We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Митохондриальная дисфункция играет важную роль в процессе старения и при нейродегенеративных заболеваниях, включая несколько наследственных спиноцеребеллярные атаксии и других двигательных расстройств, отмеченных прогрессирующей дегенерацией мозжечка. Целью данного протокола является оценка митохондриальную дисфункцию в спиноцеребеллярная типа атаксии 1 (SCA1) и оценки эффективности фармакологической нацеливания метаболического дыхания через растворимое в воде соединение янтарной кислоты, чтобы замедлить прогрессирование заболевания. Этот подход применим и к другим мозжечковых заболеваний и может быть адаптирован к множеству водорастворимых терапии.
Пример естественных условиях анализа митохондриального дыхания используется для выявления и количественной оценки , связанных с болезнью изменений в митохондриальной функции. С помощью генетических данных (неопубликованные данные), а также протеомики доказательства митохондриальной дисфункции в модели СЦА1 мыши, мы оцениваем эффективность лечения с водорастворимым метаболической бустера Succinic кислоты путем растворения этого соединения непосредственно в питьевую воду домой клетке. Способность препарата проходить через гематоэнцефалический барьер может быть выведена с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Эффективность этих соединений могут быть протестированы с использованием нескольких поведенческих парадигм включая ускоряющего rotarod, испытания луча баланса и анализа следа. Cytoarchitectural целостность мозжечка можно оценить с помощью иммунофлуоресцентных анализов, которые обнаруживают клеточные ядра Пуркинье и дендритов клеток Пуркинье и сомы. Эти методы являются надежными методы для определения дисфункцию митохондрий и эффективности лечения водорастворимых соединений в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний.
Митохондрии являются ключевыми производителями аденозинтрифосфата (АТФ), которая является основным коферментом для клеточной энергии, с большинством митохондриальной АТФ производится путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS) с использованием электронно-транспортной цепи. Мозг, учитывая его высокие метаболические потребности и зависимость от окислительного фосфорилирования для питания нейронной активности, весьма восприимчивы к митохондриальной дисфункции. В результате, митохондриальной дисфункцией срабатывает во время процесса старения 1 и участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний , 2, 3, 4. Таким образом, отсюда следует, что митохондрии являются привлекательными терапевтическими мишенями для нейродегенерации.
В этом протоколе, мы приняли использование спиноцеребеллярная атаксия типа 1 (СЦА1) в качестве модели нейродегенеративных заболеваний для изучения митохондрийл дисфункции и развитие митохондриальных-целенаправленной терапии. СЦА1 вызывается мутацией полиглутаминового (polyQ) расширения повтора в гене продукта атаксина-1 , который вызывает прогрессирующей дегенерацией нейронов Пуркинье в мозжечке и нейроны других областей головного мозга. Трансгенная линия мыши используется здесь (обозначается как СЦА1 мыши), выражающее polyQ-мутант атаксина-1 трансген под контролем специфического Пуркинье-клеточного промотора, позволяет целевого анализа компонента Пуркинье-клеток СЦА1 5. SCA1 мышей подвергаются постепенной дегенерации клеток Пуркинье и развивать атаксическая походку 6.
Митохондриальная дисфункция и комплексная митохондриальным целевой эффективность лечения может быть оценена с батареей молекулярных и поведенческих анализов. Митохондриальная дисфункция комплекс измеряется с помощью экс естественных условиях дыхания анализов , которые обнаруживают измененную потребление кислорода в мозжечковой тканиналичие электронно – транспортной цепи субстратов и ингибиторов 7. Дыхательные анализы ранее использовались с проницаемыми ткани, митохондриальных локализует и цельной ткани 7, 8, 9. Они позволяют прямой оценки митохондриальной функции в отличие от морфологических методов сбора данных, таких как просвечивающей электронной микроскопии или иммунофлуоресцентного окрашивания. Использование всей ткани , а не изолированных митохондриях предотвращает предвзятое выбор здоровых митохондрий , которые могут возникнуть в процессе изоляции 7. Когда приспособлено к протоколу, как показано, анализ дыхания является ценным методом для выявления митохондриальной дисфункции в мозжечке нейродегенеративных болезненных состояний.
Неспецифические активаторы обмена веществ могут быть использованы для вывода дисфункцию митохондрий в моделях трансгенных мышах нейродегенеративных diseasе и помощь в разработке новых методов лечения. Кверцетин, коэнзим Q10 и креатин все было показано , для улучшения нейродегенеративного патологии болезни у больных и у животных моделях нейродегенеративных заболеваний 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Здесь мы представляем новый метаболический активатор, янтарную кислоту, чтобы стимулировать обмен веществ и повысить митохондриальную функцию в нейродегенеративных заболеваний. Для того, чтобы гарантировать , что активатор пересекает гематоэнцефалический барьер, ВЭЖХ использовали для обнаружения доставки в нервной ткани у мышей , обработанных 17.
Для того, чтобы оценить терапевтические эффекты метаболически целевых водорастворимых соединений, таких как янтарная кислота, можно использовать батарею поведенческих парадигм и иммунопатологические исследований. Duе к дефициту координации движений , обнаруженных в мозжечковой нейродегенеративных заболеваний, анализ ВПП след, анализа луча и ускоряющего вращающегося анализа стержня используются для обнаружения спасение поведенческой патологии 6, 18, 19. Эти меры дополняются иммунопатологической оценки мозжечковой цитоархитектуры путем оценки толщины молекулярного слоя (определяется как Пуркинье клеток дендритных длины оправки) и Пуркинье подсчета клеток Сома в пределах определенного дольки мозжечка ткани 6, 20, 21. Здесь мы представляем несколько нейропатологических и поведенческие методы для выявления и лечения митохондриальной дисфункции с метаболически целевых растворимых в воде соединений.
Мы используем ех естественных условиях анализа митохондриального дыхания для анализа митохондриальной дисфункции в СЦА1 Transgenic мыши. Более того, мы показали, что симптомы болезни и патологии улучшаются водорастворимого митохондриальной бустер янтарной кислоты, далее вовлекая митохондриальную дисфункцию в прогрессии заболевания СЦА1.
Если эти методы используются, как описано, они способны обнаруживать и облегчения окислительного фосфорилирования опосредованную дисфункцию митохондрий в мозжечке нейродегенеративных моделях мышей заболевание. Объединенные биохимические и поведенческие тесты являются многообраз…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
Antibodies | |||
11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
Animals | |||
Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
Equipment | |||
ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
Software | |||
ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |