-oligosaccaridi da 2 AB Labelled W-sol AX

  1. Sciogliere 2AB etichettato W-sol AX (1 mg) in 500 ml di tampone di acetato di sodio (100 mM, pH 5) in una provetta da microcentrifuga (1,5 ml). Aggiungere 4 unità di dell'endoxilanasi (GH 11, [M1]) e incubare a 37   ° C per 16 ore.
  2. Distruggere l'attività enzimatica riscaldando i mixt reazioneure per 10 min in un bagno di acqua bollente. Raffreddare la sospensione di RT e trasferimento a tubo di vetro con un tappo. Aggiungere 4 voll. di etanolo assoluto e posizionare la sospensione in un magazzino frigorifero (4 ° C) O / N a precipitare qualsiasi polisaccaridi non digeriti.
  3. Centrifuga (1.500 xg, 10 min, RT) per separare polisaccaridi non digeriti (pellet) e dell'endoxilanasi generato Xylo-oligosaccaridi (surnatante). Decantare il surnatante in una provetta pulita e metterlo in un bagno di acqua calda (40 ° C).
  4. Evaporare l'etanolo in corrente di azoto per un volume punto finale (~ 500 microlitri). Congelamento del supernatante a -80 ° C per 4 ore e asciugare il surnatante congelato in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.

3. Generazione di Xylo-oligosaccaridi da Koh-sol AX e 2AB etichettatura

  1. Trattare KOH-sol AX con dell'endoxilanasi (GH 11, [M1]) per generare Xylo-oligosaccaridi come descritto in precedenza (sezioni 2.1-2.4).
  2. Trattare endoxylanase generato Xylo-oligosaccaridi da Koh-sol AX con miscela di reazione 2AB (0,2 M 2AB, 1 M NaBH 3 CN) come descritto sopra (sezioni 1.1.1-1.1.2).
  3. Decantare il surnatante in una provetta pulita e metterlo in un bagno di acqua calda (40 ° C). Evaporare l'etanolo in corrente di azoto per un volume punto finale (~ 500 microlitri). Congelamento del supernatante a -80 ° C per 4 ore e asciugare il surnatante congelato in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.

4. MALDI-TOF-MS

  1. Preparazione di MALDI-matrix Soluzione
    1. Aggiungere una piccola pallina di 2, acido 5-dihydroxbenzoic (DHB) al 50% acetonitrile (500 ml) contenente acido formico 0,1% in un tubo (soluzione MALDI-matrice). Mescolare con un vortice, se si dissolve rapidamente, aggiungere un altro piccolo scoop di DHB. Nota: la concentrazione ideale di soluzione MALDI-matrice è 10 mg / mL -1.
  2. Preparazione della piastra MALDI-bersaglio
    1. Depositare il aqueoci oligosaccaride campioni (nativo) (5-10 mcg) (W-sol e / o KOH-sol) su una piastra MALDI-bersaglio. Aggiungere 0,3 microlitri soluzione MALDI-matrice utilizzando una punta separato e miscelare pipettando su e giù. Lasciare il composto si asciughi a temperatura ambiente.
      Nota: i campioni correttamente essiccati dovrebbero consistere in cristalli lunghi aghiformi che puntano verso il centro dello spot. Se il deposito è appiccicoso e / o smeary il campione può essere sia troppo concentrata o sono costituiti da sali, tali depositi è improbabile che produrre un buon spettri e il campione devono essere purificati ulteriormente.
    2. Introdurre la piastra segnale nella fonte MS e operare in (+ ive) modalità ioni positivi. Regolare la tensione acceleratore a 19,0 kV alla fonte di ioni 1 e 16,3 kV alla fonte di ioni 2. Regolare la potenza del laser a più di 70%. Selezionare il punto di campionamento sulla piastra MALDI-target e fare clic su Start per iniziare colpi laser.
      Nota: Tutte le aree della destinazione non produrrà segnali. Un posto particolare sarà solo dare un segnale per un paio di colpi laser dovute a unesaurimento della miscela campione / matrice o le caratteristiche del cristallo.
      1. Spostare il laser a diverse aree del bersaglio durante l'acquisizione e media di circa 200 spettri casuale per ottenere una soddisfacente segnale-rumore.

5. ESI-MS-QTOF

  1. Analizzare oligosaccaridi dell'endoxilanasi generati (nativo) utilizzando nano-HPLC accoppiato con un Elettrospray (ESI) tempo quadrupolo di volo strumentale (QTOF) MS con separazione cromatografica on-line utilizzando un RP C-18 colonne (75 micron x 150 mm; 3,5 micron tallone dimensione).
    1. Trasferire il composto oligosaccaridi acquose dell'endoxilanasi generati in un flaconcino e mettere in auto campionatore HPLC. Programmare il gradiente di eluizione del 5-80% con le fasi mobili 0,1% (v / v) di acido formico in acqua e 0,1% (v / v) di acido formico in acetonitrile, rispettivamente oltre 60 min.
    2. Regolare la portata di 0,2 ml / min. Regolare il modo positivo di litio nel range di scansionedi 300-1,600 m / z ed una scansione tasso di 0,5 scansioni / secondo con le condizioni della sorgente ESI come segue: cortina di gas 10, GS1 4, temperatura sorgente 100 ° C, ione tensione spruzzo 2.300 V, e de-clustering di potenziale 50 V. Eseguire il programma LC cromatografica e oligosaccaridi eluire. Il cromatogramma ionico totale risultante (TIC) viene salvato automaticamente dal software.
    3. Aprire il TIC salvato e selezionare estratto cromatogramma. Digitare le masse attesi (ad esempio, 271, 403, 535, 667, 799 e 931 m / z) nella riga di comando. cromatogramma scansione cliccando Enter. Elaborare le scansioni di ioni selezionati dei dati cromatogramma ESI-MS QTOF utilizzando il software secondo le istruzioni 14 del produttore.

6. ESI-MS n

  1. Inserire da 1 a 2 ml di per-O-metilato oligosaccaride (metilato come descritto da Pettolino et al. 1) del campione nel 50% acetonitrile in una punta nanospray con una siringa. tagliarela punta nano-spruzzo con una taglierina di vetro per adattarsi nel supporto nano-spruzzo discreta attaccato alla SM.
  2. Impostare la massa secondo il range previsto di massa (200-1,500 m / z) e gas tenda 10, tensione ionspray a 1.900 V e polarità positiva.
  3. Premere il pulsante di acquisire per aprire la finestra corrispondente, inserire il nome del file di dati per ottenere una scansione ionica totale (ESI-MS 1). Quindi premere il tasto STOP.
  4. Cambiare il tipo di scansione da ioni prodotto di frammentare un picco di interesse. Indicare la massa di interesse (ad esempio, 885 m / z) di frammentare e regolare il range di massa (200-900 m / z). Premere il pulsante di acquisire e regolare l'energia di collisione (alto e / o verso il basso nella scheda composto) per ottenere tutta la frammentazione dello ione genitore (885 m / z) e acquisire una scansione frammento di ioni (ESI-MS 2).
  5. Indicare la massa di frammenti di ioni di interesse (ad esempio, 711 m / z) e regolare la gamma di massa (200-720 m / z). Premere il pulsante di acquisire unad regolare l'energia di collisione per ottenere tutta frammentazione di ione precursore (711 m / z) e acquisire una scansione frammento di ioni (ESI-MS 3).

7. H 1 spettroscopia NMR

  1. Sciogliere dell'endoxilanasi generato miscela di oligosaccaridi (KOH-sol, forma nativa) (~ 500 mg) in D 2 O (1,0 ml, 99,9%) in una provetta di plastica (15 ml). Congelare la sospensione a -80 ° C per 4 ore e asciugare la sospensione congelata in un liofilizzatore per recuperare xylo-oligosaccaridi.
  2. Ripetere 7.1 due volte per scambiare pienamente la H 2 O con D 2 O.
  3. Sciogliere oligosaccaridi essiccate in D 2 O (0,6 ml, 99,9%) e aggiungere 0,5 ml di acetone (5% in D 2 O) come standard interno. Trasferire i oligosaccaridi deuterati nella provetta del campione NMR.
  4. Tenere il NMR provetta contenente campione all'inizio e inserire il tubo campione in un filatore di plastica. Posizionare il filatore del calibro di profondità del campione. Push o tirare il tubo campione per regolare la profondità del campione per garantire che la linea centrale del piano campione e calibri di profondità inferiore sono uguali.
  5. Rimuovere il calibro di profondità e inserire il campione nel campionatore automatico collegato a uno spettrometro NMR 600 MHz dotato di crio-sonda.
  6. Login e software di controllo dello spettrometro aperto. Inserire il nome del file di esempio. Aprire un set di dati esistente e quindi utilizzare il comando "EDC" per salvarlo con un nuovo nome. Digitare il numero di posizione del campione nel campionatore automatico e premere "ENTER".
    Nota: Premendo il tasto "ENTER" si cadere il tubo campione delicatamente per il foro del magnete dove sarà posizionato nella parte superiore della sonda.
  7. Impostare la temperatura del campione desiderato digitando "edte" nella riga di comando. Attendere che la temperatura del campione per raggiungere il valore desiderato prima di procedere alla fase successiva. Inserire "lock" nella riga di comando e selezionare solvente appropriato (D 2 O). Attendere il & #34; bloccare il messaggio finito "apparire nella parte inferiore della finestra.
  8. Tipo "atmm" nella riga di comando e fare clic su "Ottimizza" nella parte superiore della barra dei menu atmm. Scegliere Start per la sintonizzazione e la corrispondenza della sonda per il canale selezionato (1 H in questo caso).
  9. Tipo "topshim" nella riga di comando per il processo di spessoramento in cui sono fatti piccoli aggiustamenti al campo magnetico fino a campo magnetico uniforme si ottiene tutto il sample.Acquire il segnale digitando "ZG" nella riga di comando e digitare.
  10. Analizzare spettri che utilizzano il software 15 secondo le istruzioni del produttore con 1 H chemical shift fa riferimento ad uno standard interno di acetone a 2.225 ppm.

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Representative Results

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La digestione dell'endoxilanasi di 2AB-etichettato W-sol AX genera una miscela di oligosaccaridi RE 2AB marcato e una serie di oligosaccaridi non-marcato (senza etichetta 2AB) derivate dalle regioni interne della catena xilano (Figura 1; da Ratnayake et al. 2). Una serie di approcci cromatografici viene quindi impiegato per frazionare il complesso miscela di isomeri. Infine, tecniche di MS sono utilizzate per identificare le strutture isomeriche che vengono poi sequenziati da MS n tecniche. Qui vi presentiamo un rappresentante, piuttosto che globale, esempio dell'approccio.

I segnali nello spettro MALDI-TOF-MS di oligosaccaridi derivati ​​da 2AB marcato nativo W-sol AX (Figura 2A) includono altamente abbondante serie pseudo-molecolare ione m / z 701, 833, e 965 che rappresentano una serie di non marcato neutro internaoligosaccaridi regione con 5-7 residui pentosyl (P 5-7), rispettivamente. Una serie di segnali a m / z 745, 877, e 1009, designare che un oligosaccaride serie acida non marcato con P + 4-6 hexa 1 (acido hexuronic), è presente anche in questa frazione (Figura 2A). Ioni pseudo-molecolare a m / z 821 e 953 indicano la presenza del 2AB marcato originale oligosaccaridi RE P 5-6 + 2AB, rispettivamente.

L'analisi ESI-QTOF-MS per gli oligosaccaridi nativi con un frazionamento in linea cromatografica di oligosaccaridi da RP C-18 HPLC viene quindi eseguita. Figura 2B e 2C, mostra le scansioni di ioni selezionati, estratti da ioni totale ESI-QTOF-MS cromatogramma (TIC), di oligosaccaridi rilasciate da dell'endoxilanasi da W-sol Fr AX. I segnali comprendono una serie di ioni pseudo-molecolare assegnato come [M + NH 4] + a m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, e 1356 rappresentano una serie di regione interna oligosaccaridi neutri con 5-10 residui pentosyl (P 5-10), rispettivamente (Figura 2B). Diverse strutture isomeriche sono possibili per un oligosaccaride di una massa definita (vedere sotto ESI-MS n analisi). Quindi i picchi multipli per ciascuna delle scansioni ioni molecolari sono possibili come osservato nella Figura 2B. Ioni pseudo-molecolare assegnati come [M + H] + am / z 271, 403, 535, 667, 799 e 931 indicano la presenza di un 2AB etichettato RE serie oligosaccaride P 1-6 + 2AB rispettivamente (Figura 2C) . I segnali rilevati come [M + H] + ioni a m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, e 1273 indicano la presenza di un oligosaccaridi acidi con P + 3-8 hexa 1, rispettivamente (Figura 2C). Nelle monocotiledoni commelenid, la spina dorsale xilano può anche essere sostituito con acidi fenolici,principalmente acido ferulico (e anche p acido -coumaric), che ha lo stesso peso molecolare come l'acido glucuronico e può essere rilevata in W-sol AX di frumento pareti cellulari endosperma. Tuttavia, un'analisi più approfondita delle W- e KOH-sol AX mediante ESI-MS n (e compositiva analisi mediante GC-MS dei derivati ​​TMS seguente metanolisi, non mostrato qui) confermano gli oligosaccaridi acidi con P + 3-8 hexa 1 a endosperma di frumento AX.

I segnali assegnati come [M + H] + ioni di ESI-Q-TOF spettro completo scansione della regione fra 3,10-3,48 min (Figura 2D) comprende la serie di 2AB etichettato oligosaccaridi RE: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 e 1195 (P 1-8 + 2AB, rispettivamente). Una serie di ioni pseudo-molecolare nella ESI-Q-TOF spettro completo scansione della regione fra 3,59-4,05 min (Figura 2E) rappresentano regione interna oligosaccaridi acidi osservanod come sia [M + Na] + ioni: m / z 613, 745, 877, 1009, e 1141 (P 3-7 + hexa 1, rispettivamente) e [M + NH 4] + ioni: m / z 740, 872, 1004, 1136, e 1268 (P 4-8 + hexa 1, rispettivamente).

Per sequenziare singoli oligosaccaridi, abbiamo effettuato ESI-MS n sul ​​per-O-metilato oligosaccaridi piuttosto che sui oligosaccaridi autoctone ottenute da W-sol e KOH-sol AX poiché è impegnativo per assegnare inequivocabilmente strutture sequenziando oligosaccaridi nativi . Inoltre, si richiede anche maggiori quantità di materiale. La metilazione dei oligosaccaridi è stata effettuata come descritto da Pettolino et al. 1. L'ESI-MS n indagini eseguite sulle RE neutro alditols oligosaccaridi derivati ​​da KOH-sol AX, e 2AB etichettati neutro oligosaccaride RE derivato da AX W-sol sono descritti below come esempio per assistere nell'interpretazione degli spettri e strutture dedotte. Lo stesso approccio può essere applicato a tutti gli oligosaccaridi generati dall'idrolisi enzimatica. Gli ioni frammento della ESI-MS n spettri sono stati identificati come ioni Y e B secondo Domon e Costello. 16 gruppo ossidrile Un-metilata (s) generato durante frammentazione in fase gassosa di per-O-metilato oligosaccaridi in MS n fornisce un 14Da differenza di massa "scar" che può essere utilizzato per identificare il modello di ramificazione e le sequenze glicosil. 12-13 Ogni cicatrice generati dall'evento frammentazione è contrassegnato come una linea continua (figure 3 e 4). Come diverse strutture isomeriche sono possibili per una massa definita, quindi in queste strutture isomeriche, ioni Y e B sono etichettati in rosso e nero, rispettivamente.

L'ESI-MS 2, ESI-MS 3 e ESI-MS 4 SPECTra di per-O-metilato RE neutro alditolo oligo-glicosil generato dalla frammentazione del pseudo-molecolare ione m / z 885 (P 4 + Xyl olo) è mostrato in Figura 3. Il 2 Spettro ESI-MS comprende l'abbondante Y ioni a m / z 711, 551, e 391 generati dalla perdita di uno, due e tre residui pentosyl, rispettivamente, dal ione genitore. L'abbondante m / z 711 ioni può essere generato da una perdita di un non riducente residuo Xyl terminale o dalla perdita di una catena laterale terminale Ara residui. La diagnostica Y m / z 391 ioni nello spettro risultante può essere generato dalla perdita di tre non riducenti residui Xyl finali dal oligosaccaride RE che ha un Ara residuo catena laterale sul ol residui RE Xyl o oligosaccaride RE che ha un catena laterale Ara residuo sul 2 ° Xyl residuo dal residuo ol RE Xyl. Sebbene vi sia una possibilità formale che altre strutture, come ad esempioXyl 4 -Xyl olo, e (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol darebbe origine a questo frammento ion queste strutture sono esclusi dalla considerazione della specificità del endo-xilanasi utilizzato per scindere polisaccaride dovrebbero o degradare o meno unirà al legame glicosidico adiacente ad un punto di diramazione rispettivamente. Corrispondentemente, Y diagnostica m / z 551 ioni possono essere generati dalla perdita di due non riducenti residui Xyl finali dal oligosaccaride RE che ha l'Ara residuo catena laterale sia sul ol residui RE Xyl o oligosaccaride RE, che ha il lato catena di Ara residuo sul residuo Xyl penultima. Così, quattro possibili strutture isomeriche possono essere proposti (Figura 3: I, II, III e IV). L'abbondante Y ione m / z 377 (vedere Figura 3: Ia e IIa) e ioni B m / z 503 (vedere Figura 3: Ia, Ib, IVa e IVb) generato da un'ulteriore frammentazione di isomeri precursore m/ z 711 ioni sono anche osservati in questo spettro. La ESI-MS 3 spettro (Figura 3) registrati dalla frammentazione di isomerica precursore m / z 711 ioni comprendeva un'importante picco a m / z 537 (Y ione di P 2 + Xyl olo con due cicatrici, generato dal precursore ione Ia , Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb, IVa e IVb) e m / z 391 (Y ioni di P 1 + Xyl olo con una cicatrice, generato dal precursore di ioni IIb, IIIa, IIIb, IVa e IVb). Questi due picchi principali (m / z 537 e m / z 391) possono essere generati dalla perdita di uno e due non riducenti residui Xyl terminali, rispettivamente dal isomerica precursore m / z 711 ioni generati dalla frammentazione del pseudo -molecular ioni genitore m / z 885 (P + 4 Xyl ol) durante ESI-MS 2. Relativamente bassi picchi di abbondanza a m / z 377 (Y ioni di P 1 + Xyl olo con due cicatrici, generato dal precursoR ioni Ia e IIa) e 551 (Y ioni di P 2 + Xyl olo con una cicatrice, generato dal precursore di ioni Ib e IIb) sono stati osservati anche in questo spettro.

La ESI-MS 4 della frammentazione del isomerica precursore m / z 551 ioni comprendeva un'importante picco a m / z 377 (Y ione di P 1 + Xyl olo con due cicatrici) e m / z 391 (Y ionico P 1 + Xyl olo con una cicatrice) generato dalla ioni precursore di strutture I e II. Pertanto la prova collettiva suggerito che la sequenza RE glicosil consiste della catena laterale Ara attaccata al residuo ol RE Xyl (diagnostica frammentazione pathway m / z 885 → 711 → 551 → 391; la figura 3II), Ara catena laterale attaccata sia RE Xyl olo e la penultima (1 ° Xyl residuo da RE Xyl ol) Xyl residuo (diagnostica frammentazione percorso m / z 885 → 711 → 537 → 391; figura 3iii), Ara catena laterale attaccato alla penultima (1 ° Xyl da RE Xyl ol) Xyl residuo (diagnostica frammentazione percorso m / z 885 → 711 → 537 → 377; Figura 3I) e il catena laterale Ara attaccato il 2 Xyl residuo della olo RE Xyl (Figura 3iV).

La presenza di questi ioni conferma le strutture isomeriche proposti I, II, III e IV e RE struttura oligosaccaride neutro: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p.

Lo spettro ESI-MS 2 di 2AB per-O-metilato etichettato RE oligosaccaride generato dal Fragmsentazione del quasi-molecolare [M + Na] + ioni a m / z 871 (P + 4 2AB) è mostrato in Figura 4. Questo spettro contiene il più abbondante ione Y a m / z 697 (P + 3 2AB con uno scar), m / z 537 (P 2 + 2AB con una cicatrice) e m / z 377 (P 1 + 2AB con una cicatrice), generato dalla perdita di uno, due o tre residui pentosyl non riducenti, rispettivamente. Lo ione m / z 697 può essere generato da una perdita di un residuo terminale end Xyl non riducente o dalla perdita di un residuo terminale Ara mentre la m / z 537 ioni può essere generata solo dalla perdita di due residui Xyl terminali . Il percorso frammentazione diagnostica (m / z 871 → 697 → 537 → 377) ha suggerito che l'esistenza di non-ramificato oligosaccaride xilano backbone lineare (s) al RE corrispondente alla quasi-molecolare ione m / z 871 (P 4 + 2AB ). Tuttavia lineare non-ramificato xylosyl dorsale (P + 4 2AB) è susceptible al sito dell'endoxilanasi specifico per ulteriori digestione. Pertanto possono esistere due isomeri m / z 697 ioni. Pertanto sono proposte due possibili strutture isomeriche (Figura 4: I e II). In queste strutture isomeriche ioni Y e B sono etichettati in rosso e nero, rispettivamente. L'ESI-MS 3 spettro registrato dalla frammentazione di isomeri precursore m / z 697 ioni genera m / z 523 ionica (Y ioni di P 2 + 2AB con due cicatrici, Figura 4, strutture Ia, Ib, IIa e IIb), m / z 363 ion (Y ionico P + 1 2AB con due cicatrici; la figura 4, la struttura IIa) e Y ione m / z 377 (P 1 + 2AB con una cicatrice; la figura 4, strutture Ia e Ib). Lo ione frammento a m / z 377 può sorgere solo dalla struttura proposta io e lo ione frammento a m / z 363 può sorgere solo dalla struttura proposta II. La presenza simultanea di questi due ioni conferma le strutture proposte I e II. Pertanto la sequenza RE glicosil della catena xilano di frumento AX endosperma costituiti da un ramo Ara attaccato al residuo RE Xyl (frammentazione pathway m / z 871 → 697 → 523 → 363) e / o residuo Xyl penultima (frammentazione pathway m / z 871 → 697 → 523 → 377).

analisi NMR del AX

Analisi MS-base non forniscono informazioni su entrambi configurazione anomerica (α / β) o la configurazione D / L di zuccheri che devono essere ottenuti da altri approcci, tra enzimatica e fisica (ad esempio, NMR). Per heteroxylans con la caratteristica tetrasaccaridi RE ridotta (Xyl-Rha-Gala-Xyl olo), lo spettro NMR contiene segnali anomerico che conducono alla individuazione e la sequenza di questa RE oligosaccaride. Descriviamo l'uso di 600 MHz spettroscopia 1D 1 H-NMR come metodo unico passo per detERMELLINO la sequenza glicosil completa del grano endosperma AX RE oligosaccaride sul KOH-sol Fr, compresa la configurazione anomerica (α / β) e la configurazione D / L di zuccheri. Risonanze sono stati assegnati sulla base delle assegnazioni pubblicate di grano oligosaccaridi AX 17-18 (Figura 5, Tabella 1). Gli spettri 1 H-NMR del AX estratto da endosperma di frumento è dominato dai cambiamenti anomerico chimiche a 5.39, 5.27 e 5.22 ppm, che sono assegnati al protone di un residuo α-L-Ara f terminale collegato a O-3 posizioni (T-α-L-Ara f → 3 S) dei (1,4) -β-Xyl residui p backbone singolarmente ramificati ed entrambi O-3 e O-2 posizioni (T-α-L-Ara f → 3 S e T-α-L-Ara f → 2 D) di doppiamente ramificati (1,4) -β-Xyl residui p dorsale, rispettivamente (Figura 5 e Tabella 1).

f → 3 S + D) del segnale H1 di α-L-Ara f catena laterale fissata nella posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl singolarmente ramificato con annesso doppiamente ramificato β-D-Xyl p. Il segnale 5.29 è assegnato al (T-α-L-Ara f → 3 D + D) segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-3 della doppiamente ramificato β-D-Xyl p residuo con annesso doppiamente ramificato β-D-Xyl p. il segnale 5.24 è assegnato al (T-α-L-Ara f → 2 D + D) segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato al O-2 posizione del doppiamente ramificato β-D-Xyl p residuo con annesso doppiamente ramificato β-D-Xyl p.

Figura 1

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 1. Sintesi di approccio sperimentale Una sintesi della strategia impiegata in generazione, purificare e sequenziare il fine di ridurre (RE) e oligosaccaridi regione interni. di grano è mostrato arabinoxilani endosperma (AXS). Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Ratnayake et al. (2014) 2. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. MALDI-TOF MS (A) e ESI-MS QTOF (B - E) Analisi di oligosaccaridi native rilasciati da dell'endoxilanasi da 2AB etichettato W-sol AX come illustrato in Figura 1. MALDI-TOF MS spettro: (A) ( I segnali a ri identificato come [M + Na] + ioni di addotti); Scansioni di ioni selezionati della ESI-MS QTOF cromatogrammi: B = P 5-10 derivato dalla regione oligosaccaridi interni (I segnali sono identificati come [M + NH 4] + ioni di addotti); C = P 1-6 + 2AB derivati ​​da RE oligosaccaridi (I segnali sono identificati come [M + H] + ioni addotti) & P 3-8 G derivata da oligosaccaridi acidi (I segnali sono identificati come [M + Na] + ioni addotti); D = ESI-Q-TOF completa spettro di scansione: regione tra 3,10-3,48 min, e = ESI-Q-TOF spettro completo di scansione: regione tra 3,59-4,05 min (I segnali sono identificati come sia [M + Na] + e [M + NH 4] + ioni di addotti ); P = unità pentosyl (sia Ara o Xyl); G = uronosyl residuo (GlcA); RE = riducendo oligosaccaridi finali; 2AB = 2 aminobenzamide; EIC: estratto di ioni cromatogramma. annuncio / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. L'ESI-MS 2, ESI-MS 3 e ESI-MS 4 spettri di per-O-metilato RE neutro alditolo glicosil (P + 4 Xyl OL) - m / z 885. I segnali sono assegnati come il [M + Na] + addotti ioni di pseudo-molecolare. Come diverse strutture isomeriche per una massa definita sono possibili quindi in strutture isomeriche ioni Y e B sono etichettati in rosso e nero, rispettivamente. Ogni "scar" generati dall'evento frammentazione è contrassegnato come una linea continua. X = Xylosyl residui; A = Arabinosyl residuo. L'ESI-MS 3 spettri è stato riprodotto con il permesso di Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. L'ESI-MS 2 e ESI-MS 3 spettri di per-O-metilato 2AB etichettato oligosaccaride RE neutro (P + 4 2AB) - m / z 871. I segnali sono assegnati come il [M + Na] + pseudo addotti ioni -molecular. Come diverse strutture isomeriche per una massa definita sono possibili in strutture isomeriche, ioni Y e B sono etichettati in rosso e nero, rispettivamente. Ogni "scar" generati dall'evento frammentazione è contrassegnato come una linea continua. X = Xylosyl residui; A = Arabinosyl residuo. Questo dato è stato riprodotto con il permesso di Ratnayake et al. (2014) 2. Fare clic qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.

Figura 5
Figura 5. regione anomerico dello spettro 600 MHz 1D 1 H-NMR dei oligosaccaridi AX generate dal trattamento dell'endoxilanasi del KOH- Sol P. 1 H chemical shift riferimento ad uno standard interno di acetone a 2.225 ppm. T-α-L-Ara f → 3 S: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl singolarmente ramificato; T-α-L-Ara f → 2 D: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-2 della p residuo β-D-Xyl doppiamente ramificato; T-α-L-Ara f → 3 D: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl doppiamente ramificato; T-α-L-Ara f → 3 S + D: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl singolarmente ramificato con annessa doppiamente ramificato β-D- Xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-2 della p residuo β-D-Xyl doppiamente ramificato con annessa doppiamente ramificato β-D p -Xyl; T-α-L-Ara f → 3 D + D: segnale H1 di α-L-Ara catena laterale f attaccato alla posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl doppiamente ramificato con annessa doppiamente ramificato β-D p -Xyl; 2-α-L-Ara f → 3 S: segnale H1 di 2-α-L-Ara residuo catena laterale F allegata alla posizione O-3 della p residuo β-D-Xyl singolarmente ramificata; Clicca qui per vedereuna versione più grande di questa figura.

residui di zucchero H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-4 / C-4 H-5 eq / C-5 H-5 ax / C-5
T-α-L-Araf → 3 S 5,396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-Araf 5.415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-Araf → 2 D 5,223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-Araf → 2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-Araf → 3 D 5.272 / 108,9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-Araf → 3 D + D 5,298 / 4.18 3.96
2-α-L-Araf → 3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
alfa-Xylp (Riduzione) 5.185 / 91.9 3.55 3.72
beta-Xylp (Riduzione) 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
ß -4-Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4,448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
ß-3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S + β-3,4-Xylp 4,514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4.505
ß-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4.482 3.45 3.74
beta-2,3,4-Xylp 4.638
S + β-2,3,4-Xylp 4,627 3.59 3.87 3.88
D + β-2,3,4-Xylp 4.616
beta-2,3,4-Xylp + S 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
spostamenti chimici sono segnalati rispetto al acetone interna, δ 2.225.
S = Singolarmente ramificata β-Xylp
S + D = Singolarmente ramificata β-Xylp + Doppiamente ramificata β-Xylp
D = doppiamente ramificato β-Xylp
D + D = Doppiamente ramificata β-Xylp + Doppiamente ramificata β-Xylp

Tabella 1. segnali 1 H-NMR del Xylo-oligosaccaridi generati dal trattamento dell'endoxilanasi del grano endosperma KOH-sol P.

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Discussion

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La maggior parte dei polisaccaridi della parete cellulare Phase Matrix hanno dorsali apparentemente sostituito in modo casuale (sia con glycosyl e residui non glicosil) che sono molto variabili a seconda delle specie di piante, stadio di sviluppo e tipo di tessuto 3. Poiché polisaccaridi sono prodotti genici secondari loro sequenza non è modello derivato e pertanto non vi è un unico approccio analitico, come esiste per acidi nucleici e proteine, per la loro sequenza. La disponibilità di purificati enzimi idrolitici specifico linkage ha fornito un potente strumento per degradare polisaccaridi a oligosaccaridi che possono poi essere cromatograficamente frazionata, e quando usato in combinazione con tecniche chimiche e fisiche completamente sequenziato. La sfida è poi ri-assemblare queste miscele complesse in un polisaccaride originale sequence- che è ancora di essere con successo affrontato.

Qui si descrive un approccio (ordine la cui applicazione del can essere variata) che si basa sulla integrazione enzimatica stabilita, chimiche e tecniche fisiche per la caratterizzazione strutturale sia fine riducendo (RE) e la regione interna sequenza glicosil (s) di heteroxylans. Una tecnica complementare supplementare non descritto qui che si è rivelata molto utile per caratterizzare oligosaccaridi è PACE (analisi polisaccaride dall'assunzione di carboidrati in gel elettroforesi) sviluppato dal gruppo Dupree 19 e potrebbe facilmente essere integrato in questo protocollo, se l'attrezzatura è disponibile. Inoltre, variazioni sul cromatografia LC può anche essere utile, ad esempio tandem in linea interazione idrofilica cromatografia (HILIC) seguita da cromatografia RP offrendo la possibilità di separare sia etichettato / etichettato oligosaccaridi in un unico passaggio. Le tecniche si basano sulla codifica (con 2 aminobenzamide (2AB)) all'estremità riducente (RE) della catena heteroxylan prima enzimatica (dell'endoxilanasi) idrolisi. Due approcci diversi (vedi sintesi inFigura 1) sono adottati. Nel primo, intatti AX W-sol sono trattati con 2AB codificare il RE backbone residuo originale zucchero catena e poi trattati con un dell'endoxilanasi per generare una miscela di RE 2AB marcato e regione interna riducendo oligosaccaridi, rispettivamente. In un secondo approccio KOH-sol Fr viene idrolizzato con dell'endoxilanasi per generare prima una miscela di oligosaccaridi che vengono successivamente etichettati con 2AB. In quest'ultimo scenario l'RE originale del AX KOH-sol non sarebbe etichettato con 2AB poiché era stato ridotto al glicosil-alditolo durante l'estrazione alcali che conteneva il riducente, boroidruro di sodio (NaBH4). Pertanto, gli oligosaccaridi 2AB-etichettati generati digestione post-xilanasi, sarà origine da oligosaccaridi "interni" e l'oligosaccaride RE originale conterrà un alditolo RE senza un tag 2AB (vedi Figura 1). Questo approccio può essere applicato anche ad altre classi di polisaccaridi ucantare (dove disponibile) le opportune endo-idrolasi.

L'approccio MS-based è notevolmente migliorata dalla metilazione degli oligosaccaridi generati dopo il trattamento dell'endoxilanasi dal momento che il gruppo ossidrile non-metilato (s) generato durante la frammentazione in fase gassosa di per-O-metilato oligosaccaridi in MS n fornisce una differenza di massa 14Da "cicatrice "che può essere utilizzato per facilitare l'identificazione del modello di ramificazione e la sequenza glicosil. 5-6 l'identità dei residui pentosyl (e qualsiasi residuo di zucchero) non può essere fatto da soli dati MS ma deriva dall'avere una conoscenza del composizione della molecola; dove questo non è disponibile, le relative analisi di linkage monosaccaridi e devono essere eseguite prima di effettuare queste assegnazioni in MS n. Inoltre, i segnali corrispondenti alla alditolo RE acido oligosaccaride, generato da KOH-sol Fr (Xyl 3 -MeGlcA-xilitolo: m / z 761) e characteristic dicot xylan RE sequenza glicosil (Xyl 2 -RHA-Gala-xilitolo: m / z 761), se presente, non sono in grado di essere distinto come entrambi hanno la stessa massa molecolare in forma nativa, ma può essere distinto da loro frammentazione MS ( MS n) spettri che è meglio eseguita sui oligosaccaridi metilati. Infine, le tecniche MS-based sono in grado di fornire informazioni su entrambi configurazione anomerica (α / β) del legame glicosidico o la configurazione D / L del sugars- ciò deve essere determinata con metodi alternativi, tra enzimatica e fisica (ad esempio, NMR).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

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Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche
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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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