Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

Bu protokol, ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek karakterizasyonu için kullanılan spesifik teknikleri tarif etmektedir. De-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları, bir alkol-olmayan su (W-Sol FR) ile ekstre edilmiştir (AIR) 1 ve ardışık ve Ratnayake ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi, 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) ihtiva eden izole edildi ark. (2014) 2. İki farklı yaklaşım (Şekil 1'de özet bakınız) kabul edilir. İlk olarak, sağlam B-Sol AXS, orijinal RE omurga zinciri şeker artığı etiketlemek için 2AB ile muamele edilir ve daha sonra 2AB etiketli Re ve sırasıyla oligosakaritler indirgeyici iç bölgeye bir karışımını oluşturmak için endoksilanazın ile muamele edilmiştir. İkinci bir yaklaşımda, KOH-sol Cu önce, daha sonra 2AB ile etiketlenir oligosakaritlerin karışımı oluşturmak için endoksilanazın ile hidrolize edilir. hem enzimatik serbest ((BM) etiketlendi) oligosakkaritlerW ve KOH'nin-Sol Frs MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS ve ESI-MS, n bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi bulunmaktadır. Endoksilanaz KOH-sol AXS ayrıca anomerik konfigürasyonu hakkında bilgiler sağlar, nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilir dijeste edilmiştir. Bu teknikler, uygun endo-hidrolazlar kullanan polisakkaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heteroksilanlar otların birincil duvar ve anjiyospermlerinde 3-6 ikincil duvar baskın selülozik olmayan polisakaritlerdir polisakaritlerin ailesidir. Ksilen omurgalar türlerine ve glikosil (glukuronik asit (GIcA), arabinoz (Araf)) ve non-glikosil (O-asetil, ferulik asit) ile doku tipi, gelişme aşaması ve türler 7 bağlı artıklar ile ikame farklılık gösteren.

Buğdaydan Duvarlar (Triticum aestivum L.) endosperm esas arabinoksilanlar (AXS) (% 70) ve (1 → 3) oluşmaktadır (1 → 4) -β-D-Glukanlan (% 20) selüloz ve heteromannans küçük miktarları ile (2 her biri%) 8. ksilen omurgaya ağırlıklı (esas olarak O-2 konumu ve daha az bir ölçüde o-3 konumu) ikame edilmiş mono ve di-ikame edilmiş α-L-Ara ile (O-2 ve O-3 pozisyonları) değişik un ikame edilmiş olabilir ve F kalıntıları 9. indirgeyici uç (RE) hetero(örneğin, Ladin (Picea Abies)) (örneğin, Arabidopsis thaliana) dikotlardan ksilanlar 10 ve jimnospermler 11 karakteristik bir tetrasakarit glikosil sekansı içerir, -β-D-xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-xyl s. heteroksilan biyosentezini ve fonksiyonunu (biyolojik ve endüstriyel) anlamak için, tam türleri ve değiştirmelerin modellerini yanı sıra indirgeyici ucunda (RE) dizisini anlamak için ksilen omurgaya sırası önemlidir.

ucu (RE) ve heteroksi iç bölgesi glikosil sekans (lar) ı indirgenerek yapısal karakterizasyon için kullanılan özel teknik, bu yazıda açıklanmıştır. teknikler enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce heteroksilan zincirinin indirgeyici ucunda (RE) (2 aminobenzamid (2AB)) ile etiketleme florofor kullanır. Özellikle RE dizileme için bu yaklaşım, olduİlk York laboratuvar 10,12-13 tarafından bildirilen ama şimdi izolasyon kaynağında bağımsız tüm heteroksi eşit uyarlanabilir kurulan tekniklerin bir arada iç bölge sıralama içerecek şekilde genişletilmiştir ve mesafesindedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda (bulunan) uygun endo-hidrolazlar ile polisakaritlerin diğer sınıflara uygulanabilir.

Tarif edildiği gibi, bu çalışmada, de-kolalı buğday endosperminin hücre duvarları su (W-Sol FR) ile ekstre alkol çözülmeyen tortu (AIR) ve ardışık olarak izole edilmiş ve 1 M KOH% 1 NaBH4 (KOH-Sol FR) içeren edildi Ratnayake et al. (2014) 2. W- ve KOH'nin-Sol FRS hem serbest oligosakaritler HPLC ile ESI-QTOF-MS-bağlanmış MALDI-TOF-MS, bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilir, sonra metil ve hem doğal hem de metillenmiş oligosakaritlerin ayrıntılı yapısal analizi vardır bir RP C-18 kolonu kullanılarak çevrimiçi kromatografik ayırmave ESI-MS n. Endoksilanaz KOH-sol AXS, aynı zamanda nükleer manyetik rezonans (NMR) ile karakterize edilmiştir dijeste edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

2-aminobenzamid W-sol axs Azaltılması sonu 1. Etiketleme (RE) Şeker Kalıntı (2AB)

  1. Fluoresan türevleri polisakarit omurga zincirlerinin indirgeyici uçları dönüştürmek için 65 ° C 'de 2 saat süre ile, 1 M NaBH3CN (sodyum siyanoborohidrid) (pH 5.5) varlığında, 2AB (0.2 M) W-Sol AXS inkübe edin.
    DİKKAT: su ile temas halinde olduğunda, NaBH3CN zehirli siyanür gazı serbest aşağıdaki adımı davlumbaz yapılmalıdır.
    1. NaBH3CN (62.8 mg), tartılır ve 1 M NaBH3CN çözeltisi hazırlamak için, su içinde bir mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL) içinde (1 mi) çözülür. 65 ° C'de ısıtma ile 1 M NaBH3CN çözeltisi (1 mi) içinde 2AB ayıracı (27.2 mg) çözündürülür   ° C% 10 asetik asit ile pH 5.5'e Reaksiyon karışımı (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) pH'ının ayarlanması vb.
    2. W, böylece reaksiyon karışımının, 200 ul (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) ilavebir kapak ile bir cam tüp içinde l AXS (1 mg) ve bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak karıştırılır. 65 ° C'de 2 saat boyunca inkübe   Davlumbaz ° C. Oda sıcaklığına soğutun ve süspansiyon 4 cilt ekleyin. mutlak etanol.
    3. Bir soğuk depo polisakkaritleri çöktürmek için (4 ° C) O / N süspansiyon yerleştirin.
    4. Santrifüj (1,500 xg, 10 dakika, RT) süpernatant kaldırmak için. Her yıkama arasında santrifüj, mutlak etanol (4 x), aseton (1 x) ve metanol (1 x) ile iyice pelet yıkayın. 40 ° CO / N vakum kuru.
      Not: aşın yıkama ayrıca artık 2AB kaldırır.

2 AB etiketlenmiş gelen Xylo-oligosakkaritler 2. Nesil W-sol axs

  1. 2AB, bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir sodyum asetat tamponunun 500 ul (100 mM, pH 5) (1.5 mi) içinde B-Sol AXS (1 mg) etiketli içinde çözülür. endoksilanazın 4 adet (GH 11, [M1]) ekleyin ve 37 ° C'de inkübe   16 saat ° C.
  2. Reaksiyon Mixt ısıtılarak enzim etkinliğini yokbir kaynar su banyosu içinde 10 dakika için ure. Oda sıcaklığına soğutun ve süspansiyon bir kap ile bir cam tüpe aktarın. 4 vols ekleyin. mutlak etanol ve bir soğuk depoda süspansiyon yer (4 ° C) O / N herhangi bir sindirilmemiş polisakaritler çökeltildi.
  3. Santrifüj (1,500 x g, 10 dakika, RT) sindirilmeyen polisakaridleri (topak) ayrılması ve endoksilanaz (süpernatant) ksilo-oligosakkaritler sağladı. Temiz bir cam tüp içine süpernatant süzün ve sıcak su banyosu (40 ° C) içine yerleştirin.
  4. bir uç noktası hacminin (~ 500 | il) azot gazı akışı altında etanol buharlaştırın. 4 saat -80 ° C'de süpernatan dondurun ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde dondurulmuş süpernatant kurutun.

KOH-sol axs ve 2AB Etiketleme gelen Xylo-oligosakkaritler 3. Nesil

  1. (Bölümlerde 2.1-2.4) yukarıda tarif edildiği gibi ksilo-oligosakkaritler oluşturmak için endoksilanazın Koh-Sol AXS (GH, 11 [M1]) tedavisinde.
  2. endox tedaviylanase (bölümler 1.1.1-1.1.2) yukarıda tarif edildiği gibi 2AB, reaksiyon karışımı (0.2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) ile KOH-sol AXS gelen ksilo-oligosakkaritler sağladı.
  3. Temiz bir cam tüp içine süpernatant süzün ve sıcak su banyosu (40 ° C) içine yerleştirin. bir uç noktası hacminin (~ 500 | il) azot gazı akışı altında etanol buharlaştırın. 4 saat -80 ° C'de süpernatan dondurun ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde dondurulmuş süpernatant kurutun.

4. MALDI-TOF-MS

  1. MALDI-matris Çözüm hazırlanması
    1. bir tüp (MALDI-matris solüsyon) içinde% 0.1 formik asit ihtiva eden% 50 asetonitril (500 mi) 2, 5-dihydroxbenzoic asit (DHB) küçük bir kepçe ekleyin. hızla erir eğer, DHB'nin başka bir küçük kepçe ekleyin, bir vorteks ile karıştırın. Not: MALDI-matris solüsyon İdeal konsantrasyonu 10 mg olduğunu / ul -1.
  2. MALDI hedef Plate hazırlanması
    1. aqueo yatırınBize (yerli) örnekleri (5-10 ug) oligosakarit bir MALDI hedef plaka üzerine (W-sol ve / veya KOH-sol). Ayrı bir ucunu kullanarak 0.3 ul MALDI-matris çözümü ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Karışım, oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
      Not: Düzgün kurutulmuş numuneler nokta merkezine doğru işaret uzun iğne biçimli kristaller oluşmalıdır. yatırma yapışkan ve / veya yağlı olan numune, çok konsantre veya tuzlar oluşur olabilir, ya bu depozitlerin iyi spektrumlarını oluşturmak için olası değildir ve örnek daha arındırılmalıdır.
    2. MS kaynağına hedef plakası tanıtılması ve pozitif (+ İVE) iyon modunda çalışır. iyon kaynağı 1'de 19.0 kV ve iyon kaynağında 2'de 16.3 kV hızlandırıcı voltajını ayarlamak daha fazla% 70 lazer gücünü ayarlayın. MALDI hedef plaka üzerinde örnek nokta seçin ve lazer çekim başlarsınız tıklatın.
      Not: Hedef tüm alanlarda sinyalleri vermez. Belirli bir nokta, sadece ya nedeniyle birkaç lazer çekimleri için bir sinyal verecekÖrnek / matriks karışımı ya da kristal özelliklerinin azalması.
      1. tatmin edici sinyal-gürültü elde etmek için satın alma ve ortalama sırasında yaklaşık 200 rastgele spektrumları hedefin farklı alanlarına lazer taşıyın.

5. ESI-QTOF-MS

  1. Bir RP ile bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) çevrimiçi kromatografik ayırma ile bir uçuş (QTOF) MS aygıtının bir dört kat time ile birlikte nano HPLC kullanılarak endoksilanaz oluşturulan oligosakaritler (yerli) analiz C-18 kolonu (75 mm x 150 mm, 3.5 um kordon boyut).
    1. Bir şişenin içine endoksilanaz oluşturulan sulu oligosakkaritler karışımı aktarın ve HPLC oto örnekleyici içine yerleştirin. 60 dakika boyunca, sırasıyla asetonitril mobil fazlar,% 0.1 (h / h) su içinde formik asit ve% 0.1 (v / v) formik asit ile% 5-80 arasında sıyırma derecesi, program.
    2. 0.2 ul / dk akış hızı ayarlanır. tarama aralığı olumlu-iyon modu ayarlamaperde gazı 10, GS1 4, kaynak sıcaklığı 100 ° C, iyon püskürtme gerilimi 2300 V ve potansiyel 50 de-kümeleme: 300-1,600 m / z ve aşağıdaki gibi ikinci ESI kaynak koşulları kullanılarak / 0.5 tarama tarama-oranı V. Çalışma LC kromatografik programı ve elute oligosakaritler. Elde edilen toplam iyon kromatogram (TIC) yazılımı tarafından otomatik olarak kaydedilir.
    3. Kaydedilen TIC açın ve özü kromatogram seçin. Komut satırında beklenen kitleler (örneğin, 271, 403, 535, 667, 799 ve 931 m / z) yazın. Enter tıklayarak tarama kromatogram. Üreticinin talimatlarına 14'e göre yazılımını kullanarak ESI-QTOF MS kromatogram verileri seçilen iyon taramaları işleyin.

6. ESI-MS N

  1. Bir şırınga kullanılarak, bir nano-sprey ucu içine% 50 asetonitril örnek başına O-metillenmiş oligosakarit 1 ila 2 ul ekle (Pettolino ve ark., 1 tarafından tarif edildiği gibi metile). süsBir cam kesici kullanarak nano-sprey ucu MS bağlı ayrık nano-sprey tutucu içine sığacak şekilde.
  2. Pozitif beklenen kütle aralığı (200-1,500 m / z) ve perde gazı 10, ionspray voltaj 1,900 V ve kutuplarına göre kitle olarak ayarlayın.
  3. Ilgili penceresini açmak toplam iyon taraması (ESI-MS 1) elde etmek için veri dosyası adını girmek için acquire düğmesine basın. Ardından STOP tuşuna basın.
  4. ilgi zirveye parçalara ürün iyonunun tarama türünü değiştirin. Çevrede kütlesini girin (örneğin, 885 m / z) parçalara ve kütle aralığını (200-900 m / z) ayarlamak için. Acquire düğmesine basın ve ana iyon tüm parçalanma (885 m / z) elde etmek ve bir fragmanı iyon taraması (ESI-MS 2) elde etmek için (yukarı ve / veya aşağı bileşik sekmesinde) çarpışma enerjisini ayarlayın.
  5. Faiz (örneğin, 711 m / z) fragmanı iyonunun kütlesini girin ve kütle aralığını ayarlayın (200-720 m / z). acquire düğmesi, basınön-madde iyonu tüm parçalanma (711, m / z) elde etmek ve bir fragman iyonu tarama (ESI-MS 3) elde etmek için çarpışma enerjisi ayarlamak d.

7. H1 NMR Spektroskopisi

  1. D 2 O bir plastik deney tüpü içinde (1.0 mi, 99.9%) (15 mi) oligosakaritlerin endoksilanaz üretilen karışım (KOH-Sol, yerli biçimi) (~ 500 mg) içinde çözülür. 4 saat -80 ° C 'de süspansiyon bir dondurarak ve ksilo-oligosakkaritler kurtarmak için bir dondurarak kurutucu içinde donmuş süspansiyon kurutun.
  2. Tamamen D 2 O ile H 2 O alışverişi yapmak için iki kez 7.1 tekrarlayın
  3. D 2 O (0.6 mi,% 99.9) kurutuldu oligosakaritleri çözülür ve bir iç standart olarak aseton, 0.5 ul (D 2 O içinde% 5) ilave edilir. NMR deney tüpüne dötere oligosakkaritler aktarın.
  4. üst tarafından NMR tüpü içeren örnek tutun ve plastik spinner olarak örnek tüp yerleştirin. Numune derinlik ölçer olarak değer değişimi yerleştirin. İrinh örnek üst ve alt derinlik göstergeleri merkez çizgisi eşit olmasını sağlamak için örnek derinliğini ayarlamak için örnek tüp çekin veya.
  5. Derinlikölçer çıkarın ve kriyo-probu ile donatılmış bir 600 MHz NMR spektrometresi bağlı otomatik örnekleyici içine örnek yerleştirin.
  6. Giriş ve açık spektrometre kontrol yazılımı. Örnek dosya adını girin. Varolan veri setini açın ve sonra yeni bir adla kaydetmek için "EDC" komutunu kullanın. otomatik numune numunenin pozisyon numarasını yazın ve "Enter" tuşuna basın.
    Not: sonda üst kısmında konumlandırılmış olan mıknatıs deliğine yavaşça örnek tüp düşecek "ENTER" düğmesine basılması.
  7. Komut satırından "edte" yazarak istenen numune sıcaklığı ayarlayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce istenen değere ulaşmak için numune sıcaklığı bekleyin. Enter komut satırına "kilit" ve uygun çözücü seçin (D 2 O). & # Bekleyin34; Pencerenin alt kısmındaki görünmesini bitmiş "mesajı kilitleyin.
  8. Komut satırından "atmm" yazın ve atmm menü çubuğunun üstünde "optimize" tıklayın. Seçilen kanalın (bu durumda 1 H) için ayarlama ve prob uyumu için başlangıç ​​seçin.
  9. düzgün bir manyetik alan komut satırına "zg" yazıp girmek tarafından sample.Acquire etrafında sinyali elde edilinceye kadar küçük ayarlamalar manyetik alana yapılan edildiği layneri işlemi için komut satırına "topshim" yazın.
  10. 2.225 ppm aseton dahili bir standart referans 1H kimyasal kaymanın olduğu, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir yazılım 15 kullanarak spektrum analizi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

AXS 2AB etiketli RE oligosakaritlerin bir karışımını ve ksilan zinciri (Şekil 1, içi bölgelerden türetilen un etiketli (2AB etiketi olmadan) oligosakaritlerin bir dizi üreten B-Sol endoksilanaz sindirimi 2AB etiketli; adlı Ratnayake ve ark. 2). kromatografik yöntemlerin bir dizisi, daha sonra izomerler kompleks karışımının fraksiyonlanması kullanılır. Son olarak, MS teknikleri, daha sonra MS n tekniklerle dizilir izomerik yapılarının tespit edilmesi için kullanılmaktadır. Burada biz değil yaklaşımın kapsamlı, örneğin daha bir temsilci sunuyoruz.

2AB etiketli doğal B-Sol AXS (Şekil 2A) türetilen oligosakaritlerin MALDI-TOF-MS spektrumu sinyallerin işaretlenmemiş bir dizi temsil eden bir yüksek miktardaki sözde moleküler iyon m serisi / z 701, 833, ve 965 yer alır iç nötrsırasıyla 5-7 pentosyl artıkları (P 5-7) ile bölge oligosakkaritler. M / z 745, 877, ve 1009 sinyallerin bir dizi P 4-6 + heksa 1 (hexuronic asit), bir etiketlenmemiş asidik oligosakarit dizi olduğunu belirlemek, bu fraksiyon (Şekil 2A) 'de mevcuttur. M / z 821 ve 953 de Sözde moleküler iyonlar sırasıyla 2AB etiketli orijinal RE oligosakkaritler P 5-6 + 2AB varlığını gösterir.

RP Cı-18 HPLC ile oligosakaritlerin bir on-line kromatografik parçalanması ile natif oligosakaritlerin ESI-QTOF-MS analizi, daha sonra, Şekil 2B ve 2C. Gerçekleştirilen ESI-QTOF-MS toplam iyon elde seçilmiş iyon taramaları gösterir kromatogram (TIC), W-sol Fr axs dan endoksilanazın tarafından yayımlanan oligosakkaridlerin. Sinyalleri [M + NH4] + olarak m atanmış bir sözde moleküler iyon serisi,/, sırasıyla 5-10 pentosyl kalıntıları (p 5-10), (Şekil 2B) iç bölgesi, nötr oligosakaritlerin bir dizi temsil z 696, 828, 960, 1092, 1224, ve 1356. Çeşitli izomerik yapılar tanımlanmış bir kütle bir oligosakarit (ESI-MS n analiz aşağıya bakınız) için mümkündür. Şekil 2B'de görüldüğü gibi, moleküler iyon tarama her biri için nedenle birden fazla tepe mümkündür. [M + H] + m / z 271, 403, 535, 667, 799, ve 931 olarak atanan Sözde moleküler iyonlar 2AB varlığı RE oligosakarit serisi P + 2AB 1-6 etiketli göstermektedir sırasıyla (Şekil 2C) . Olarak algılanabilir sinyaller [M + H] + m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, ve 1273 iyonlar sırasıyla, p 3-8 + heksa 1 (Şekil 2C) ile bir asidik oligosakaritlerin varlığına işaret etmektedir. commelenid monokotlarda, ksilen omurgaya fenolik asitlerle sübstitüe edilebilir,esas olarak, ferulik asit (ve aynı zamanda p -coumaric asit) glukuronik asit ile aynı moleküler kütleye sahipse ve buğday endosperminin hücre duvarlarının B-Sol AXS tespit edilebilir. Ancak, ESI-MS n kullanılarak W ve KOH-sol axs daha analizi (ve bileşimini metanoliz aşağıdaki TMS türevlerinin GC-MS analizleri; burada gösterilmektedir) buğday endosperm P 3-8 + Hexa 1 ile asidik oligosakkaritler teyit axs.

[M + H] + 3,10-3,48 dakika arasındaki bölgenin ESI-Q-TOF tam tarama spektrum iyonları (Şekil 2D) 2AB seri RE oligosakaritler olarak etiketlenmiş olarak atanan sinyaller: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, ve 1195 (P 1-8 + 2AB, sırasıyla). 3,59-4,05 dakika arasındaki bölgenin ESI-Q-TOF tam tarama spektrumunda sözde moleküler iyonların bir dizi (Şekil 2E) iç bölgesi asidik oligosakaritler gözlemlemek temsilD aynı [M + Na] + iyonları: m / z 613, 745, 877, 1009, ve 1141 (P 3-7, sırasıyla + heksa 1) ve [M + NH4] + iyonları: m / z 740, 872, 1004, 1136, ve 1268 (P sırasıyla 4-8 + Hexa 1).

Bireysel oligosakaritleri diziliş analizini yapmak için, biz ESI-MS gerçekleştirilen N ilgili başına O-metillenmiş oligosakaritleri daha çok net bir biçimde yerel oligosakaritler sıralanmasıyla yapıları atamak için zor olduğu için B-Sol ve KOH'nin-Sol AXS elde edilen doğal oligosakaritlerde daha . Buna ek olarak, aynı zamanda, malzemenin daha yüksek miktarlarda gerektirir. Pettolino ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi oligosakaritlerin Metilasyon gerçekleştirilmiştir. 1. ESI-MS n KOH-sol axs türetilen RE nötr oligosakkarit alditoller üzerinde yapılan araştırmalar ve 2AB W-sol axs türetilen nötr RE oligosakkarit Belo açıklanan etiketliörnek spektrumları ve çıkarsanmış yapıların yorumlanmasına yardımcı olarak ağ. Aynı yaklaşım, enzimatik hidrolizi ile üretilen tüm oligosakaritlerin uygulanabilir. ESI-MS n spektrumlarında fragmanı iyonları başına O-metillenmiş oligosakaritleri MS 16 Un-metillenmiş hidroksil grup (lar) bir gaz fazı parçalanması sırasında oluşturulan. Domon & Costello göre olan ve Y ile B iyonları olarak tanımlanan N sağlar edildi dallanma desen ve glikosil dizileri. 12-13 parçalanması olayı tarafından oluşturulan her bir yara tanımlamak için kullanılabilir 14Da kütle farkı "yara" kesintisiz bir çizgi olarak işaretlendi (Şekiller 3 ve 4). Birkaç izomerik yapılar tanımlanmış bir kütle için mümkün olduğu gibi, daha sonra bu izomerik yapılarda, Y ve B iyonları sırasıyla kırmızı ve siyah etiketlenmiştir.

ESI-MS 2, ESI-MS 3 ve ESI-MS 4 spectsözde moleküler iyon m / z 885 parçalanma elde başına O-metillenmiş RE nötr oligo-glikosil alditol RA (P 4 xyl ol +), Şekil 3 'de gösterilmiştir. ESI-MS spektrumu 2 bol Y içerir m / z 711, 551 ve 391'de iyonlar üst iyondan, sırası ile, bir, iki ve üç pentosyl artıkları kaybı tarafından oluşturulan. Bol, m / z 711, iyon olmayan bir indirgeyici terminal ucu xyl tortusunun kayıp ya da bir terminal yan zincir Ara kalıntısının kaybından ya da üretilebilir. Sonuçta elde edilen spektrum teşhis Y, m / z 391 iyonu kaybı üretilebilir üç indirgeyici olmayan RE xyl ol kalıntısı veya bir sürekli artış oligosakarit bir yan zincir Ara kalıntısı olan RE oligosakarit bitiş xyl tortuları RE xYL ol artığından 2. xYL kalıntı yan zincir Ara kalıntısı. resmi ihtimali olsa da bu gibi diğer yapılar,Bu yol verecek 4 -Xyl ol, ve (Ara) XYL-XYL-XYL-XYL ol XYL Bu yapılar, iyon fragmanı, sırasıyla, bir dal noktası bitişik glikosidik bağlantı olarak bölen indirgeme ya da olmaz ya da polisakkarit parçalamak için kullanılan endo-ksilanaz özgüllüğü olarak dikkate dışındadır. Buna uygun olarak, tanı Y, m / z 551 iyonu kaybı üretilebilir iki indirgeyici olmayan RE xyl ol tortu ya da yan sürekli artış oligosakarit ya da yan zincir Ara kalıntısı olan RE oligosakarit bitiş xyl tortuları sondan bir önceki xYL kalıntı zincir Ara kalıntısı. Böylece, dört adet olası izomerik yapılar önerilebilir (Şekil 3: I, II, III ve IV). Bol miktarda Y'nin iyon m / z 377 (bakınız Şekil 3: la ve ila) ve B iyon m / z 503 (bakınız Şekil 3: la, Ib, IVA ve IVB) izomer ön-m fazla parçalanma elde/ z 711 iyonu bu spektrumu görülmektedir. P izomer ön-m parçalanması ile kaydedilen ESI-MS 3 tayfı (Şekil 3) / z 711 iyonları m bir ana tepe dahil / z 537 (E iyonu 2 + xyl iki yara izi ile ol; la iyon öncü tarafından oluşturulmuş , Ib, Ha, IIb, Ula, IIIb, IVa ve bir yara P 1 + xyl ol IVb) ve m / z 391 (E iyonu; IIb, illa, IIIb, IVa, iyon öncü tarafından oluşturulmuş ve IVb). Bu iki ana tepe (m / z 537, m / z 391) sözde parçalanması elde edilen izomer ön-m / z 711 iyondan, bir ve iki sırasıyla uç xyl tortuları, indirgeyici olmayan kaybı ile üretilebilir -Moleküler ana iyon m / ESI-MS 2 sırasında z 885 (P 4 + xYL ol). P m nispeten daha düşük bolluk zirveleri / z 377 (Y iyon 1 + XYL iki izleri ile ol; precurso üretilenR iyon la ve bir yara izi ile P2 + xyl ol IIa) ve 551 (E iyonu Ib ve llb iyon öncü tarafından oluşturulmuş) bu spektrumunda gözlenmemiştir.

Izomer ön-madde, m / z parçalanma ESI-MS 4 551 iyonları m bir ana tepe dahil / z 377 (P-Y iyonu, iki yara izi 1 + xyl ol) ve m / z 391 (P 1 Y iyonu öncül yapılarının iyon I ve II oluşturulan bir yara izi ile xYL ol) +. Hem bağlı Ara yan zinciri RE XYL, bu nedenle toplu kanıt RE glikosil dizisi (Şekil 3n teşhis parçalanma yolu m / z 885 → 711 → 551 → 391) RE XYL ol kalıntısına bağlı Ara yan zincirinden oluşur önerdi ol ve (RE xYL ol 1 st xYL kalıntı) sondan bir önceki xYL kalıntı (teşhis parçalanma yolu m / z 885 → 711 537 → 391 →; Şekil 3I) ve Şekil 3III), Ara yan zincir penultimate RE XYL ol dan (1. XYL) XYL Kalıntı (teşhis parçalanma yolu m / z 885 → 711 → 537 → 377 bağlı Ara yan zinciri RE xYL ol (Şekil 3IV) den 2. xYL kalıntı üzerinde takılı.

[Ara f - - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4): bu iyonların varlığı, önerilen izomerik yapıları I, II, III ve IV ve nötr RE oligosakarit yapısının teyit - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl s.

Başına O-metillenmiş 2AB ESI-MS 2 spektrum fragmanının üretilen RE oligosakkarit etiketlim yarı-molekül [M + Na] arasında entation + iyonu / z 871 (p + 4 2AB), Şekil 4'te Bu spektrum m / z 697 (p bir 3 + 2AB en bol bulunan Y iyonu içeren gösterilmiştir yara) dir, ya da bir, iki ya da üç indirgeyici olmayan pentosyl tortularının kaybı ile oluşturulan, m / z 537 (p bir yara sadece bir yara) ve m / z 377 (P1 + 2AB 2 + 2AB). M / z 697 iyonu, sadece iki terminal xyl kalıntısı kaybı ile üretilebilir, bir indirgeyici olmayan terminal ucu xyl tortusunun veya m / z 537 iyonu ise, bir terminal Ara kalıntısının kaybından zarara ile üretilebilir . Teşhis parçalanma yolu (m / z 871 697 → 377 → 537 →) RE doğrusal un-dallı ksilen omurgaya oligosakarit (ler) in varlığı, yarı-molekül iyonu m'ye karşılık gelen öne / z 871 (p + 4 2AB ). Ancak doğrusal un dallı ksilosil omurga (P 4 + 2AB) susce olduğunuDaha fazla sindirim için ptible siteye özgü endoksilanaz. Bu nedenle, iki izomerik m / z 697 iyonları mevcut olabilir. Bu duruma göre, iki muhtemel izomerik yapıları önerilmiştir (Şekil 4: I ve II). Bu izomerik yapıların içinde ve Y ile B iyonları sırasıyla kırmızı ve siyah etiketlenmiştir. , M izomerik ön-madde, m / z parçalanması kaydedilen ESI-MS 3 tayfı 697 iyonu (Şekil 4, yapı la, Ib, ila ve IIb, iki yara izi ile P2 + 2AB Y iyon) m / z 523 iyonu üretir / z 363 iyonu (iki yara izi ile P 1 + 2AB Y iyonu Şekil 4, yapının ila) m / z 377 de ve Y, iyonu (bir yara izi ile P 1 + 2AB, Şekil 4, yapılar la ve Ib). m / z 377 fragmandır iyonu, sadece I ve m / z 363 fragmandır iyonu yalnızca önerilen yapı II ortaya çıkabilir önerilen yapı ortaya çıkabilir. Bu iki iyon eşzamanlı varlığı önerilen yapılar teyit I ve II. Böylece buğday endosperminin AXS bir ksilan zincirinin RE glikosil sekansı RE xyl kalıntı (parçalanma yolu, m / z 871 → 697 → 523 → 363) ve / veya sondan bir önceki xyl Tortu (parçalanması yolu m / z bağlı bir Ara dalı oluşur 871 → 697 → 523 → 377).

AXS NMR analizi

MS tabanlı analizler anomerik yapılandırması (α / β) veya enzimatik ve fiziksel (örneğin, NMR) gibi diğer yaklaşımlar, elde edilmelidir şekerlerin D / L konfigürasyonuna ya da üzerinde bilgi vermemektedir. Karakteristik RE azaltılmış tetrasakarid (XYL-Rha-Gala-XYL ol) ile heteroksi için NMR spektrum bu RE oligosakkarit belirlenmesi ve sıralanması giden anomerik sinyalleri içerir. Bu det tek aşamalı bir yöntem olarak, 600 MHz 1D 1H-NMR spektroskopisinin kullanımını tarifanomerik yapılandırması (α / β) ve şekerlerin D / L konfigürasyonu dahil KOH-sol Fr üzerinde buğday endosperm AX RE oligosakkarit, komple glikozil dizisini as. Rezonanslar buğday AX oligosakkaritler 17-18 yayınlanmış ödevler (Şekil 5, Tablo 1) temelinde ayrıldı. Buğday endosperminin elde AX 1H-NMR spektrumu, O-3 konumuna bağlı bir terminal α-L-Ara rezidü proton atanır 5.39, 5.27 ve 5.22 ppm, en anomerik kimyasal kaymalar hakimdir tek tek dallanmış (1,4) -β-xyl s omurga artığına (T-α-L-Ara f → 3S) ve O-3 hem de O-2 pozisyon (t-α-L-Ara f → 3 D ve çift dallı (1,4) -β-xyl s omurga artığına (sırasıyla Şekil 5 ve Tablo 1) T-α-L-Ara f → 2 d).

f → 3 S + D) α-L-Ara f H1 sinyali yan zincir çift dallı β-D-xyl p bitişik olan tek tek dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-3 konumuna bağlanmıştır. 5.29 sinyal atanır (t-α-L-Ara f → 3 D + E) çift dallı β-D-xyl O-3 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 Gösterge çift ​​dallı β-D-xyl p bitişik p Tortu. 5.24 sinyal atanan α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali bağlanmış (t-α-L-Ara 2 D + D F) çift ​​dallı β-D-xyl p bitişik olan iki kat dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-2 konumu.

Şekil 1

<fo p class = "jove_content": Deneysel Yaklaşım tutmak-together.within-page = "1"> Şekil 1. Özet üreten, arındırıcı ve indirgeyici uç (RE) sıralanmasıyla kullanılan stratejinin bir özeti ve iç bölge oligosakkaritler. buğday endosperm Arabinoksilanlar (AXS) gösterilir. Bu rakam Ratnayake ark izni ile çoğaltılmıştır. (2014) 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. MALDI-TOF MS (A) ve ESI-QTOF MS (B - D) B-Sol AXS etiketli 2AB gelen endoksilanazın tarafından yayımlanan nativ oligosakaritlerin analizi Şekil 1'de MALDI-TOF MS spektrum de tarif edilmiştir: (A) ( sinyalleri [M + Na] + adükt iyonları) olarak tanımlanan re; RE türetilen C = P 1-6 + 2AB, iç bölge oligosakaritlerin türetilmiş B = P 5-10 (sinyaller [M + NH4] + adükt iyonlar olarak tanımlanır): ESI-MS QTOF kromatogramların seçilmiş iyon taramaları D = ESI-Q-TOF tam; oligosakaritler (sinyaller [M + Na] + adükt iyonlar olarak tanımlanır), asidik oligosakaritler elde & P 3-8 G (sinyalleri [M + H] + adükt iyonlar olarak tanımlanır) 3,59-4,05 dakika arasındaki bölge (sinyaller hem de [M + Na] + ve [M + NH4] + adükt iyonlar olarak tanımlanır: tarama spektrumu: 3,10-3,48 dakikada, E = ESI-Q-TOF spektrumu tam tarama arasındaki bölge ); P = pentosyl birimi (Ara ya xyl olarak); G = uronosyl Tortu (GIcA); son oligosakkaritler azaltılması = RE; 2AB = 2 aminobenzamid; ABM: ekstre iyon kromatogram. reklam / 53748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. ESI-MS 2, ESI-MS 3 ve ESI-MS başına O-metillenmiş RE nötr glıkosıl alditol 4 spektrumları (P 4 + XYL ol) - sinyalleri [M olarak atanan m / z 885. + Na] + sözde moleküler iyon ürünleri. tanımlanmış bir kütle için çeşitli izomerik yapılar izomerik yapılar daha sonra mümkün olduğu gibi ve Y ile B iyonları sırasıyla kırmızı ve siyah etiketlenmiştir. parçalanma olayı tarafından oluşturulan her "skar" kesintisiz bir çizgi olarak işaretlenir. X = ksilosil Tortu; A = arabinosil Tortu. ESI-MS 3 spektrumları Ratnayake ark izni ile çoğaltılmıştır. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Başına O-metillenmiş 2AB Şekil 4. ESI-MS 2 ve ESI-MS 3 spektrumları nötr RE oligosakkarit etiketli (P 4 + 2AB) - m / sinyalleri [M + Na] olarak atanan z 871. + yalancı -Moleküler iyon ürünleri. tanımlanmış bir kütle için çeşitli izomerik yapılar izomerik yapılarda mümkün olduğu için, ve Y ile B iyonları, sırasıyla kırmızı ve siyah etiketlenmiştir. parçalanma olayı tarafından oluşturulan her "skar" kesintisiz bir çizgi olarak işaretlenir. X = ksilosil Tortu; A = arabinosil Tortu. Bu rakam Ratnayake ark izni ile çoğaltılmıştır. (2014) 2. Daha büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.

Şekil 5,
KOH- Sol Fr. endoksilanaz işlenerek oluşturulan AX oligosakaritlerin 600 MHz 1D 1 H-NMR spektrumu Şekil 5. Anomerik bölgesi 2.225 ppm aseton dahili bir standart referans 1H kimyasal kayma. T-α-L-Ara f → 3S: tek tek dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-3 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali; T-α-L-Ara f → 2 D: iki kat dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-2 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali; T-α-L-Ara f → 3 D: iki kat dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-3 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali; T-α-L-Ara f → 3 S + D: olan tek tek dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-3 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyal çift dallı etrafındaki bitişik β-D- xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: olan iki kat dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-2 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali iki kat β-D dallanmış etrafındaki bitişik -Xyl p; T-α-L-Ara f → 3 D + E: olan iki kat dallanmış β-D-xyl s kalıntısının O-3 konumuna bağlı α-L-Ara F yan zincirinin H1 sinyali iki kat β-D dallanmış etrafındaki bitişik -Xyl p; 2-α-L-Ara f → 3 S: tek başına dallı β-D-XYL p kalıntısının O-3 pozisyonuna bağlı 2-α-L-Ara f yan zincir kalıntısının H1 sinyali, görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şeker artıkları H-1 / Cı-1 LH-2 / C-2 'H-3 / C-3 LH-4 / C-4 'H-5eq / C-5 H-5 balta / C-5
T-α-L-A'raf → 3S 5,396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-Araf 5,415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-A'raf → 2 D 5,223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-A'raf → 2 D + D 5,243 / 4.16 3.98
T-α-L-A'raf → 3 D 5,272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-A'raf → 3 D + D 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-A'raf → 3S 5,548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
(Azaltma)-Xylp a 5.185 / 91.9 3.55 3.72
(Azaltma)-Xylp BETA 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
p olan 4-Xylp + S 4,461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4,448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
olan B-3,4-Xylp 4,518 / 3.44 3.85
S + β-3,4-Xylp 4,514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D + β-3,4-Xylp 4,505
olan B-3,4-Xylp + S 4,492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4,482 3.45 3.74
olan B-2,3,4-Xylp 4,638
S + β-2,3,4-Xylp 4,627 3.59 3.87 3.88
D + β-2,3,4-Xylp 4,616
olan B-2,3,4-Xylp + S 4,593
β-2,3,4-Xylp + D 4,593
Kimyasal kaymalar iç aseton göre raporlanır, 2.225 ö.
S Tekli β-Xylp dallanmış =
S + D = Tekli dallanmış β-Xylp + Çifte β-Xylp dallanmış
D Çifte β-Xylp dallanmış =
D + D = Çifte dallanmış β-Xylp + Çifte β-Xylp dallanmış

Buğday endosperminin KOH-Sol Fr. endoksilanaz işlenerek oluşturulan ksilo-oligosakaritlerin Tablo 1. 1 'H-NMR sinyalleri

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Çoğu matris faz hücre duvarı polisakkaritler görünüşte rastgele oldukça değişkendir bitki türlerinin, gelişim aşamasında ve doku tipi 3 bağlı (glikosil ve non-glikosil kalıntılar hem de) omurgaları ikame var. polisakaritler sekonder gen ürünleri olduğu sekans edilen şablon değildir ve nükleik asitler ve proteinler için var gibi tek bir analitik yaklaşımın dizileme için, bu nedenle bulunmaktadır. Saflaştırılmış bağlantı özgü hidrolitik enzimlerin mevcudiyeti daha sonra kromatografik olarak parçalara ayrılmış olabilir oligosakaritler için polisakkaritlerin indirgeme için güçlü bir araç sağlanır ve kimyasal ve fiziksel teknikler ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman, tamamen sekanslandı sahiptir. meydan sonra başarılı bir şekilde ele hala orijinal polisakkarit dizilimini birine bu karmaşık karışımlar yeniden bir araya getirilmesidir.

Burada bir yaklaşım (uygulama ca kimin sırası tanımlamakn kurulmuş enzimatik, kimyasal ve indirgeyici ucunda (RE) ve heteroksi iç bölge glikozil dizisi (lar) hem de yapısal karakterizasyonu için fiziksel tekniklerin entegrasyonu dayandığı) olarak değiştirilebilir. Oligosakkaritler karakterize için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır burada tarif edilmeyen bir ek tamamlayıcı teknik Dupree 19 grubu tarafından geliştirilen PACE (karbonhidrat jel elektroforezi ile Polisakkarit analizi) ve ekipman varsa kolayca bu protokol entegre edilebilir. Ayrıca, LC kromatografi varyasyonlar da bu / tek bir aşamada oligosakaritler etiketli ayrılması hem de etiketlenmemiş olasılığı sunan RP kromatografisi takip tandem Tekerlekli hidrofilik interaksiyon kromatografisi (HILIC) de yararlı olabilir. teknikler enzimatik (endoksilanaz) hidrolizden önce heteroksilan zincirinin indirgeyici ucunda (RE) (2 aminobenzamid (2AB)) ile etiketleme kullanır. İki farklı yaklaşım (içinde özetini görmekŞekil 1) kabul edilir. İlk olarak, sağlam B-Sol AXS, orijinal RE omurga zinciri şeker artığı etiketlemek için 2AB ile muamele edilir ve daha sonra 2AB etiketli Re ve sırasıyla oligosakaritler indirgeyici iç bölgeye bir karışımını oluşturmak için endoksilanazın ile muamele edilmiştir. İkinci bir yaklaşımda KOH-sol Cu önce, daha sonra 2AB ile etiketlenir oligosakaritlerin karışımı oluşturmak için endoksilanazın ile hidrolize edilir. Bu indirgeyici, sodyum borhidrür (NaBH4) içeren alkali ekstraksiyon sırasında glikosil-alditol düşürülmüştür beri bu ikinci senaryoda KOH-sol AX orijinal RE 2AB ile etiketlenmiş olmaz. Bu nedenle, 2AB etiketli oligosakkaritler bir 2AB etiketi olmadan RE alditol içerecektir "iç" oligosakkaritler ve özgün RE oligosakkarit kaynaklı olacaktır, post-ksilanaz sindirim üretilen (Şekil 1). Bu yaklaşım, polisakkarid U diğer sınıfları da uygulanabilir(Varsa) uygun endo-hidrolazlar şarkı.

N, MS'de başına O-metillenmiş oligosakaritlerin gaz fazı parçalanması esnasında üretilen un-metillenmiş hidroksil grup (lar), bir 14Da kütle farkı "yara sağladığı MS temelli yaklaşım anlamlı endoksilanaz tedaviden sonra üretilen oligosakaritlerin metilasyonu ile arttırılır "tek başına MS verileri arasında yapılamaz. dallanma deseni tanımlanması ve glikosil sırayla yardımcı olmak için 5-6 pentosyl artıkları (ve herhangi bir şeker artığı) kimliği kullanılır ama bir bilgiye sahip gelir edilebilir molekülün bileşimi; Bu mevcut olmadığı durumlarda ardından ilgili monosakkarit ve bağlantı analizleri, MS n bu atamaları yapmadan önce yapılmalıdır. Ayrıca KOH-sol Cu oluşturulan RE asidik oligosakarit alditol, karşılık gelen sinyalleri (xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) ve CHaracteristic dikot ksilen RE glikosil dizisi (xyl 2 -Rha-gala-Ksilitol: m / z 761), mevcut olduğu takdirde, doğal formunda aynı moleküler kütlesi hem de ayırt edilmesi mümkün değil ama bunların MS parçalanması ayırt edilebilir ( en iyi metillenmiş oligosakaritlerin gerçekleştirilir MS n) spektrumları. Son olarak, MS-tabanlı teknikler (α / β) glikosidik bağlantı veya sugars- D / L yapılandırma bu da dahil olmak üzere alternatif yöntemlerle tespit edilmelidir anomerik yapılandırması ya hakkında bilgi vermek mümkün değildir (örn enzimatik ve fiziksel, NMR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
  2. Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
  3. Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
  4. York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
  5. Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
  6. Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
  7. Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
  8. Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82, (13), 372-377 (1980).
  9. Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
  10. Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
  11. Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
  12. Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
  13. Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22, (2012), 439-451 (2012).
  14. Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
  15. Topspin User Manual. Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
  16. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
  17. Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
  18. Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
  19. Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter