Introduction
التوصيل العصبي فعال في الجهاز العصبي المركزي الثدييات (CNS) يتطلب تكون الميالين من المحاور التي كتبها قليلة التغصن. خلال التنمية، تنشأ قليلة التغصن من بين مجموعة من خلايا دبقية قليلة التغصن السلف (يجد OPCs) التي يعتقد أن الهجرة من مناطق البطين من الدماغ الأمامي تطوير والأنبوب العصبي 1. بعد تفرق يجد OPCs الهجرة إلى ناضجة، قليلة التغصن myelinating التي تسهل كفاءة نشر الدافع ليس فقط، ولكن أيضا توفير محاور مع الدعم الغذائي 2. يحافظ على الجهاز العصبي المركزي الكبار أعداد وفيرة من يجد OPCs المنتشرة في جميع أنحاء المادة الرمادية والمادة البيضاء التي تضم حوالي 5-8٪ من جميع الخلايا 3. بعد إهانة المزيل، يجد OPCs تهاجر إلى موقع الإصابة، تتكاثر، والتفريق ليحل محل الأغماد المايلين المفقودة أو التالفة على المحاور المكشوفة. ومع ذلك، في بعض البيئات مرض / إصابة، تم العثور على هذه العملية أن تكون غير فعالة أو يمكن أن تفشل تماما 4. في حينويعتقد إزالة الميالين المزمن إضافة إلى عبء المرض، oligodendrogenesis كفاءة وعودة الميالين قد تخفف من أعراض 5. فقد كان لذلك من مصلحة لدراسة يجد OPCs في المختبر لتحديد تأثير العوامل التجريبية على oligodendrogenesis.
أحرز التبصر في مراحل مختلفة من التمايز دبقية قليلة التغصن ممكن عن طريق تحديد مرحلة علامات معينة من الخلايا. وتعرف الخلايا الاولية في وقت مبكر تجديد الذات من قبل التعبير عنها الصفيحات المستمدة عامل النمو مستقبلات ألفا (PDGFRα)، العصبية / الدبقية مستضد 2 (NG2) وA2B5 6-8. كما تبادر يجد OPCs برنامج التمايز وتنسحب من دورة الخلية، فإنها downregulate التعبير عن هذه العلامات والبدء في التعبير عن البروتينات الإرشادية للpremyelinating قليلة التغصن بما في ذلك دائرى-النوكليوتيدات 3'-فسفودايستراز (CNPase) وO4. وأخيرا، والتمايز بهم إلى oligodendroc أكثر نضجايتميز ytes عن طريق التعبير عن البروتينات المرتبطة المايلين، بما في ذلك بروتين سكري المرتبطة المايلين (MAG)، بروتين شحم بروتيني (حزب العمال التقدمي)، والبروتين الأساسي المايلين (ب ب). MBP هو داخل الخلايا الطرفية بروتين الغشاء وعنصرا رئيسيا من غمد المايلين. الفئران التي تفتقر MBP تطوير النمط الظاهري حاد في الجهاز العصبي المركزي والتي تكون الميالين وانخفضت بشكل ملحوظ مما يؤدي إلى هزات، والتشنجات والموت المبكر 9،10. وقد أدى هذا الدور الهام للMBP في الميالين إلى استخدامه كعلامة للتمييز دبقية قليلة التغصن على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 11.
الكمي لMBP يمكن تحقيقه باستخدام عدة أساليب مختلفة. RT-PCR وتحليل لطخة غربية تسمح لتقدير مستويات MBP تحت نظم العلاج المختلفة. مناعية هو نهج نوعي المشترك الذي يمكن أيضا أن تكون الكمية عندما تستخدم نهج المجهري القائم على الكاميرا. على الرغم من أن هذه الأنظمة هي موثوق بها والأساسية لدراسة التمايز دبقية قليلة التغصن، ولكل من عيوبها الخاصة التي تحد من استخدامها في فحص المخدرات. أولا، كمية من يجد OPCs الأولية أن هناك حاجة لRT-PCR وتحليل لطخة غربية يقلل من عدد من المتغيرات التي يمكن دراستها في وقت واحد. في حين أن الشرط خلية للمناعية أقل من ذلك بكثير، يجب أن تخصص وقت كبير لكل تجربة إذا الكمي هو الهدف. يجب أن يتم القبض على العديد من الصور وبعد ذلك كميا لتسهيل التحليل التجريبي. تصبح هذه المحاذير العقبات الهامة التي يجب مراعاتها للدراسات التي تتطلب تقييم إنتاجية عالية. نحن هنا تصف طريقة التي تستخدم الجوانب الأساسية من كل من مناعية والمنهجيات لطخة غربية لتقدير المايلين، في حين أن الحد بشكل كبير كل من عدد الخلايا المطلوبة والوقت لاستكمال التحليل الكمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وجونز هوبكنز من مدرسة الطب.
1. إعداد لوحات الفحص، حلول الأوراق المالية، ومكتب أمين المظالم قاعدة وسائل الإعلام
ملاحظة: استمدت قاعدة الفئران OPC (ساتو) وسائل الاعلام وصفها هنا من الدراسات التي نشرت سابقا 12،13. قد تكون التركيبات وسائل الإعلام البديلة أيضا متوافقة مع هذا الإجراء.
- و resuspend بولي-L-ليسين (PLL) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل في الماء منزوع الأيونات معقمة. ماصة 400 ميكرولتر من PLL مخففة في كل بئر من القاع 24 الأنسجة جيدا طبق ثقافة الصف الأسود الجدران، واضحة.
- أطباق زراعة الأنسجة معطف لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية الثلاجة.
- نضح PLL من الأطباق المغلفة السابقة لا يقل عن 20 دقيقة للطلاء. السماح للPLL المتبقية لتجف من البئر عن طريق وضع 24 لوحات جيدة مع الغطاء مواربا جزئيا في زراعة الأنسجةالغطاء. تحقق من أن آبار جافة تماما قبل الطلاء يجد OPCs معزولة. والخلايا لا تلتزم البلاستيك الذي يحتوي السائل PLL الحاضر.
- إعداد N -Acetyl-L-السيستين (بريدا) حل سهم (1،000x): ذوب 100 ملغم N -Acetyl-L-السيستين (NAC) في 20 مل من المتوسط تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM). قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
- إعداد محلول المخزون هيدروكورتيزون (1،000x): إضافة 1 مل من الايثانول إلى هيدروكورتيزون 1 ملغ و دوامة حل. إضافة 19 مل من DMEM، مزيج الحل، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية. وقد تبين أن إضافة الهيدروكورتيزون الى وسائل الاعلام قاعدة لتعزيز بقاء الخلايا الدبقية 14.
- إعداد د البيوتين حل سهم (5،000x): يذاب 2.5 ملغ من د-البيوتين في 50 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2/1 × 5 قطرات ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم للمساعدة في حل. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
- إعداد محلول المخزون الأنسولين (100X): يذاب 25 ملغ الأنسولين في 50 مل من الماء درجة زراعة الأنسجة. إضافة 250 ميكرولتر سو 1 N حمض الهيدروكلوريك وتخلط حتى حل واضح. تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
- إعداد محلول المخزون ساتو (100X):
- إعداد محلول المخزون البروجسترون (25 ميكروغرام / ميكرولتر): يذاب 2.5 ملغ البروجسترون في 100 ميكرولتر من الايثانول.
- إعداد الصوديوم محلول المخزون سيلينات (400 نانوغرام / ميكرولتر): ذوب 4 ملغ سيلينات الصوديوم في 100 ميكرولتر من 0.1 N هيدروكسيد الصوديوم. إضافة 10 مل من DMEM ومزيج.
- 100 مل من DMEM، إضافة 1 غرام من البشر APO-ترانسفيرين، 1 غرام من ألبومين المصل البقري، و 160 ملغ من بوتريسين وتخلط إلى حل كامل. إضافة 25 ميكرولتر من محلول المخزون البروجسترون، 1000 ميكرولتر من محلول المخزون سيلينات الصوديوم، وخلط. قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
- إعداد OPC قاعدة وسائل الإعلام: لكل 100 مل من DMEM (مع 4.5 جم / لتر مد الجلوكوز، L-الجلوتامين، و 110 ملغم / لتر الصوديوم البيروفات)، إضافة 100 ميكرولتر حلف شمال الأطلسي، 100 الهيدروكورتيزون ميكرولتر، 20 ميكرولتر د-بيوتين، 1 مل الأنسولين، 1 مل الأسهم ساتو، و 100 ميكرولتر من العناصر النزرة B،2 مل B-27 ملحق (50X)، و 1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (100X). تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد PDGF-AA حل سهم (1،000x): ذوب 250 ميكروغرام في 12.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ زلال المصل البقري (BSA) لجعل 20 ميكروغرام حل / مل. قسامة ومخزن في -80 درجة مئوية.
- إعداد وسائل الاعلام انتشار OPC: وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع 20 نانوغرام / مل PDGF-AA.
- إعداد وسائل الإعلام التمايز OPC: وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع 45 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين.
- إعداد العمود العازلة: 500 مل من برنامج تلفزيوني، إضافة 2.5 غرام من BSA و 2 مل من 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. دماغ الفئران تشريح
ملاحظة: يتم استخدام الجراء P5-P7 الفئران في هذا البروتوكول. كل القشرة الفئران الجرو ينتج حوالي 1،5-2،0 × 10 خلايا إيجابية 6 A2B5.
- تعقيم جميع المعدات تشريح باستخدام 2506؛ C حبة ساخنة معقم.
- إضافة 15-20 مل من برنامج تلفزيوني (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) إلى 50 مل أنابيب مخروطية. واحد 50 مل أنبوب مخروطي يكفي لمدة 3-4 القشور الفئران الجرو. وضع أنابيب مخروطية 50 مل على الجليد. استخدام أنابيب مخروطية 50 مل لعقد أنسجة القشرة مكعبات أثناء تشريح.
- إضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى 10 سم طبق بتري. وسيتم استخدام هذا الطبق لتشريح تحت المجهر الضوئي.
- التضحية الفئران الوليدة عن طريق قطع الرأس مع مقص جراحي كبير. رذاذ الرأس مع الايثانول 70٪.
- استخراج الدماغ كله
- قطع باستخدام مقص صغير في الجلد أسفل خط الوسط وخلف الأذنين واللوحات الجلد قشر الظهر. قطع الجمجمة أسفل خط الوسط ابتداء من جذع الدماغ وتنتهي في العينين. يجب الحرص على عدم قطع عميق جدا من أجل الحفاظ على بنية القشرة الكامنة.
- جعل اثنين من التخفيضات الجانبية أقل شأنا من المخيخ عن طريق إدراج مقص جراحي صغيرة في الثقبة العظمى. جعل خفض إضافي بين العينين، والنملerior إلى بصيلات الشم.
- قشر بعناية كل نصف الجمجمة الخلفي. إزالة الدماغ كله وضعها في طبق بتري 10 سم مملوءة PBS الباردة.
- تحت المجهر ضوء تشريح، وإزالة بصيلات الشم والمخيخ مع الملقط الجراحية الدقيقة.
- الوجه الدماغ بحيث السطح البطني هو مرئية تحت المجهر الضوئي.
- باستخدام ملقط غرامة على التوالي أداء تشريح حادة عن طريق وضع ملقط نصائح المغلقة بين القشرة وتحت المهاد إلى عمق حوالي 2/3 من الدماغ. مرة واحدة ملقط هي في مكان يسمح نهايات لفتح. تكرار لنصف الكرة الأرضية الأخرى.
- ندف القشرة من منطقة ما تحت المهاد ومنطقة الدماغ المتوسط.
- إزالة ما تحت المهاد، المهاد، والدماغ المتوسط من خلال عقد الدماغ المتوسط في السطح الخلفي وتقشير نحو نهاية الأمامي من الدماغ. قطع الاتصالات الأمامية.
- إزالة الحصين من قبل تدوي إلى الخارج ثم قطع ارتباطهالقشرة باستخدام غرامة ملقط تشريح عازمة.
- إزالة المتبقية المخطط عن طريق التخلص من ذلك من القشرة الكامنة في حركة قطري الخارج باستخدام غرامة ملقط تشريح عازمة.
- مسح أي الأوعية الدموية والسحايا من السطح البطني من القشرة.
- الوجه الدماغ بحيث السطح الظهري مرئيا. يجب السحايا والأوعية الدموية يكون واضحا. السحايا قشر من القشرة الكامنة باستخدام ملقط تشريح غرامة. بدء تقشير من حاسة الشم الموقع لمبة المرفق.
- أكمل الخطوات 2،4-2،14 لما مجموعه 3-4 الفئران الوليدة.
- ضع 3-4 تشريح القشور الفئران الجرو في طبق بتري جاف وختم بشفرة حلاقة معقمة حتى تتحقق 1 مم قطع × 1 مم. جمع الأنسجة بشطفها الطبق مع برنامج تلفزيوني من واحد 50 مل أنبوب مخروطي (الخطوة 2) ثم ضع مرة أخرى على الجليد.
3. الأنزيمية والميكانيكية تفارق الأنسجة
ملاحظة: للحصول على هذه الخطوة، فمن المستحسن مجموعة التفكك العصبي القائم على غراء. باستخدام نيالاورال كيت التفكك (P)، ووصف خطوات خاصة التي هي الأمثل لعزل OPC.
- إعداد انزيم تفارق الأول عن طريق تمييع انزيم P مع العازلة المناسبة. سيتم معلق محتويات كل مخروطي 50 مل (1 عينة) مع ما مجموعه 1،950 ميكرولتر من مزيج الانزيم. مكان في مزيج انزيم في C حمام 37 درجة لمدة 10 دقيقة.
1 عينة: 1900 ميكرولتر من الاحتياطي + 50 ميكرولتر من انزيم غراء - تدور جميع أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 3-4 مكعبات الفئران القشور الجرو في 300 x ج لمدة 3 دقائق.
- نضح طاف وإضافة 1950 ميكرولتر من محلول أنزيم لكل أنبوب عينة وتحطيم بيليه من أنبوب للقلب ويهز بلطف.
- احتضان في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 15 دقيقة مع دوران أنبوب المستمر.
- خلال 5 دقائق الأخير من الحضانة، وإعداد مزيج انزيم الثاني A. تمييع الانزيم في المخزن المناسب لها. سيتم إضافة ما مجموعه 30 ميكرولترلكل 50 مل أنبوب عينة مخروطي الشكل.
1 عينة: 20 ميكرولتر من الاحتياطي + 10 ميكرولتر من انزيم - بمجرد الانتهاء من حضانة إضافة 30 ميكرولتر من مزيج انزيم الثاني إلى كل أنبوب وعكس إلى المزيج.
- باستخدام الزجاج ماصة باستير المرفقة إلى وحدة تحكم ماصة، تنأى ميكانيكيا الأنسجة بواسطة pipetting 10-15 مرات أو حتى يتم تخفيض قطعة نسيج في حجم وأصبح الحل غائمة. العودة العينة إلى 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 15 دقيقة مع دوران مستمر.
- ماصة كل الأنسجة جناسة عينة 10-15 مرات باستخدام ماصة 1 مل.
- ماصة كل الأنسجة جناسة عينة 15-20 مرات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر
- إعادة جميع العينات إلى 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 10 دقيقة مع دوران مستمر.
- إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) لكل عينة وتصفية جناسة من خلال مرشح 40 ميكرون المسام وضعت أكثر من 50 مترأنبوب لتر. شطف تصفية مع 1-2 مل إضافية من برنامج تلفزيوني.
- تجميع جميع العينات جناسة في أنبوب واحد 50 مل مخروطي الشكل والحصول على عدد خلايا العام.
- بعد أداء عدد الخلايا، وتقسيم جناسة بالتساوي إلى 15 مل أنابيب مخروطية (1 أنبوب لكل عينة). أجهزة الطرد المركزي لمدة 10-12 دقيقة في 300 × ز.
4. المضادة للA2B5 الخرزة التطبيق، العمود تنقية، والطلاء
- إجراء عمليات حسابية لعازلة عمود وميكروبيدات مكافحة A2B5. إضافة 7 ميكرولتر العمود العازلة لكل 1 × 10 6 خلايا. إضافة 2 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة A2B5 لكل 1 × 10 6 خلايا.
- الجمع بين كل من العينات عن طريق إعادة التعليق الخلايا في حجم ما مجموعه 10 مل من العازلة العمود والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10-12 دقيقة.
- resuspend الكرية خلية في كمية مناسبة من العازلة العمود المحسوبة في الخطوة 4.1. إذا كان بيليه هو كبير وفضفاض، إضافة ما يقرب من نصف فقط من حجم عازلة عمود للحفاظ على المضادةالجسم في التركيز المناسب في إعادة تعليق الخلية.
- احتضان تعليق خلية لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة ميكروبيدات مكافحة A2B5 (المحسوبة في الخطوة 4.1)، عكس عدة مرات، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. عكس بلطف الأنبوب عدة مرات كل 10 دقيقة. حضانة مرات أطول قد تزيد الغلة الخلية ولكن قد تزيد غير محددة ملزمة.
- إضافة 5 مجلدات من العازلة العمود. إذا ومعلق الخلايا في حجم 1 مل، إضافة 5 مل من العازلة العمود، في حين إذا ومعلق الخلايا في 2 مل، إضافة 10 مل من العازلة العمود.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز.
- تحديد عدد الأعمدة ليرة سورية وستكون هناك حاجة لتنقية. عمود واحد LS يكفي لمدة 15-20 × 10 6 مجموع الخلايا.
- resuspend الكرية خلية في 1000 ميكرولتر من العازلة عمود في العمود LS المستخدمة.
- رئيس كل عمود LS بإضافة 5 مل من العازلة العمود. جمع من خلال تدفق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة واحدة في بو عمودلقد مر ffer تماما من خلال الغرفة العليا، وتطبيق 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل عمود وتسمح للخلايا لتشغيل من خلال طريق الجاذبية.
ملاحظة: إذا كانت كثافة الخلايا عالية جدا، والعمود قد تشغيل بطيئة. - على الفور بعد أن مرت تعليق الخلية من خلال العمود، إضافة ببطء 3 مل من العازلة العمود إلى كل عمود لغسل الخلايا غير منضم. إذا غسل يعمل بسهولة من خلال العمود (1 قطرة كل 30-45 ثانية)، ويغسل مرتين إضافية مع 3 مل من العازلة العمود.
- إزالة كل عمود ووضعه على أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 5 مل من العازلة عمود ويغرق المنطقة العازلة من خلال العمود بمعدل سريع باستخدام المكبس البلاستيكية التي يتم حزم مع العمود. سوف تغرق طرد الخلايا ملزمة الإفراج عنهم من العمود.
- زيادة نقاء طريق تشغيل العينة من خلال الجولة الثانية من الأعمدة ليرة سورية. استخدام ثلث عدد الأعمدة المستخدمة أثناء مرور الأول. رئيس الأعمدة مع 5 مل من العازلة العمود.تسمح المخزن المؤقت العمود بالمرور عبر مجلس الشيوخ.
- منذ حجم التعليق الخلية ستكون أكبر من ذلك بكثير، تطبق بالتساوي 1000 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل عمود والسماح للتعليق بالمرور عبر الغرفة العليا من العمود قبل تجديد مع 1000 ميكرولتر إضافية.
- مرة واحدة تعليق خلية تم تطبيقه بشكل كامل في الجولة الثانية من الأعمدة، وغسل 2-3 مرات مع 3 مل من العازلة العمود.
- إزالة كل عمود ووضعه على العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 5 مل من العازلة عمود ويغرق المخزن المؤقت باستخدام المكبس البلاستيكية التي يتم حزم مع العمود. سوف تغرق طرد الخلايا ملزمة الإفراج عنهم من العمود.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 12-15 دقيقة. يجب أن تظهر بيليه المضغوط.
- resuspend الكرية خلية في 5-10 مل من وسائل الاعلام OPC انتشار قبل تحسنت (وسائل الإعلام قاعدة OPC تستكمل مع PDGF-AA 20 نانوغرام / مل).
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. لوحة الخلايا. تمييع الخلايا إلى 60000 خلية / مل مع وسائل الإعلام OPC انتشار الأسلحة النووية. في كل أسود، واضح أسفل 24 أيضا، الماصة 500 ميكرولتر من الخلايا على طول الجانب من البئر للحصول على 30000 خلايا لكل بئر. مزيج من الخلايا عن طريق الهز لوحة أفقيا باستخدام الرقم ثمانية الحركة. إذا كان أداء الفحص في 48، 96، أو 384 جيدا لوحات، إضافة 15000، 7500، أو 1500 خلية لكل جيدا، على التوالي. ويمكن تعديل هذه الأرقام حسب مواصفات لوحة على حدة.
- إعداد لوحة منفصلة لليوم 0 الثقافات مراقبة خط الأساس. ينبغي أن تكون ثابتة هذه لوحة التحكم مع بارافورمالدهيد 4٪ كما هو موضح في القسم 5.7، عند بدء التمايز في اليوم 0.
- ثقافة الخلايا في وسائل الاعلام انتشار OPC عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع أي تغيير وسائل الاعلام.
5. تحريض OPC التفاضل والارتباط مع 4٪ لامتصاص العرق
ملاحظة: عند اختبار تأثير جزيئات صغيرة على oligodendrogenesis، نحن dissolv بشكل روتينيالمخدرات الإلكترونية في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لإعداد 1،000x الأسهم التي يمكن تخزينها بعد ذلك في -80 درجة مئوية، وتضعف مباشرة إلى وسائل الإعلام ساتو للحصول على تركيز النهائي من 0.1٪ DMSO. وقد لاحظنا أي تغيير في أي OPC انتشار أو التمايز تستخدم هذه تركيز DMSO (لا تظهر البيانات).
- قبل دافئ وسائل الاعلام قاعدة OPC إلى 37 درجة مئوية، وذوبان الجليد الأسهم العلاج من تعاطي المخدرات إلى درجة حرارة الغرفة. عند إجراء العلاج في نسختين، وإعداد ما يقرب من 1.25 مل من وسائل الاعلام في مجموعة العلاج في أنبوب 1.5 مل. للحصول على عينات ثلاث نسخ، استخدام 2 أنابيب قدرة مل الطرد المركزي لحساب الركود.
- إعداد يمزج سيد العلاج للآبار تكرار عن طريق تمييع الأسهم العلاج مباشرة إلى وسائل الإعلام قاعدة OPC. لفترة وجيزة دوامة أو بلطف مزيج كل mastermix لضمان التوزيع المتجانس لتلقي العلاج.
- إعداد 45 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين (T 3)، والسيطرة الإيجابية وسيلة مناسبة كما سيطرة سلبية. تمييع 10 ملي تي 3 الأسهم1: 1000 في 1 مل من وسائل الاعلام قاعدة OPC ومن ثم مزيد من تمييع في مزيج العلاج الرئيسي للحد من تركيز النهائي من DMSO إذا لزم الأمر.
- نضح في وسائل الإعلام من الآبار الثقافة مجموعة العلاج في وقت واحد وذلك لتجنب تجفيف الخلايا. استخدام 200 ميكرولتر طرف الماصة على نهاية الماصة الزجاج باستور لتجنب كشط المادة السوداء من جانبي البئر وفي الثقافة.
- ببطء إضافة 500 ميكرولتر من mastermix العلاج على طول الجانب من البئر باستخدام الماصة 1 مل.
- احتضان الثقافات لمدة الإطار الزمني المطلوب، وأداء التبادل الاعلامى الكامل مع وسائل الإعلام معاملة جديدة كل 2-3 أيام. ونلاحظ بشكل روتيني م ب ب 30-40٪ + الثقافة بعد 4 أيام في وسائل الإعلام التمايز.
- في نهاية فترة العلاج المطلوبة، وإعداد الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) أو ذوبان الجليد الأسهم المجمدة إلى درجة حرارة الغرفة. تنبيه: PFA غير سامة للغاية ويجب أن يكون مستعدا في غطاء الدخان.
- نضح في وسائل الاعلام وإضافة ببطء 4001؛ لتر من منهاج العمل إلى جانب البئر لإصلاح الخلايا. احتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح PFA وإضافة ببطء 500 ميكرولتر من العقيمة مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) إلى جانب البئر لغسل الخلايا. تكرار غسل ما مجموعه مرتين أخريين. لا نضح غسل النهائي.
- التفاف لوحة في بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التجهيز لاحق أو الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية. لوحات يمكن تخزينها لعدة أسابيع.
6. سيتولوجية مناعية والكمي للبروتين النخاعين الأساسي
ملاحظة: عند تنفيذ إجراءات التعامل مع السائل في 24 لوحات جيدة، فمن المستحسن أن نعمل بسرعة لتجنب تجفيف الخلايا. هنا، ينصح استخدام الشافطة فراغ متعدد القنوات ومتعدد القنوات الماصة.
- جلب لوحة لدرجة حرارة الغرفة، ونضح الآبار، وإضافة 250 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 5٪مصل الماعز العادي (خ ع). احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الهز المداري لطيف.
- تحضير محلول الحضانة الأولية عن طريق تمييع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للم ب ب الضد 1: 1000 والضد الأرنب بولكلونل مكافحة الأكتين 1: 200 في مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) تحتوي على 5٪ خ ع. بدلا من ذلك، الأرنب بولكلونل مكافحة Olig2 في 1: 1000 ويمكن استخدامها لدبقية قليلة التغصن تطبيع معين في الثقافات الدبقية مختلطة. إعداد الحل الأساسي يكفي لاستيعاب 250 ميكرولتر لكل بئر.
- احتضان الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية خلال الليل ل16-18 ساعة مع الهز المداري لطيف.
- نضح الحل حضانة الابتدائي وغسل الخلايا 3 × 10 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) في درجة حرارة الغرفة مع الهز المداري لطيف.
- في حين غسل لوحة، وإعداد حل حضانة الثانوي عن طريق تمييع لمكافحة فأر 680 والمضادة للأرنب 800 الأجسام المضادة 1: 500 في مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم 2+ 2+) تحتوي على 5٪ خ ع. تقليل التعرض للضوء المحيط عند إعداد هذا الحل.
- نضح غسل النهائي وإضافة 250 ميكرولتر من محلول الحضانة الثانوي. حماية لوحة من الضوء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الهز المداري لطيف.
- نضح الحل حضانة الثانوية، ويغسل الآبار 3 × 10 دقيقة مع 500 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) في درجة حرارة الغرفة مع الهز المداري لطيف.
- مسح لوحة باستخدام نظام التصوير قادر على الكشف عن 700 نانومتر و 800 نانومتر الانبعاثات مضان. كنقطة انطلاق، تعيين الوصل تعويض إلى 3 والحساسيات إلى 1.5 ل م ب ب، 5.0 لأكتين، و 3.5 لOlig2. ضبط القيم حساسية حسب الحاجة لتجنب التعرض المفرط إشارة.
- تحديد مدى oligodendrogenesis استخدام أساليب تعتمد على البرمجيات شبه الآلي.
- باستخدام البرنامج، تعيين وضع تحليل لوحة ل"24 حسنا" ومواءمة الدوائر حول ركان محيط الخارجي من الآبار الممسوحة ضوئيا. تعيين القناة التطبيع "800" وتصدير الكلية والنسبية كثافة مضان لنانومتر 700 (ب ب) و 800 نانومتر (Olig2 / أكتين) القنوات.
- تقسيم كثافة في 700 نانومتر كثافة في 800 نانومتر لإعطاء التعبير MBP تطبيع في وحدات مضان النسبية. حساب متوسط قياسات تكرار وتوسيع نطاق التعبير إلى يوم 0 ضوابط + PDGF حسب الحاجة للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عزل يجد OPCs-A2B5 إيجابي من خلال تحديد الخلية الإيجابية باستخدام نظام فصل العمود المغناطيسي. قبل إجراء العزل، تتم إزالة كامل الدماغ من الفئران الوليدة التي هي بين P5 وP7. بمجرد فصل الدماغ كله بنجاح من الجمجمة، وإزالة المصابيح حاسة الشم والمخيخ باستخدام ملقط الجراحة الدقيقة (الشكل 1A). من أجل عزل الأنسجة القشرية الدماغية يتم استئصال ما تحت المهاد، المهاد والدماغ المتوسط عن طريق تشريح دقيق (الشكل 1B). وبعد ذلك، تتم إزالة الحصين والمخطط باستخدام ملقط الجراحية عازمة (الشكل 1C - D). عملية عزل فعال يزيل خلايا سحائي والخلايا الليفية، ولكن تحسن الهضم الأنزيمي عندما تتم إزالة السحايا والأوعية الدموية (الشكل 1E). وأخيرا، يتم إعداد كتل الأنسجة من 1 مم × 1 مم للخطوات تفكك النسيج اللاحقة (الشكل1F لدى عودتهم).
ينبغي أن يؤدي والعزلة OPC جيدة في خلية بيليه الصغير بعد خطوة تدور النهائية (الشكل 2A). مرة واحدة مطلي فإن هذه الثقافات أن تكون خالية نسبيا من الحطام الخلوي عندما ينظر تحت المجهر (الشكل 2B). قد يؤدي للعزلة دون المستوى الأمثل في بيليه كبير ورقيق بسبب وجود كميات كبيرة من الحطام الخلوي. وهذا الحطام تلتزم بقوة إلى السفينة المغلفة PLL وربما يتعارض مع ثقافة (الشكل 2C). إذا تحقق بيليه كبير ورقيق، قد تساعد على resuspend الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني وتكرار تدور النهائي لمدة 10 دقيقة في <300 × ز. مرة واحدة في عزلة كاملة، ونقاء الثقافات يمكن تقييمها من قبل التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للخلايا A2B5 إيجابي. والعزلة الناجحة ينبغي أن يؤدي إلى مجموعة من الخلايا التي هي> 95٪ إيجابية لA2B5 (الشكل 2D - F). مقارنة مع الخلايا الملون مع الأجسام المضادة الفلورسنت صبغ مترافق مكافحة A2B5، يجب أن تظهر خلايا غير ملوثين كما يبلغ عدد سكانها السلبي، ويمكن استخدامها كمرجع أساسية لالنابضة. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا سابقا أن اختيار يجد OPCs باستخدام عائدات A2B5 مستضد الثقافات التي وصمة عار إيجابية لPDGFRα التي كتبها مناعية 11.
كما يتبين من مناعية، يجد OPCs في بداية العلاج (يوم 0) هي Olig2 + / م ب ب - في حين أن الخلايا هي Olig2 + / م ب ب + من يوم 4 (الشكل 3). وترد confluency الأمثل ليجد OPCs و oligodendrocytes في يوم 0 ويوم 4 في الصور الحقل مشرق التمثيلية (الشكل 4A). غياب التعبير م ب ب في يوم 0 بمثابة الأساس لقياس oligodendrogenesis. التمايز عفوية نتيجة لانسحاب PDGF-AA بمثابة سيطرة سلبية، في حين أن 45 نانومتر هرمون الغدة الدرقية (triiodothyronine. T3) يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية 11،15. كيوتيابين، المعروف أيضا باسم سروقول، وكليماستين، المعروف أيضا باسم Tavist، والأدوية التي ثبت لتسريع في المختبر oligodendrogenesis، ويمكن استخدامها كما الضوابط الإيجابية إضافية 16،17 ادارة الاغذية والعقاقير وافق. ويبين الشكل 4B ممثل اثنين من قناة الأشعة تحت الحمراء مسح الفلورسنت إظهار النتائج المتوقعة لكل من هذه الشروط في ثلاث نسخ. تم pseudocolored الأكتين وم ب ب إشارات الأخضر والأحمر على التوالي بحيث ثقافات متباينة للغاية تظهر الصفراء في الصور المدمجة. وتشير النتائج إلى أن MBP التعبير في يوم 4 في حالة انسحاب PDGF كان 4.5 ± 1.4 أضعاف أعلى بالمقارنة مع يوم 0، في حين أن التغييرات أضعاف في MBP بسبب العلاج بهرمون الغدة الدرقية، كيوتيابين، وكليماستين كانت 33.9 ± 4.1، 33.4 ± 1.0 ، و 32.8 ± 0.5 على التوالي (الشكل 4C). وأثبتت متانة ودقة الفحص من قبل SMكل الانحرافات المعيارية بين عينات من ثلاث نسخ ونافذة تفعيل العلاج واسع أن حوالي 20 الانحرافات المعيارية فوق عنصر التحكم انسحاب PDGF.
بينما يقدم أكتين باسم الجينات مرجع موثوق للتطبيع في الثقافات دبقية قليلة التغصن، جينات مرجعية بديلة يمكن أن تستخدم أيضا. Olig2 هو عامل النسخ النووي التي يعبر عنها بشكل جوهري في الخلايا من سلالة دبقية قليلة التغصن. لها نمط معين والتأسيسية التعبير وبالتالي قد توفر استراتيجية تطبيع أكثر من الأفضل في حالات ثقافة متجانسة الشكل 5 يدل على أن في الثقافات OPC متباينة مع 10 نانومتر هرمون الغدة الدرقية، وتغير أضعاف المحسوبة في MBP التعبير بالنسبة لانسحاب PDGF هو نفسه عند استخدام إما Olig2 أو أكتين للتطبيع. ويفترض، منذ كانت الثقافات OPC في هذه التجربة نقية جدا، على حد سواء البروتينات يمكن استخدام موثوق للتطبيع. ومع ذلك، فإننا ofteن مراقبة عدد صغير من السكان من الخلايا Olig2 سلبية من يوم 4، ولكن لا يبدو أن نسبة هذه الفئة من السكان إلى السكان Olig2 إيجابية تختلف بشكل كبير بين انسحاب PDGF ومجموعة T3 المعالجة. وبالتالي، لا تتأثر-التغييرات أضعاف. وبالنظر إلى سيناريو حيث العلاج قد يسبب انتشار أنواع الخلايا Olig2 سلبية، واختيار من الأجسام المضادة التطبيع يجب أن تدرس بعناية.
الشكل 1:.. الجرذ إجراء تشريح الدماغ وصف السائر من إجراء تشريح الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل التدفق الخلوي من عزلةيجد OPCs. (A) بعد تنقية العمود المغناطيسية، وانخفض عدد السكان خلية ملزمة للخروج من عمود وطرد لتشكيل بيليه المضغوط. يشار إلى كمية الحطام حسب حجم الكرية. (ب) إذا كان بيليه هو المدمجة، ثم الحطام سوف يكون ضئيلا للغاية في الثقافة. (ج) وبيليه كبير ورقيق النتائج عادة في الثقافة مع الحطام الثقيل. يتم تحديد نقاء الثقافة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الفئران لمكافحة فأر A2B5 الأجسام المضادة التي مترافق إلى APC. تم استبعاد (D) الخلايا الميتة والحطام من التحليل كما هو مبين في الأمام مبعثر والتشرذم الجانب المؤامرات. (E) عدد السكان إيجابي A2B5 يمكن تحديد باستخدام غير ملوثين عينات كمرجع أساسية لالنابضة. وينبغي أن يكون (F) يجد OPCs معزولة بنجاح> 95٪ إيجابي لA2B5. الرجاء انقر هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: ثقافة OPC وإجراء المفاضلة يبدأ مضان المسح الضوئي (DIFS) فحص مزدوج الأشعة تحت الحمراء مع يجد OPCs الفئران isolatedA2B5 إيجابية طازجة مطلي على السفن الثقافة المغلفة PLL (يوم 3). وانتشرت هذه الثقافات لمدة 3 أيام بحضور 20 نانوغرام / مل PDGF-AA، وبعد ذلك تعامل مع العوامل التجريبية في وسائل الإعلام PDGF خالية جديدة على يوم 0. وسائل الاعلام العلاج وتجديد بالكامل في يوم 2، ويتم إصلاح الخلايا مع تم تنفيذ 4٪ لامتصاص العرق في يوم 4. سيتولوجية مناعية لOlig2 (الخضراء) وم ب ب (الحمراء) على الثقافات تمثيلية في يوم 0 ويوم 4 باستخدام دابي (الأزرق) على أنه وصمة عار مكافحة النووية. هذه الثقافات يحمل تلطيخ التأسيسي للعموم دبقية قليلة التغصن النسب علامة الخلية Olig2 في أيام 0 و 4، في حين تلطيخ للعلامة دبقية قليلة التغصن ناضجة MBP هو الوحيد إفالرمز من يوم 4. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ب ب الكمي باستخدام الفحص المزدوج الأشعة تحت الحمراء مضان المسح الضوئي (DIFS) (A) كثافة الثقافات OPC في يوم 0 ويوم 4 المطلوبة لأداء الاختبار الأمثل. (ب) الممثل بمسح مضان مزدوج الأشعة تحت الحمراء. وتختلف يجد OPCs في 24 لوحات جيدا لمدة 4 أيام في وجود 45 نانومتر T3، 1 ميكرومتر كيوتيابين، 1 ميكرومتر كليماستين، أو 0.1٪ DMSO في ثلاث نسخ. تمت معالجة صفيحة منفصلة تحتوي يجد OPCs التي تم إصلاحها في اليوم 0 (+ PDGF) في نفس الوقت. الأكتين (pseudocolored الخضراء) وم ب ب (pseudocolored الأحمر) وكميا في وقت واحد باستخدام Licor أوديسي الماسح الضوئي المقرر أن الكشف عن 700 نانومتر و 800 نانومتر الانبعاثات. (
الرقم 5: Olig2 هو بروتين مرجعية موثوقة لتطبيع التعبير MBP في الخلايا قليلة التغصن كانت متباينة يجد OPCs في ثلاث نسخ في ظل وجود 10 نانومتر T3 أو 0.1٪ DMSO السيطرة على السيارة في 24 لوحات جيدا لمدة 4 أيام. تم إجراء فحص مضان مسح ثنائي الأشعة تحت الحمراء باستخدام مكافحة Olig2 أو الأجسام المضادة الأولية مكافحة أكتين للتطبيع. Olig2 / أكتين وم ب ب وكميا في وقت واحد باستخدام Licor أوديسي الماسح الضوئي المقرر أن الكشف عن 700 نانومتر و 800 نانومتر الانبعاثات. كان MBP التعبير لاrmalized إما Olig2 أو التعبير الأكتين، وتم تحجيمها النتائج إلى السيطرة DMSO 0.1٪. وحدات مضان النسبي يعني ± SD تم التخطيط باستخدام GraphPad بريزم تظهر 6. النتائج أن تحسب التغير أضعاف هو نفسه عندما تطبيع إما من البروتينات إشارة اثنين.
الشكل 6: تأثير تريتون X-100 على م ب ب تلطيخ كانت متباينة يجد OPCs في 24 لوحات جيدا لمدة 4 أيام في وجود 45 نانومتر T3 أو 0.1٪ DMSO. وبعد ذلك ثابتة الثقافات مع PFA 4٪ والملون لOlig2 وMBP باستخدام بروتوكولين مناعية مختلفة. لعالية عينة تريتون X-100، تم permeabilized الخلايا لمدة 1 ساعة مع 0.4٪ تريتون X -100 وتم إجراء جميع الخطوات حضانة الأجسام المضادة في وجود 0.1٪ تريتون X-100. لانخفاض عينة تريتون X-100، تم permeabilized الخلايا لمدة 1 ساعة مع 0.1٪ تريتون X-100، في حين antiboأجريت حضانات دى دون تريتون X-100. وتصور Olig2 وم ب ب مع تم الحصول الفلورسنت المرتبات الثانية والصور صبغ مترافق باستخدام القائم على الكاميرا مضان المجهر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة سريعة وموثوق بها لعزل يجد OPCs الفئران وقياس في oligodendrogenesis المختبر استجابة لعوامل التجريبية. عن طريق اختيار إيجابية، وتستخدم عوائد عالية من يجد OPCs قابلة للحياة ونقية مباشرة لأغراض تجريبية. هذه الطريقة يبسط العزلة، زراعة، والخطوات التمايز في إطار زمني 1 أسبوع، وخلايا ثابتة ويمكن تخزين مريح في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع دون أي خسارة في حساسية الفحص.
والميزة الرئيسية مع المقايسات مضان القائم على الماسح الضوئي هو أن الحصول على البيانات وتحليلها والإسراع إلى حد كبير مقابل تقنيات المجهر التقليدية القائمة على الكاميرا. وعلى الرغم من استخدام المجهر بنجاح في شاشات عالية الإنتاجية لتحديد محرضات من OPC التمايز، والحصول على البيانات هي بطبيعتها أبطأ لأنه يتطلب برمجة تسلسل التقاط الصور، عدة ساعات من جمع البيانات وتحليلها من مئات إلى thousands من ملفات الصور، والخوارزميات المعرفة للتمييز أجسام الخلايا الفردية للتطبيع أو تحليل 18،19. وعلاوة على ذلك، مع أنظمة المجهر القائم على الكاميرا أنه ليس من الممكن الحصول على البيانات من كامل سطح سفينة الثقافة. بدلا من ذلك، يجب أن تكون الصور الملتقطة تمثيلية من مناطق مختلفة داخل بئر واحدة، مما قد يؤدي إلى تحيز الموضعية ويضرب إيجابية كاذبة. وعلى سبيل المقارنة، فإن هذا الفحص بالكشف عن التعبير MBP من جميع الخلايا داخل معين بشكل جيد، ولوحات متعددة يمكن مسحها في وقت واحد. في حين يمكن أن تتكيف هذه الطريقة للاستخدام في 96-جيدا أو 384 كذلك الأشكال، قد يكون من المفضل لوحة 24-جيدا عندما يجري اختبار أقل العلاجات. وقد لاحظنا أن فقدان الخلايا في 24 لوحة جيدا بسبب مناولة السائل إلى أدنى حد ممكن، وهو المضاعفات التي يجب أخذها في الاعتبار عند تصميم تجارب إنتاجية أعلى.
معلمة حرجة للفحص هي كثافة الخلايا عندما differentiوبدأت أوجه في يوم 0. الثقافات مع خلايا قليلة جدا ويبدو أن تفرق أكثر ببطء وتموت، في حين أن الثقافات عالية الكثافة يحمل التمايز عفوية. كلتا الحالتين قد يقلل من نطاق ديناميكي، واعتمادية من الفحص. لتحقيق التوازن الأمثل بين الصحة الخلية وكثافة الخلايا، ونحن ثقافة يجد OPCs لمدة 3 أيام دون تبادل وسائل الإعلام أو المكملات من جديد PDGF-AA. افترضنا أنه منذ تركيز PDGF-AA في الانخفاض وسائل الإعلام من قبل يوم 3 في المختبر (يوم 0) نتيجة لهدم الخلوي، فإن معدل التكاثري من الخلايا سيتباطأ يتم تقليل مثل هذا الانتشار خلال اليوم الأول من PDGF- انسحاب AA. هذا الأسلوب يعمل بشكل أفضل عندما يتم توزيع الخلايا بالتساوي خلال الطلاء. pipetting لالخلايا على طول الجانب من البئر ومزجها باستخدام الرقم ثمانية الحركة ينبغي أن تعزز حتى التوزيع. pipetting لفي وسط البئر يميل إلى إنتاج مجموعات من الخلايا حول حواف البئر مع قليلخلايا إيه الانضمام إلى المركز. قد تكون هذه الظاهرة نتيجة لاختلال طبقة PLL المجفف حديثا من قبل قوات pipetting لالسائلة. تراكم الخلايا حول محيط قد يقلل من حساسية الفحص لأن التمايز التي تعتمد على كثافة. من المهم أن نلاحظ أن اختلافات كبيرة في شدة إشارة / Olig2 أكتين يمكن أن يحدث بين والثقافات انسحاب PDGF المعالجة المخدرات والسيطرة عليها. انخفضت بشكل ملحوظ أكتين / إشارة Olig2 قد يشير إلى سمية الدواء، في حين زادت بشكل ملحوظ أكتين إشارة / Olig2 قد يشير انتشار المخدرات التي يسببها. نحن عادة مراقبة أعلى قليلا إشارة أكتين / Olig2 من الخلايا المعالجة بالأدوية المؤيدة للتمييز مقارنة مع الضوابط انسحاب PDGF. ونحن نعزو هذا الفارق إلى ارتفاع معدل موت الخلايا المبرمج عفوية في مجموعة انسحاب PDGF خلال إجراء المفاضلة 4 أيام. عند تقييم oligodendrogenesis، تطبيع م ب ب لأكتين / يجب Olig2 تصحيح الاختلافات عدد الخلايا. لتقييم TOXIالمدينة وانتشار استخدام هذا الاختبار، و-م ب ب مكافحة الأجسام المضادة يمكن استبدال الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد علامات المناسبة.
عندما تتطلب التجارب على حد سواء التقييم الكمي والنوعي، فمن المهم للحد من التعرض لثقافات دبقية قليلة التغصن الفئران الثابتة لتريتون X-100 عند استخدام PFA 4٪ لإصلاح الخلايا. بروتوكولات مناعية أخرى للثقافات دبقية قليلة التغصن، والتي تشمل عادة تريتون X-100 خلال كل من الخطوات الأجسام المضادة حضانة لتحسين الأجسام المضادة الوصول حاتمة، يمكن أن تستخدم بنجاح حسب متطلبات التجريبية. من ناحية أخرى، على الرغم من MBP هو البروتين داخل الخلايا قد يكون من الممكن استبعاد تريتون X-100 تماما إذا تم استخدام طرق تثبيت بديلة permeabilize كاف الخلايا. باستخدام الشروط الموضحة هنا، لاحظنا أن تريتون X-100 يؤثر على التشكل الملحوظ في الخلايا قليلة التغصن فضلا عن توطين م ب ب تلطيخعند استخدامها بتركيزات عالية. ونحن لا نرى انخفاضا كبيرا في تلوين الأجسام المضادة عندما تم حذف تريتون X-100 من الخطوات الأجسام المضادة الحضانة. كما هو مبين في الشكل (6)، بما في ذلك 0.4٪ تريتون X-100 في permeabilization وخطوة حجب، و 0.1٪ تريتون X-100 أثناء الحضانة الأجسام المضادة، ويقلل من الكشف عن عمليات المايلين والنتائج في متقطع تلطيخ م ب ب. لذلك، للتقييم الكمي والنوعي، قد يكون كافيا لاستخدام تركيز أقل من تريتون X-100 كما هو موضح هنا.
في حين أن استخدام يجد OPCs مختارة A2B5 من الفئران يمكن أن يكون مفيدا، لاحظنا نتائج مماثلة في فحص مزدوج الأشعة تحت الحمراء مضان المسح الضوئي (DIFS) باستخدام يجد OPCs مختارة A2B5 من C57BL / 6 الفئران، على الرغم من أن العائد خلية في الماوس عادة بكثير الدنيا (لا تظهر البيانات). قد تكون البروتوكولات الأخرى لتنقية OPC أيضا متوافقة مع هذا الاختبار. على سبيل المثال، دبقية قليلة التغصن علامة O4 يمكن استخدامها بوصفها مستضد لتنقية كثافة العملياتermediate السلائف مرحلة دبقية قليلة التغصن باستخدام حبات مغناطيسية 20. كبديل للطرق مقرها المغناطيسي، يجد OPCs يمكن إثراء من يوم 9 القديمة الثقافات الدبقية المختلطة التي تحتوي على الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة التي مرحبا السرعة المدارية الهز والالتصاق التفاضلية الطرق 21. وعلاوة على ذلك، والإجراءات التي تشمل يمكن استخدامها على حد سواء السلبية والإيجابية تحديد الخلية إذا كان يفضل نقاء الثقافة على عوائد عالية الخلية 22 بالغسل المناعية. بالإضافة إلى دراسة كيفية العلاجات قد تحسن بشكل مباشر على التفريق بين يجد OPCs في ثقافات نقية، فمن الضروري في بعض الأحيان للنظر في الآثار غير المباشرة للمخدرات من خلال أنواع الخلايا الأخرى في نظام الثقافة المشتركة. في مرض التصلب العصبي المتعدد، ويعتقد تسلل خلايا T المستجيب autoreactive في الجهاز العصبي المركزي للعب دور في تطور المرض 23. الخلايا التائية المستجيب قد تفرز عوامل الموالية للالتهابات التي قد تحول دون تمايز يجد OPCs في مواقع إزالة الميالين. ولذلك من مصلحة لتحديد ثيراpeutics التي قد تحمي يجد OPCs ومنع هذه العوامل المؤيدة للالتهابات من تفاقم الإصابة. قد يكون فحص DIFS المثالي لنمذجة هذا النشاط كما تنمو الخلايا تي في تعليق ويمكن غسلها بعيدا عن ثقافة دبقية قليلة التغصن قبل MBP الكمي. لدراسات الثقافة المشتركة التي تنطوي على الخلايا الملتصقة مثل الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، يجوز توظيف Olig2 التطبيع لجمع البيانات من الخلايا قليلة التغصن على وجه التحديد. وهكذا، فإن المرونة للمقايسة DIFS قد تسهل مجموعة متنوعة من التصاميم التجريبية.
في الختام، هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وموثوق بها لقياس oligodendrogenesis من يجد OPCs الفئران A2B5 إيجابي في المختبر. وهذه الطريقة العزلة يسلم باستمرار عوائد عالية من يجد OPCs قابلة للحياة التي تستجيب للمنبهات التمايز المعمول بها. يمكن إجراء تحليل حساسية في السفن المتعددة الشكل جيدا باستخدام مجموعة متنوعة من النماذج التجريبية التي تمتد فائدة هذا النظام إلى maنيويورك التطبيقات المختلفة. وعلاوة على ذلك، وفحص DIFS يمكن تكييفها للالإنتاجية العالية فحص المخدرات، أو يمكن أن تستخدم للتحقق من نتائج المقايسات الإنتاجية المنخفضة مثل PCR الكمي وصمة عار الغربية. الأهم من ذلك، يمكن أن يقدم هذا النظام وسيلة بسيطة لكنها فعالة لتحديد OPC العلاجات المستهدفة في المزيل للأمراض مثل التصلب المتعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
منح الراعي: المعاهد الوطنية للصحة. منحة رقم: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
