Summary

Behandling SCA1 Mus med vannløselige forbindelser til ikke-spesifikt Boost mitokondrienes funksjon

Published: January 22, 2017
doi:

Summary

We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.

Abstract

Mitokondriell dysfunksjon spiller en betydelig rolle i aldringsprosessen og i nevrodegenerative sykdommer, inkludert flere arvelige spinocerebellar ataksi og andre bevegelsesforstyrrelser preget av progressiv degenerasjon av lillehjernen. Målet med denne protokollen er å vurdere mitokondriell dysfunksjon spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) og vurdere effekten av farmakologiske målretting av metabolsk åndedrett via vannoppløselig forbindelse ravsyre å bremse sykdomsutviklingen. Denne fremgangsmåten er anvendelig for andre cerebellare sykdommer og kan tilpasses til en rekke vannoppløselige terapier.

Ex vivo-analyse av mitokondriell respirasjon blir brukt til å detektere og kvantifisere sykdomsrelaterte forandringer i mitokondriefunksjonen. Med genetisk bevis (upublisert data) og proteomikk bevis på mitokondriell dysfunksjon i SCA1 musemodell, vurderer vi effekten av behandling med vannløselige metabolske booster succinic syre ved oppløsning av denne forbindelsen direkte inn i hjemmeburet drikkevann. Evnen av medikamentet til å passere blod-hjernebarrieren kan utledes ved hjelp av høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Effektiviteten av disse forbindelser kan deretter bli testet ved hjelp av flere adferds paradigmer inkludert den akselererende rotarod, balanse bjelke test og fotavtrykk analyse. Cytoarchitectural integritet av lillehjernen kan vurderes ved hjelp immunfluorescens analyser som gjenkjenner Purkinje cellekjerner og Purkinje celle dendritter og soma. Disse metodene er robuste teknikker for bestemmelse av mitokondriell dysfunksjon og effekten av behandling med vannløselige forbindelser i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom.

Introduction

Mitokondrier er de viktigste produsentene av adenosintrifosfat (ATP), en viktig koenzym for cellulær energi, med de fleste av mitokondriell ATP produseres gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) ved hjelp av elektrontransportkjeden. Hjernen, gitt den høye metabolske krav og sin avhengighet av oksidativ fosforylering for å drive nevrale aktiviteten, er svært utsatt for mitokondriell dysfunksjon. Som et resultat er mitokondriell dysfunksjon utløses under aldringsprosessen 1 og er implisert i patogenesen av flere neurodegenerative sykdommer 2, 3, 4. Derfor følger det at mitokondriene er attraktive terapeutiske mål for neurodegeneration.

I denne protokollen, har vi innført bruk av spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) som modell nevrodegenerativ sykdom for studiet av mitokondrienel dysfunksjon og utvikling av mitokondrie-målrettet terapi. SCA1 er forårsaket av en polyglutamine (polyQ) gjenta ekspansjon mutasjon i ataxin-1-genproduktet som utløser progressiv degenerasjon av Purkinje neuroner i lillehjernen og nerveceller i andre områder av hjernen. Den transgene mus linje som brukes her (betegnet som den SCA1 mus), som uttrykker et polyQ-mutant ataxin-en transgenet under kontroll av en Purkinje-cellespesifikk promotor, gjør det mulig for målrettet analyse av Purkinje-cellekomponent av SCA1 5. SCA1 mus gjennomgå gradvis Purkinje celle degenerasjon og utvikle ataxic gangart 6.

Mitokondriell kompleks dysfunksjon og mitokondrie-målrettet behandling effekt kan evalueres med et batteri av molekylære og atferdsmessige analyser. Mitokondriell kompleks dysfunksjon er målt ex vivo ved respirasjon analyser som gjenkjenner endrede oksygenforbruk innenfor lillehjernen vev inærvær av elektrontransportkjeden substrater og inhibitorer 7. Respirasjon assay har tidligere vært brukt med permeabilisert vev, mitokondrielle isolater, og hele vev 7, 8, 9. De tillater for direkte vurdering av mitokondriefunksjon i motsetning morfologiske datainnsamlingsmetoder som transmisjonselektronmikroskopi eller immunfluorescens farging. Bruken av hele vevet i stedet for isolerte mitokondrier hindrer forspent utvalg av sunne mitokondrier som kan oppstå under isoleringsprosessen 7. Når tilpasset til protokollen som er vist, er det åndedrett analyse en verdifull metode for påvisning av mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdomstilstander.

Ikke-spesifikke aktivatorer av metabolisme kan brukes til å utlede mitokondriell dysfunksjon hos transgene mus modeller av neurodegenerative disease og bistand i utviklingen av nye behandlingsformer. Quercetin, koenzym Q10 og kreatin har alle vist seg å lindre nevrodegenerativ sykdom patologi hos pasienter og i dyremodeller av nevrodegenerativ sykdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Her presenterer vi en ny metabolsk aktivator, ravsyre, for å stimulere stoffskiftet og øke mitokondrienes funksjon i nevrodegenerativ sykdom. For å sikre at aktivatoren er krysset blod-hjerne barrieren, ble HPLC anvendt for å detektere levering til nervevev hos behandlede mus 17.

For å evaluere den terapeutiske effekten av metabolsk målrettet vannløselige forbindelser som ravsyre, kan et batteri av atferds paradigmer og immunpatologiske studier brukes. due til motor koordinering underskudd som finnes i lillehjernen nevrodegenerativ sykdom, fotavtrykk rullebanen analysen, bjelke analyse og akselererende roterende stang analysen brukes til å oppdage redning av atferds patologi 6, 18, 19. Disse tiltakene er supplert med immunpatologisk vurdering av lillehjernen cytoarchitecture ved å vurdere molekylær tykkelse (definert som Purkinje celle dendrittiske arbor lengde) og Purkinje celle soma tellinger innenfor et definert lobule av lillehjernen vev 6, 20, 21. Her presenterer vi flere nevropatologiske og atferds metoder for påvisning og behandling av mitokondriell dysfunksjon med metabolsk målrettet vannløselige forbindelser.

Vi bruker ex vivo analyse av mitokondriell respirasjon å analysere mitokondriell dysfunksjon i SCA1 transgenic mus. Videre viser vi at sykdomssymptomene og patologi er forbedret ved den vannoppløselige mitokondriell booster ravsyre, ytterligere impliserte mitokondriell dysfunksjon SCA1 sykdomsprogresjon.

Protocol

Denne protokollen følger IACUC retningslinjer ved Skidmore College for å arbeide med mus. 1. Behandling med vannløselige forbindelser Oppløse ravsyre til en konsentrasjon på 0,75 mg / ml i buret drikkevann. Legg merke til at en hvilken som helst vannoppløselig forbindelse av interesse ved den ønskede konsentrasjon kan være substituert på dette stadiet. Rør løsningen for å sørge for at forbindelsen er helt oppløst. Etter mus nå ønsket alder for behandling, erstatte hjemmeburet…

Representative Results

Gjennom farmakologiske målretting av lillehjernen mitokondrier med ravsyre er vi i stand til å hindre mitokondriell dysfunksjon i en musemodell av lillehjernen nevrodegenerativ sykdom SCA1. Den kanoniske elektrondonor av succinatdehydrogenase, ravsyre, ble oppløst i hjemmeburet drikkevann av SCA1 mus for en måned, med atferdsvurdering begynnelsen under den andre uken av behandlingen og nevropatologiske vurdering etter behandling (figur 1A). Ravsyre b…

Discussion

Hvis disse metodene brukes som beskrevet, er de i stand til å detektere og å lindre oksidativ fosforylering-mediert mitokondriell dysfunksjon i lillehjernen neurodegenerative sykdom muse-modeller. De kombinerte biokjemiske og atferdsmessige analyser er mangfoldige fremgangsmåter for å bestemme omfanget av mitokondriell bidrag til cerebellar nevrodegenerativ sykdom patologi. Ved å behandle mus med ravsyre å stimulere stoffskiftet og øke mitokondriefunksjon, er vi i stand til å vise en redning av lillehjernen atfe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.

Materials

Adenosine diphosphate Sigma Aldrich A2754 ADP
Ascorbate Sigma Aldrich A7631
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153 BSA
4',6-Diamidino-2-phenylindole Sigma Aldrich D9542 DAPI
Digitonin Sigma Aldrich D141
Dithiothreitol Sigma Aldrich D0632 DTT
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Glutamate Sigma Aldrich 1446600
Malate Sigma Aldrich 6994
Mannitol Sigma Aldrich M4125
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Potassium-lactobionate Bio-Sugars 69313-67-3
Rotenone Sigma Aldrich R8875
Saponin Sigma Aldrich 47036
Succinic Acid Sigma Aldrich S3674
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma Aldrich T7394 TMPD
Triton X-100 Sigma Aldrich T9284
Urea Sigma Aldrich U0631
Vectashield mounting medium Vector Labs H-1000
Antibodies
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody Life Technologies A-11015
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody Life Technologies A-11012
Calbindin antibody (goat) Santa Cruz C-20
Animals
Control transgenic mice Harry Orr, Ph.D. A02 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
SCA1 mice Harry Orr, Ph.D. B05 Burright, et al. 1997, PMID: 9217978
Wildtype mice The Jackson Laboratory 001800
Equipment
ESM-100L microtome ERMA Sledge microtome
Fluoview FV1200 Confocal Microscope Olympus
Glycerol-gelatin slides FD Neuro Technologies PO101
Hamilton syringe Sigma Aldrich VCAT 80465
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit Hansatech Instruments
P.T.F.E. paper Cole-Parmer UX-08277-15
Rotallion Rotarod PPP&G contact corresponding author for information
Ultimate 3000 HPLC Dionex
Software
ImageJ National Institute of Health http://imagej.nih.gov/ij/
Cell counter plugin (for ImageJ) National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) PPP&G contact corresponding author for information
Phidget21.dll (required for rotarod software) DLL-Files.com https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

References

  1. Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
  2. Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
  3. Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
  4. Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
  5. Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
  6. Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  8. Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
  9. Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
  10. Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
  11. Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
  12. Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
  13. Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
  14. Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
  15. Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
  16. Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
  17. Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
  18. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
  19. Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
  20. Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
  21. Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
  22. Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
  23. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  24. Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ferro, A., Carbone, E., Marzouk, E., Siegel, A., Nguyen, D., Polley, K., Hartman, J., Frederick, K., Ives, S., Lagalwar, S. Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function. J. Vis. Exp. (119), e53758, doi:10.3791/53758 (2017).

View Video