Behandling SCA1 Mus med vannløselige forbindelser til ikke-spesifikt Boost mitokondrienes funksjon
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitokondriell dysfunksjon spiller en betydelig rolle i aldringsprosessen og i nevrodegenerative sykdommer, inkludert flere arvelige spinocerebellar ataksi og andre bevegelsesforstyrrelser preget av progressiv degenerasjon av lillehjernen. Målet med denne protokollen er å vurdere mitokondriell dysfunksjon spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) og vurdere effekten av farmakologiske målretting av metabolsk åndedrett via vannoppløselig forbindelse ravsyre å bremse sykdomsutviklingen. Denne fremgangsmåten er anvendelig for andre cerebellare sykdommer og kan tilpasses til en rekke vannoppløselige terapier.
Ex vivo-analyse av mitokondriell respirasjon blir brukt til å detektere og kvantifisere sykdomsrelaterte forandringer i mitokondriefunksjonen. Med genetisk bevis (upublisert data) og proteomikk bevis på mitokondriell dysfunksjon i SCA1 musemodell, vurderer vi effekten av behandling med vannløselige metabolske booster succinic syre ved oppløsning av denne forbindelsen direkte inn i hjemmeburet drikkevann. Evnen av medikamentet til å passere blod-hjernebarrieren kan utledes ved hjelp av høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Effektiviteten av disse forbindelser kan deretter bli testet ved hjelp av flere adferds paradigmer inkludert den akselererende rotarod, balanse bjelke test og fotavtrykk analyse. Cytoarchitectural integritet av lillehjernen kan vurderes ved hjelp immunfluorescens analyser som gjenkjenner Purkinje cellekjerner og Purkinje celle dendritter og soma. Disse metodene er robuste teknikker for bestemmelse av mitokondriell dysfunksjon og effekten av behandling med vannløselige forbindelser i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom.
Introduction
Mitokondrier er de viktigste produsentene av adenosintrifosfat (ATP), en viktig koenzym for cellulær energi, med de fleste av mitokondriell ATP produseres gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) ved hjelp av elektrontransportkjeden. Hjernen, gitt den høye metabolske krav og sin avhengighet av oksidativ fosforylering for å drive nevrale aktiviteten, er svært utsatt for mitokondriell dysfunksjon. Som et resultat er mitokondriell dysfunksjon utløses under aldringsprosessen 1 og er implisert i patogenesen av flere neurodegenerative sykdommer 2, 3, 4. Derfor følger det at mitokondriene er attraktive terapeutiske mål for neurodegeneration.
I denne protokollen, har vi innført bruk av spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) som modell nevrodegenerativ sykdom for studiet av mitokondrienel dysfunksjon og utvikling av mitokondrie-målrettet terapi. SCA1 er forårsaket av en polyglutamine (polyQ) gjenta ekspansjon mutasjon i ataxin-1-genproduktet som utløser progressiv degenerasjon av Purkinje neuroner i lillehjernen og nerveceller i andre områder av hjernen. Den transgene mus linje som brukes her (betegnet som den SCA1 mus), som uttrykker et polyQ-mutant ataxin-en transgenet under kontroll av en Purkinje-cellespesifikk promotor, gjør det mulig for målrettet analyse av Purkinje-cellekomponent av SCA1 5. SCA1 mus gjennomgå gradvis Purkinje celle degenerasjon og utvikle ataxic gangart 6.
Mitokondriell kompleks dysfunksjon og mitokondrie-målrettet behandling effekt kan evalueres med et batteri av molekylære og atferdsmessige analyser. Mitokondriell kompleks dysfunksjon er målt ex vivo ved respirasjon analyser som gjenkjenner endrede oksygenforbruk innenfor lillehjernen vev inærvær av elektrontransportkjeden substrater og inhibitorer 7. Respirasjon assay har tidligere vært brukt med permeabilisert vev, mitokondrielle isolater, og hele vev 7, 8, 9. De tillater for direkte vurdering av mitokondriefunksjon i motsetning morfologiske datainnsamlingsmetoder som transmisjonselektronmikroskopi eller immunfluorescens farging. Bruken av hele vevet i stedet for isolerte mitokondrier hindrer forspent utvalg av sunne mitokondrier som kan oppstå under isoleringsprosessen 7. Når tilpasset til protokollen som er vist, er det åndedrett analyse en verdifull metode for påvisning av mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdomstilstander.
Ikke-spesifikke aktivatorer av metabolisme kan brukes til å utlede mitokondriell dysfunksjon hos transgene mus modeller av neurodegenerative disease og bistand i utviklingen av nye behandlingsformer. Quercetin, koenzym Q10 og kreatin har alle vist seg å lindre nevrodegenerativ sykdom patologi hos pasienter og i dyremodeller av nevrodegenerativ sykdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Her presenterer vi en ny metabolsk aktivator, ravsyre, for å stimulere stoffskiftet og øke mitokondrienes funksjon i nevrodegenerativ sykdom. For å sikre at aktivatoren er krysset blod-hjerne barrieren, ble HPLC anvendt for å detektere levering til nervevev hos behandlede mus 17.
For å evaluere den terapeutiske effekten av metabolsk målrettet vannløselige forbindelser som ravsyre, kan et batteri av atferds paradigmer og immunpatologiske studier brukes. due til motor koordinering underskudd som finnes i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom, fotavtrykk rullebanen analysen, bjelke analyse og akselererende roterende stang analysen brukes til å oppdage redning av atferds patologi 6, 18, 19. Disse tiltakene er supplert med immunpatologisk vurdering av lillehjernen cytoarchitecture ved å vurdere molekylær tykkelse (definert som Purkinje celle dendrittiske arbor lengde) og Purkinje celle soma tellinger innenfor et definert lobule av lillehjernen vev 6, 20, 21. Her presenterer vi flere nevropatologiske og atferds metoder for påvisning og behandling av mitokondriell dysfunksjon med metabolsk målrettet vannløselige forbindelser.
Vi bruker ex vivo analyse av mitokondriell respirasjon å analysere mitokondriell dysfunksjon i SCA1 transgenic mus. Videre viser vi at sykdomssymptomene og patologi er forbedret ved den vannoppløselige mitokondriell booster ravsyre, ytterligere impliserte mitokondriell dysfunksjon SCA1 sykdomsprogresjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hvis disse metodene brukes som beskrevet, er de i stand til å detektere og å lindre oksidativ fosforylering-mediert mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdom muse-modeller. De kombinerte biokjemiske og atferdsmessige analyser er mangfoldige fremgangsmåter for å bestemme omfanget av mitokondriell bidrag til cerebellar nevrodegenerativ sykdom patologi. Ved å behandle mus med ravsyre å stimulere stoffskiftet og øke mitokondriefunksjon, er vi i stand til å vise en redning av lillehjernen atfe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
