Introduction
Effektiv nerveledning i pattedyrsentralnervesystemet (CNS) krever myelinisering av aksoner ved oligodendrocytter. Under utviklingen oppstår oligodendrocytes fra en pool av oligodendrocyte stamceller (OPCs) som er tenkt å migrere fra ventrikulære soner i utviklingsbrain og nevralrøret en. Etter migrasjons OPCs differensieres til modne, myelinerende oligodendrocytter som ikke bare legge til rette for effektiv impuls forplantning, men også gi aksoner med trofisk støtte to. Den voksne CNS opprettholder en rik bestand av OPCs som er spredt over hele grå og hvit substans som utgjør ca 5-8% av alle celler 3. Etter en demyeliniserende fornærmelse, OPCs migrere til skadestedet, spre seg, og skille for å erstatte tapte eller ødelagte myelin hylser på utsatte aksoner. Men i noen sykdom / skade innstillinger, er denne prosessen funnet å være ineffektiv eller kan mislykkes fullstendig fire. Menskronisk demyelinisering er tenkt å legge til byrden av sykdom, effektiv oligodendrogenesis og remyelinisering kan lindre symptomene 5. Det har derfor vært av interesse å studere OPCs in vitro for å bestemme effekten av eksperimentelle faktorer på oligodendrogenesis.
Innsikt i de ulike faser av oligodendrocytt differensiering har blitt gjort mulig ved identifikasjon av scenen spesifikke cellemarkører. Selv fornye tidlige stamceller er definert av deres uttrykk av plate avledet vekstfaktor reseptor alfa (PDGFRα), neural / glia antigen 2 (NG2) og A2B5 6-8. Som OPCs initiere deres differensiering program og trekke seg fra cellesyklus, de nedregulere uttrykket av disse markørene og begynne å uttrykke proteiner som indikerer premyelinating oligodendrocytes inkludert Syklisk-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) og O4. Til slutt, deres differensiering i mer modne oligodendrocytes er kjennetegnet ved ekspresjon av myelin-assosierte proteiner, inkludert myelin-assosiert glykoprotein (MAG), proteolipidprotein (PLP), og myelin basisk protein (MBP). MBP-prosessoren er en intracellulær perifert membranprotein og en hovedkomponent i myelinlaget. Mus som mangler MBP utvikle en alvorlig fenotype der CNS myelination er betydelig redusert som fører til skjelvinger, kramper og tidlig død 9,10. Denne viktige rollen av MBP i myelinisering har ført til dens anvendelse som en markør for oligodendrocytt differensiering både in vitro og in vivo 11.
Kvantifisering av MBP kan oppnås ved hjelp av flere forskjellige metoder. RT-PCR og Western blot analyse tillater kvantifisering av MBP nivåer under forskjellige behandlingsregimer. Immunocytochemistry er en vanlig kvalitativ tilnærming som også kan være kvantitativ når kamerabaserte mikros tilnærminger brukes. Selv om disse systemene er pålitelig og grunnleggende forstudiet av oligodendrocytt differensiering, de har sine egne ulemper som begrenser deres anvendelse i legemiddel-screening. Først, mengden av primære OPCS som er nødvendig for RT-PCR og Western blot-analyse reduserer antallet variabler som kan undersøkes samtidig. Mens celle kravet for immunocytokjemi er mye lavere, må betydelig tid være viet til hvert eksperiment hvis kvantifisering er målet. Mange bilder må fanges og deretter kvantifisert til rette for eksperimentell analyse. Disse begrensningene blitt viktige hindringer for å vurdere for studier som krever høy gjennomstrømning vurdering. Her beskriver vi en fremgangsmåte som anvender grunnleggende trekk fra både immunocytokjemi og Western blot-metoder for kvantifisering myelin, samtidig som betydelig reduserer både antallet celler som kreves, og tid til å fullføre kvantitativ analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og Johns Hopkins School of Medicine.
1. Utarbeidelse av analyseplater, Stock Solutions, og OPC Base Media
Merk: rotte OPC basis (Sato) media beskrevet her er hentet fra tidligere publiserte studier 12,13. Alternative medie formuleringer kan også være kompatible med denne prosedyren.
- Resuspender poly-L-lysin (PLL) til en konsentrasjon på 10 ug / ml i sterilt avionisert vann. Pipetter 400 mL av den fortynnede PLL i hver brønn i en svart vegger, klar bunn 24 godt vev kultur grade parabolen.
- Coat vevskulturskåler i 2 timer i et 37 ° C vevskulturinkubator eller natten over i et 4 ° C kjøleskap.
- Sug PLL fra belagte retter minst 20 min før plating. Tillate den gjenværende PLL for å tørke fra brønnen ved å lage en 24 brønners plater med lokket delvis på klem i en vevskulturhette. Kontroller at brønnene er helt tørre før plating isolerte OPCs. Celler vil ikke forholde seg til plast som har flytende PLL stede.
- Fremstille N-acetyl-L-cystein (NAC) stamoppløsning (1,000x): Oppløs 100 mg N-acetyl-L-cystein (NAC) i 20 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered Hydrokortison stamløsning (1,000x): Tilsett 1 ml etanol til 1 mg Hydrokortison og virvel å oppløse. Legg 19 ml DMEM, bland løsningen, delmengde og oppbevar ved -20 ° C. Tilsetningen av hydrokortison til basismateriale har vist seg å forbedre overlevelsen av gliaceller 14.
- Fremstille d-Biotin løsning (5,000x): Oppløs 2,5 mg d-biotin i 50 ml PBS. Legg 1-2 x 5 pl dråper med 0,1 N NaOH for å hjelpe til med oppløsningen. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
- Insulin fremstille stamløsning (100x): Oppløs 25 mg insulin i 50 ml vevskultur karakter vann. Tilsett 250 ul of 1 N HCl og blandes inntil løsningen er klar. Steriliser med en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C i opptil seks uker.
- Forbered Sato stamløsning (100x):
- Fremstille progesteron stamløsning (25 ug / ul): Oppløs 2,5 mg progesteron i 100 ul etanol.
- Forbered natriumselenitt stamløsning (400 ng / ul): Oppløs 4 mg natriumselenitt i 100 ul 0,1 N NaOH. Tilsett 10 ml DMEM og bland.
- Til 100 ml DMEM, tilsett 1 g av humant apo-Transferrin, 1 g av bovint serumalbumin, og 160 mg av putrescin og bland til fullt ut å oppløse. Legg 25 mL av progesteron stamløsningen, 1.000 mL av natrium selenitt stamløsning, og bland. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered OPC Base Media: per 100 ml DMEM (med 4,5 g / L D-glukose, L-glutamin, og 110 mg / l natrium-pyruvat), tilsett 100 ul NAC, 100 ul hydrokortison, 20 ul d-biotin, 1 ml insulin, en ml Sato lager, 100 ul sporstoffer B,2 ml B-27 supplement (50x), og 1 ml penicillin / streptomycin (100x). Steriliser med en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Fremstille PDGF-AA-lageroppløsning (1,000x): Oppløs 250 ug i 12,5 ml PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) for å lage en 20 pg / ml oppløsning. Delmengde og oppbevares ved -80 ° C.
- Forbered OPC spredning media: OPC basismedium supplert med 20 ng / ml PDGF-AA.
- Forbered OPC differensiering media: OPC basismedium supplert med 45 nM trijodtyronin.
- Forbered søylebuffer: Til 500 ml PBS, tilsett 2,5 g BSA og 2 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og justere pH til 7,2. Steriliser med en 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
2. Rat Brain Dissection
Merk: P5-P7 rotteunger er brukt i denne protokollen. Hver rotte valp cortex gir ca 1,5-2,0 x 10 6 A2B5 positive celler.
- Steriliser alle disseksjon utstyr ved hjelp av en 2506 C oppvarmet perle sterilisator.
- Legg 15-20 ml PBS (uten Ca 2+ og Mg2 +) til 50 ml koniske rør. En 50 ml konisk rør er tilstrekkelig for 3-4 rotteunge korteks. Plasser 50 ml koniske rør på is. Bruk 50 ml koniske rør for å holde terninger cortex vev under disseksjon.
- Legg kald PBS til en 10 cm petriskål. Denne retten vil bli benyttet for disseksjon under lysmikroskop.
- Sacrifice rotteunger ved halshogging med store kirurgiske saks. Sprayhode med 70% etanol.
- Pakk hele hjernen
- Bruke liten saks kutte huden ned midtlinjen og bak ørene og peel huden flaps tilbake. Kutt kraniet ned midtlinjen fra hjernestammen og endte på øynene. Vær forsiktig med å kutte for dypt for å bevare strukturen i den underliggende cortex.
- Lag to tverrgående snitt dårligere enn lillehjernen ved å sette inn små kirurgiske saks inn i foramen magnum. Lag en ekstra kutt mellom øynene, maurerior til olfactory pærer.
- skrelle nøye hver halvdel av kraniet tilbake. Fjern hele hjernen og plass i 10 cm petriskål fylt med kald PBS.
- Under disseksjon lysmikroskop, fjerne olfactory pærer og lillehjernen med fin kirurgiske tang.
- Flip hjernen slik at den ventrale overflaten er synlig under lysmikroskop.
- Bruke fin Rett pinsett utføre en stump disseksjon ved å plassere lukkede tang tips mellom hjernebarken og hypothalamus til en dybde på 2/3 av hjernen. Når tang er på plass tillate endene til å åpne. Gjenta for den andre halvkulen.
- Erte cortex fra hypothalamus og midthjernen regioner.
- Fjern hypothalamus, thalamus, og midthjernen ved å holde midthjernen ved dens bakre overflate og skrelle den mot den fremre enden av hjernen. Sever fremre tilkoblinger.
- Ta av hippocampus ved pealing det utover og deretter kutte forbindelsen tilcortex hjelp av gode bøyde disseksjon tang.
- Fjern gjenværende striatum ved utrangering det fra den underliggende cortex i en ytre diagonal bevegelse ved hjelp av gode bøyde disseksjon tang.
- Fjern eventuelle blodårer og hjernehinnene fra baksiden av hjernebarken.
- Flip hjernen slik at den dorsale overflaten er synlig. Hjernehinnene og blodkar bør være innlysende. Skrell hjernehinnene fra den underliggende cortex med lekkert disseksjon tang. Begynn peeling fra luktelappen festepunkt.
- Komplett trinn 02.04 til 02.14 for totalt 3-4 rotteunger.
- Plasser 3-4 dissekert rotte pup ekser i en tørr petriskål og hogge med en sterilisert barberblad inntil 1 mm x 1 mm biter er oppnådd. Samle vev ved å skylle tallerken med PBS fra en 50 ml konisk rør (trinn 2) og deretter sette inn igjen på is.
3. Enzymatisk og mekanisk Tissue Dissosiasjon
Merk: For dette trinnet, er en papain-baserte nevrale dissosiasjon kit anbefales. med Neural Dissosiasjon Kit (P), er spesielle tiltak som er optimale for OPC isolasjon beskrevet.
- Fremstille den første dissosiasjon enzymet ved å fortynne enzymet P med den passende buffer. Innholdet i hver 50 ml konisk (en prøve) vil bli resuspendert med en total på 1,950 pl av enzymblandingen. Sted i enzymblandingen i et 37 ° C bad i 10 min.
1 Eksempel: 1.900 mL buffer + 50 ul papain enzym - Spin alle 50 ml koniske rør som inneholder 3-4 terninger rotteunge cortices ved 300 xg i 3 min.
- Aspirer supernatanten og tilsett 1,950 mL av enzymløsning til hvert prøverør og bryte fra hverandre pelleten ved å snu røret og forsiktig risting.
- Inkuberes i et 37 ° C vevskultur-inkubator i 15 minutter med kontinuerlig rør rotasjon.
- I løpet av de siste 5 minutter av inkubasjonen forberede den andre enzymblandingen A. fortynne enzymet i dens passende buffer. Totalt 30 ul leggestil hver 50 ml konisk prøverør.
1 Prøve: 20 pl buffer + 10 ul av enzym - Når inkubering er fullført legge til 30 pl av den andre enzymblandingen til hvert rør og invertere for å blande.
- Ved hjelp av en glass Pasteur pipette er festet til en pipette kontroller, mekanisk dissosiere vevet ved å pipettere 10-15 ganger eller til vevet stykkene er redusert i størrelse, og løsningen er blitt uklar. Returnere prøven til 37 ° C vevskultur-inkubator i 15 minutter med kontinuerlig rotasjon.
- Pipetter hver vevhomogenatet prøve 10-15 ganger med en 1 ml pipette.
- Pipetter hver vevhomogenatet prøve 15-20 ganger ved hjelp av en 200 mL pipette
- Returnere alle prøvene til 37 ° C vevskultur-inkubator i 10 minutter med kontinuerlig rotasjon.
- Tilsett 10 ml PBS (med Ca2 + og Mg2 +) til hver prøve og filtrere homogenatet gjennom en 40 um pore-filter plassert over et 50 ml tube. Skyll filteret med ytterligere 1-2 ml PBS.
- Pool alle Homogenatprøvene i en 50 ml konisk rør og tilegne seg en samlet legemer.
- Etter å ha utført den celletall, dele homogenat jevnt i 15 ml koniske rør (1 tube for hver prøve). Sentrifuge i 10-12 minutter ved 300 x g.
4. Anti-A2B5 Bead Application, Kolonne Rensing og plating
- Utføre beregninger for kolonnebuffer og anti-A2B5 mikroperler. Legg 7 mL søylebuffer for hver 1 x 10 6 celler. Tilsett 2 mL Anti-A2B5 microbeads for hver 1 x 10 6 celler.
- Kombiner alle prøvene ved resuspendering av cellene i et totalt volum på 10 ml kolonnebuffer og sentrifuger ved 300 xg i 10-12 min.
- Resuspender cellepelleten i den passende mengde av kolonnebuffer som beregnet i trinn 4,1. Dersom pelleten er stor og løs, bare legge til omtrent halvparten av volumet av kolonnen buffer for å holde den antilegemet ved den passende konsentrasjon i cellen resuspensjon.
- Inkuber cellesuspensjonen i 10 minutter ved 4 ° C.
- Legg anti-A2B5 mikroperler (beregnet i trinn 4.1), snu flere ganger, og inkuber ved 4 ° C i 30-60 min. Snu forsiktig røret flere ganger hvert 10 min. Lengre inkuberingstider kan øke celleutbytte, men kan øke ikke-spesifikk binding.
- Tilsett 5 volumer av kolonnebuffer. Dersom cellene blir resuspendert i et volum på 1 ml, tilsett 5 ml kolonnebuffer, mens hvis cellene resuspenderes i 2 ml, tilsett 10 ml kolonnebuffer.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g.
- Bestem hvor mange LS kolonner vil være behov for rensing. En LS kolonne er tilstrekkelig for 15-20 x 10 6 totale celler.
- Cellepelleten suspenderes i 1000 ul kolonnebuffer pr LS kolonne som brukes.
- Prime hver LS kolonne ved å tilsette 5 ml kolonnebuffer. Samle strømning gjennom i et 50 ml konisk rør. Når kolonne buffer fullstendig har passert gjennom det øvre kammer, gjelder 1.000 ul av cellesuspensjon til hver kolonne og tillate cellene å kjøre gjennom innvirkning av tyngdekraften.
Merk: Hvis tettheten av celler som er for høy, kan kolonnen kjøre sakte. - Umiddelbart etter at cellesuspensjonen har passert gjennom kolonnen, langsomt tilsett 3 ml kolonnebuffer for hver kolonne for å vaske de ikke-bundne cellene. Hvis vaske lett løper gjennom kolonnen (1 dråpe for hver 30-45 sek), vaskes ytterligere to ganger med 3 ml kolonnebuffer.
- Fjern hver kolonne og plassere den på en 15 ml konisk tube. Tilsett 5 ml kolonnebuffer og styrter bufferen gjennom kolonnen ved en hurtig hastighet ved hjelp av plast stempelet som er pakket med kolonnen. Nedsenking vil løsne de bundne cellene frigjør dem fra kolonnen.
- Øke renhet ved å kjøre prøven gjennom en andre runde med LS kolonner. Bruke en tredjedel av antall kolonner som brukes under den første passering. Prime kolonnene med 5 ml kolonne buffer.Tillat-kolonnen buffer til å passere gjennom det øvre kammeret.
- Siden volumet av cellesuspensjonen vil være mye større, jevnt anvende 1.000 ul cellesuspensjon til hver kolonne og tillate suspensjonen å passere gjennom det øvre kammer av kolonnen før etterfylling av ytterligere 1000 ul.
- Når cellesuspensjonen er fullstendig påført på den andre runden av søyler, vasker 2-3 ganger med 3 ml kolonnebuffer.
- Fjern hver kolonne og legg den over en steril 15 ml konisk tube. Tilsett 5 ml kolonnebuffer og styrter bufferen ved hjelp av plast stempelet som er pakket med kolonnen. Nedsenking vil løsne de bundne cellene frigjør dem fra kolonnen.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 xg i 12-15 min. Pelleten skal vises kompakt.
- Cellepelleten suspenderes i 5-10 ml forvarmet OPC spredning media (OPC basismedium supplert med PDGF-AA 20 ng / ml).
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Plate cellene. Fortynn cellene til 60.000 celler / ml med OPC spredning medier. I hver sort, klar bunn 24 brønn, pipettes 500 ul av celler langs den side av brønnen for å oppnå 30.000 celler per brønn. Bland cellene ved å riste platen horisontalt ved hjelp av et åttetall bevegelse. Hvis du utfører analysen i 48, 96, eller 384-brønns plater, legge til 15000, 7500, eller 1500 celler per brønn, henholdsvis. Disse tallene kan bli justert avhengig av individuelle plate spesifikasjoner.
- Utarbeide en egen plate for dagen 0 baseline kontrollkulturer. Denne kontrollen plate skal festes med 4% paraformaldehyde som beskrevet i kapittel 5.7, når differensiering er initiert på dag 0.
- Kultur cellene i OPC spredning media ved 37 ° C i 3 dager uten media endring.
5. Induksjon av OPC Differensiering og Festes med 4% Paraformaldehyde
Merk: Når du skal teste effekten av små molekyler på oligodendrogenesis, vi rutinemessig dissolve legemidler i dimetylsulfoksid (DMSO) for å fremstille 1,000x aksjer som kan deretter lagres ved -80 ° C og fortynnet direkte inn SATO media for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,1% DMSO. Vi har observert noen endringer i noen av OPC proliferasjon eller differensiering ved hjelp av denne konsentrasjon av DMSO (data ikke vist).
- Forvarm OPC basen media til 37 ° C og tine behandlings aksjer til romtemperatur. Når du utfører behandlinger i to eksemplarer, forberede omtrent 1,25 ml medium per behandlingsgruppe i en 1,5 ml tube. For triplikatprøvene, bruke 2 ml kapasitet sentrifugerør å redegjøre for slakk.
- Forbered behandlings Master Mix for replikere brønnene ved å fortynne behandlings aksjer direkte i OPC basen medier. I korthet vortex eller forsiktig blande hver Mastermix for å sikre en homogen fordeling av behandlingen.
- Fremstille 45 nM trijodtyronin (T3) som den positive kontroll og den passende kjøretøy som den negative kontroll. Fortynn 10 mm T 3 lager1: 1000 i 1 ml av OPC-basismateriale, og deretter ytterligere fortynnet i behandlings konsentrat-blanding for å redusere sluttkonsentrasjonen av DMSO om nødvendig.
- Aspirer media fra kulturbrønnene en behandlingsgruppe om gangen for å unngå uttørking cellene. Bruk en 200 ul pipette spiss på enden av det glass Pasteur pipette for å unngå skraping av svart materiale fra sidene av brønnen og inn i kulturen.
- Tilsett langsomt 500 mL av behandling Mastermix langs den side av brønnen ved anvendelse av en 1 ml-pipette.
- Inkuber kulturene for den ønskede tidsperioden, å utføre en fullstendig medieutveksling med frisk behandlingsmedier hver 2-3 dager. Vi rutinemessig observerer en 30-40% MBP + kultur etter 4 dager i differensiering media.
- Ved slutten av den ønskede behandlingsperioden, fremstille frisk 4% paraformaldehyd (PFA) eller tine et frosset lager til romtemperatur. FORSIKTIG: PFA er ekstremt giftig og må være forberedt på en avtrekkshette.
- Aspirer media og sakte legge 4001; l av PFA til siden av brønnen for å fiksere cellene. Platen inkuberes i 20 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer PFA og tilsett langsomt 500 mikroliter sterilt D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) til siden av brønnen for å vaske cellene. Gjenta vaske totalt to ganger. Ikke aspirer siste vask.
- Pakk platen i Parafilm og oppbevares ved 4 ° C for senere behandling eller gå direkte til neste trinn. Platene kan lagres i flere uker.
6. Immunocytochemistry og Kvantifisering av myelinbasisprotein
Merk: Når du utfører væskehåndteringsprosedyrer i 24 brønners plater, anbefales det å arbeide raskt for å unngå uttørking cellene. Her er anvendelse av en flerkanals vakuum aspirator og flerkanals pipette anbefalt.
- Bringe platen til romtemperatur, aspireres brønnene, og tilsett 250 ul av D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) inneholdende 0,1% Triton X-100 og 5%normalt geiteserum (NGS). Platen inkuberes ved romtemperatur i 1 time med forsiktig risting orbital.
- Fremstille den primære inkubering løsningen ved fortynning av muse-monoklonalt anti-MBP-antistoff 1: 1000 og kanin polyklonalt anti-Actin-antistoff 1: 200 i D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) inneholdende 5% NGS. Alternativt kanin polyklonalt anti-Olig2 ved 1: 1000 kan brukes til oligodendrocytt spesifikk normalisering i blandede glial kulturer. Forbered nok primære løsning for å imøtekomme 250 mL per brønn.
- Inkuber primære antistoffer ved 4 ° C over natten for 16-18 timer med forsiktig risting orbital.
- Aspirer primære inkubering løsning og vaske cellene 3 x 10 min med 500 ul av D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) ved romtemperatur med forsiktig risting orbital.
- Mens vasking av platen, fremstille sekundære inkubering løsningen ved fortynning av anti-mus-680 og anti-kanin-antistoffer 800 1: 500 i D-PBS (med Ca 2+ Mg2 +) inneholdende 5% NGS. Minimer ambient lys eksponering ved utarbeidelse av denne løsningen.
- Aspirer siste vask og tilsett 250 mL av sekundær inkubasjon løsning. Beskytte platen mot lys og inkuber ved romtemperatur i 1 time med forsiktig risting orbital.
- Aspirer sekundære inkubering løsning og vaske brønnene 3 x 10 min med 500 ul av D-PBS (med Ca2 + og Mg2 +) ved romtemperatur med forsiktig risting orbital.
- Skanne platen ved hjelp av et bildedanningssystem istand til å påvise 700 nm og 800 nm fluorescensemisjoner. Som et utgangspunkt, setter fokus utlignet til 3 og sensitiviteter til 1,5 for MBP, 5,0 for Actin, og 3.5 for Olig2. Juster følsomhetsverdier som er nødvendig for å unngå signalovereksponering.
- Kvantifisere omfanget av oligodendrogenesis å bruke semi-automatisert programvare-baserte metoder.
- Ved hjelp av programvaren, sett platen analyse modus til "24 Well" og justere sirkler rundt tHan ytre perimeter av de skannede brønner. Sett normalisering kanalen til "800" og eksportere den totale og relative fluorescensstyrkene for 700 nm (MBP) og 800 nm (Olig2 / Actin) kanaler.
- Dividere intensiteten ved 700 nm av intensiteten ved 800 nm for å gi den normaliserte MBP-ekspresjon i relative fluorescensenheter. Beregn gjennomsnittet av replikatmålinger og skalere uttrykket til Dag 0 + PDGF kontroller som er nødvendig for analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2B5-positive OPCS isoleres gjennom positiv celle ved bruk av en magnetisk kolonne separasjonssystem. Før isoleringsprosedyren, blir hele hjernen fjernes fra rotteunger som er mellom P5 og P7. Når hele hjernen er vellykket løsrevet fra skallen, er det olfaktoriske knoller og cerebellum fjernet ved anvendelse av fin kirurgisk tang (figur 1A). For å isolere cerebral kortikale vev hypothalamus, thalamus og midthjernen er utskåret ved forsiktig disseksjon (figur 1B). Deretter blir hippocampus og striatum fjernes ved hjelp av bøyde kirurgisk tang (figur 1C - D). Isolasjon prosessen eliminerer effektivt meningeale og fibroblast celler, men enzymatisk fordøyelse er forbedret når hjernehinnene og blodkar fjernes (figur 1E). Endelig er vevsblokker av 1 mm x 1 mm fremstilt for de etterfølgende vev dissosiasjon trinn (Figure 1F).
En god OPC isolasjon bør resultere i en kompakt celle-pelleten etter sentrifugering trinn (figur 2A). Når belagt disse kulturene vil være forholdsvis fri for cellulært avfall når sett under et mikroskop (figur 2B). En suboptimal isolasjon kan resultere i en stor og luftig pellet på grunn av tilstedeværelsen av store mengder celle-debris. Dette støvet fester seg sterkt til PLL-belagte beholder og kan interferere med kultur (figur 2C). Hvis en stor og luftig pellet materialiserer, kan det hjelpe å resuspender cellene i 10 ml PBS og gjenta sentrifugering i 10 min ved <300 x g. Når isolasjon er fullført, kan renheten av kulturer vurderes ved flow-cytometri for å identifisere hvor mange prosent av A2B5-positive celler. En vellykket isolasjon bør resultere i en pool av celler som er> 95% positive for A2B5 (figur 2D - F). Sammenlignet med celler farget med et fluorescerende fargestoff-konjugert anti-A2B5-antistoff, bør ufargede celler vist som en negativ populasjon, og kan brukes som en basis for referanse gating. Videre har vi tidligere vist at valg av OPCs bruker A2B5 antigen utbytter kulturer som flekker positivt for PDGFRα av immunocytochemistry 11.
Som demonstrert ved immunocytokjemi, OPCs ved behandlingsstart (dag 0) er Olig2 + / MBP - mens cellene er Olig2 + / MBP + av Dag 4 (figur 3). Den optimale sammenflytning av OPCS og oligodendrocytter på dag 0 og dag 4 er vist i representative lyse felt bilder (Figur 4A). Fraværet av MBP uttrykk ved dag 0 fungerer som en basis for kvantifisering oligodendrogenesis. Spontan differensiering som et resultat av PDGF-AA uttak tjener som en negativ kontroll, mens 45 nM thyroid hormon (triiodothyronine; T3) kan benyttes som en positiv kontroll 11,15. Quetiapin, også kjent som quetiapin, og klemastin, også kjent som Tavist er FDA-godkjente medikamenter som har vist seg å akselerere in vitro oligodendrogenesis og kan anvendes som ytterligere positive kontroller 16,17. Figur 4B viser en representativ to-kanals infrarød fluoriserende scan viser de forventede resultater for hver av disse forhold i tre eksemplarer. Aktin og MBP signaler ble pseudocolored grønn og rød henholdsvis slik at svært differensierte kulturer vises gul i fusjonerte bilder. Resultatene viser at MBP uttrykk på dag 4 i PDGF tilbaketrekking tilstanden var 4,5 ± 1,4 ganger høyere sammenlignet med dag 0, mens fold endringer i MBP på grunn av behandling med skjoldbruskkjertel hormon, quetiapin, og clemastin var 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 og 32,8 ± 0,5 henholdsvis (figur 4C). Robustheten og nøyaktigheten av analysen blir demonstrert av smalle standardavvik blant triplikatprøvene og den store behandling aktivering vindu som er ca 20 standardavvik over PDGF tilbaketrekking kontroll.
Mens Actin tjener som et pålitelig referanse gen for normalisering i oligodendrocytt kulturer, kan alternative referansegener også anvendes. Olig2 er en atomtranskripsjonsfaktor som blir konstitutivt uttrykt i celler i det oligodendrocytt avstamning. Sin spesielle og konstitutiv ekspresjon mønster kan således tilveiebringe en mer foretrukket normalisering strategi i heterogene kultur situasjoner. Figur 5 viser at i OPC kulturer differensiert med 10 nM thyroid hormon, den beregnede ganger endring i MBP uttrykk i forhold til PDGF uttak er den samme ved bruk av enten Olig2 eller Actin for normalisering. Antagelig, siden OPC kulturer i dette forsøk var svært ren, begge proteiner kan anvendes på en pålitelig måte for normalisering. Men vi Often observere en liten bestand av Olig2-negative celler ved dag 4, men forholdet mellom denne populasjonen til Olig2-positive befolkningen ser ikke ut til signifikant forskjellig mellom PDGF tilbaketrekning og T3 behandlede gruppen. Dermed blir fold-endringene påvirkes ikke. Gitt et scenario der en behandling kan føre til spredning av Olig2-negative celletyper, bør valget av normalisering antistoff vurderes nøye.
Figur 1:.. Rat hjernen disseksjon prosedyren Trinnvis beskrivelse av disseksjon prosedyren Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Strømningscytometri-analyse av isolerteOPCS. (A) etter magnetisk kolonnerensing, blir det bundne cellepopulasjon kastet ut av kolonnen og sentrifugert for å danne en kompakt pellet. Mengden av avfall er angitt ved størrelsen av pelleten. (B) Dersom pelleten er kompakt, da rusk vil være minimal i kulturen. (C) En stor og luftig pellet vanligvis resulterer i en kultur med tung rusk. Renheten av kulturen blir bestemt ved strømningscytometri ved bruk av et rotte-anti-mus-antistoff A2B5 som er konjugert til APC. (D) Døde celler og rusk er ekskludert fra analysen som vist i termin scatter og sidespredningsplott. (E) Den A2B5 positive befolkningen kan bestemmes ved hjelp av en unstained samplet som en baseline referanse for gating. (F) Vellykket isolert OPCs bør være> 95% positive for A2B5. Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.
Figur 3:. OPC kultur og differensiering prosedyre Den dual-infrarød fluorescens-skanning (DIFS) analyse begynner med fersk isolatedA2B5-positive rotte OPCs belagt på PLL-belagte kulturskip (dag 3). Disse kulturene blir proliferert i 3 dager i nærvær av 20 ng / ml PDGF-AA, og deretter behandlet med forsøksfaktorene i frisk PDGF-fritt medium på dag 0. Behandlingen media er fullt opp igjen på dag 2, og cellene fiksert med 4% paraformaldehyde på dag 4. Immunocytochemistry for Olig2 (grønn) og MBP (rød) ble utført på representative kulturer ved dag 0 og dag 4 bruker Dapi (blå) som en kjernefysisk teller flekken. Disse kulturene stille konstituerende farging for pan oligodendrocyte avstamning cellemarkør Olig2 på dag 0 og 4, mens farging for den modne oligodendrocyte markør MBP er bare evident av Dag 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: MBP kvantifisering ved hjelp av dobbel-infrarøde fluorescens-skanning (DIFS) assay (A) Tettheten av OPC-kulturer ved dag 0 og dag 4 som kreves for optimal ytelse assay.. (B) Representative dual-infrarøde fluorescens skanner. OPCS ble differensiert i 24 brønners plater i 4 dager i nærvær av 45 nM T3, 1 uM quetiapin, 1 uM klemastin, eller 0,1% DMSO i tre eksemplarer. En separat plate som inneholder OPCS som ble fiksert på dag 0 (+ PDGF) ble behandlet parallelt. Actin (pseudocolored grønn) og MBP (pseudocolored rød) ble samtidig kvantifisert ved hjelp av en Licor Odyssey skanner satt til å oppdage 700 nm og 800 nm utslipp. (
Figur 5: Olig2 er et pålitelig referanseprotein for å normalisere MBP ekspresjon i oligodendrocytter OPCS ble differensiert i triplikat i nærvær av 10 nM T3 eller 0,1% DMSO bærerkontroll i 24 brønners plater i 4 dager.. Dual-infrarøde fluorescens-scanning-analyse ble utført ved anvendelse av anti-Olig2 eller anti-Actin primære antistoffer for normalisering. Olig2 / Actin og MBP ble samtidig kvantifisert ved hjelp av en Licor Odyssey skanner satt til å oppdage 700 nm og 800 nm utslipp. MBP uttrykk var ingenrmalized til enten Olig2 eller Actin uttrykk, og resultatene ble gradert til det 0,1% DMSO-kontroll. De gjennomsnittlige relative fluorescensenheter ± SD ble plottet ved bruk av GraphPad Prism 6. Resultatene viser at den beregnede fold-endring er det samme når normalisering til en av de to referanse proteiner.
Figur 6:. Effekt av Triton X-100 på MBP farging OPCS ble differensiert i 24 brønners plater i 4 dager i nærvær av 45 nM T3 og 0,1% DMSO. Kulturer ble deretter fiksert med 4% PFA og farget for Olig2 og MBP bruker to forskjellige immunocytochemistry protokoller. For høy Triton X-100 prøven, ble cellene permeabilisert i 1 time med 0,4% Triton X -100 og alle antistoff inkuberingsbetingelser trinn ble utført i nærvær av 0,1% Triton X-100. For lav Triton X-100 prøven, ble cellene permeabilisert i 1 time med 0,1% Triton X-100, mens Antibody inkuberinger ble utført uten Triton X-100. Olig2 og MBP ble visualisert med fluorescerende fargestoff-konjugert second og bildene ble anskaffet ved hjelp av en kamerabasert fluorescens mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en rask og pålitelig metode for isolering av rotte OPCS og kvantifisering av in vitro oligodendrogenesis som svar på eksperimentelle faktorer. Ved hjelp av positiv utvelgelse, er høy avkastning av levedyktige og rene OPCs brukes direkte for eksperimentelle formål. Denne fremgangsmåte strømlinjeisolasjons, dyrkning, og differensieringstrinn inn i en uke en tidsramme, og fikserte celler kan hensiktsmessig lagret ved 4 ° C i flere uker uten noe tap i analysesensitivitet.
En stor fordel med skannerbasert fluorescensanalyser er at datainnsamling og analyse er sterkt fremskyndet versus tradisjonell kamerabaserte mikroskopi teknikker. Selv om mikroskopi har vært brukt med hell i high-throughput skjermer for å identifisere indusere av OPC differensiering, er datainnsamling iboende tregere fordi det krever programmering av bildefotografering sekvenser, flere timer med datainnsamling, analyse av hundrevis til thousands av bildefiler, og brukerdefinerte algoritmer for å skille de enkelte celle organer for normalisering eller analyse 18,19. Videre, med kamerabaserte mikroskopi systemer er det ikke mulig å samle inn data fra hele overflaten av kulturen fartøyet. I stedet må representative bilder bli tatt fra ulike områder innenfor en enkelt brønn, som kan føre til posisjons skjevhet og falske positive treff. Til sammenligning påviser denne analysen MBP ekspresjon fra alle celler i en gitt brønn, og flere plater kan skannes samtidig. Selv om denne fremgangsmåten kan tilpasses for bruk i 96-brønners eller 384-brønners format, kan de 24-brønners plate være foretrukket når færre behandlinger blir testet. Vi har observert at celletap i 24-brønn plate på grunn av væskehåndtering blir minimalisert, noe som er en komplikasjon som bør tas i betraktning ved utforming av høyere gjennomstrømming eksperimenter.
En kritisk parameter av analysen er tettheten av cellene når differensiertasjon er initiert på dag 0. kulturer med for få celler synes å differensiere mer langsomt og dø ut, mens høy tetthet kulturer vise spontan differensiering. Begge situasjoner kan redusere det dynamiske området, og påliteligheten av analysen. For å oppnå en optimal balanse mellom celle helse og celletetthet, vi kultur de OPCs for 3 dager uten media utveksling eller tilskudd av fersk PDGF-AA. Vi antok at ettersom konsentrasjonen av PDGF-AA i medie avtar etter dag 3 in vitro (dag 0) som et resultat av celle katabolisme, vil den proliferative hastighet av cellene bremse slik at spredning reduseres ved den første dag av PDGF- AA trekning. Denne teknikken fungerer best når cellene blir jevnt fordelt i løpet av plettering. Pipettering cellene langs den side av brønnen og blande dem ved hjelp av et åttetall bevegelse skal fremme en jevn fordeling. Pipettering inn i sentrum av brønnen har en tendens til å produsere klynger av cellene rundt kantene av brønnen med noenere celler fester seg til sentrum. Dette fenomenet kan være på grunn av avbrudd av den nylig tørkede PLL lag av flytende pipettering krefter. Akkumulering av celler rundt omkretsen kan redusere analysefølsomheten på grunn av tetthetsavhengig differensiering. Det er viktig å merke seg at betydelige forskjeller i intensiteten av det Actin / Olig2 signal kan forekomme mellom medikament-behandlede og kontroll, PDGF abstinens kulturer. Betydelig redusert Actin / Olig2 signal kan tyde på legemiddeltoksisitet, mens betydelig økt Actin / Olig2 signal kan tyde legemiddelindusert spredning. Vi normalt observere en noe høyere Actin / Olig2 signal fra celler behandlet med pro-medikamenter differensiering sammenlignet med PDGF uttaks kontrollene. Vi tilskriver denne forskjellen til en høyere rate av spontan apoptose i PDGF tilbaketrekking gruppen over 4 dagers differensiering prosedyre. Ved vurdering oligodendrogenesis, normalisering av MBP til Actin / Olig2 bør korrigere for celle nummer forskjeller. For å vurdere toxiby og spredning ved hjelp av denne analyse, kan den anti-MBP-antistoff byttes ut med primære antistoffer rettet mot de riktige markører.
Når eksperimentene krever både kvantitativ og kvalitativ vurdering, er det viktig å begrense eksponeringen av de faste rotte oligodendrocytt kulturer til Triton X-100 ved bruk av 4% PFA for å fiksere cellene. Andre immunocytokjemi protokoller for oligodendrocytt kulturer, som typisk omfatter Triton X-100 i løpet av begge de antistoff inkubasjons fremgangsmåten for å forbedre antistoff epitop tilgjengelighet, kan anvendes med hell, avhengig av eksperimentelle krav. På den annen side, selv om MBP er et intracellulært protein som det kan være mulig å utelukke Triton X-100 helt hvis alternative festemetoder anvendes som i tilstrekkelig grad permeabilisere cellene. Ved anvendelse av betingelsene som er beskrevet her, har vi observert at Triton X-100 påvirker den observerte morfologi av oligodendrocytter, så vel som lokalisering av MBP fargingnår det anvendes i høye konsentrasjoner. Vi kan ikke se en betydelig nedgang i antistoff farging når Triton X-100 er utelatt fra antistoff ruge trinn. Som vist i figur 6, inkludert 0,4% Triton X-100 i permeabiliseringen og blokkeringstrinn, og 0,1% Triton X-100 i løpet av antistoff inkubering reduserer påvisning av myelin-prosesser og resulterer i diskontinuerlig MBP farging. Derfor, for kvantitativ og kvalitativ vurdering kan det være tilstrekkelig å anvende en lavere konsentrasjon av Triton X-100, som beskrevet her.
Mens bruken av A2B5-valgt OPCS fra rotter kan være fordelaktig, har vi observert sammenlignbare resultater i dobbelt-infrarøde fluorescens-skanning (DIFS) assay ved bruk av A2B5-valgt OPCS fra C57BL / 6-mus, selv om celleutbytte per mus er vanligvis mye lavere (data ikke vist). Andre protokoller for OPC-rensing kan også være kompatible med denne analysen. For eksempel kan oligodendrocytt markør O4 bli brukt som et antigen for å rense intermediate scenen oligodendrocyte forløpere ved hjelp av magnetiske kuler 20. Som et alternativ til magnetbaserte metoder, kan OPCs bli beriket fra 9 dager gamle blandings gliaceller kulturer inneholder astrocytter og microglia av hi-speed orbital risting og differensial vedheft metoder 21. Videre immuno-panning fremgangsmåter som innlemmer både negativ og positiv celleseleksjon kan brukes hvis kulturen renhet er foretrukket fremfor høyt celleutbytte 22. I tillegg til å undersøke hvordan terapi kan direkte øke differensiering av OPCs i rene kulturer, er det noen ganger nødvendig å vurdere de indirekte virkningene av narkotika gjennom andre celletyper i en co-kultur system. Ved MS blir infiltrasjon av autoreaktive T-celler til effektor CNS antatt å spille en rolle i sykdomsprogresjon 23. T-celler kan utsondre proinflammatoriske faktorer som kan hemme differensiering av OPCs på områder av demyelinisering. Det er derfor av interesse å identifisere Therapeutics som kan beskytte de OPCs og blokkere disse proinflammatoriske faktorer fra forverre skaden. Den DIFS Analysen kan være ideell for å modellere denne aktiviteten som T-celler som vokser i suspensjon, og kan vaskes bort fra den oligodendrocytt kulturen før MBP kvantifisering. For co-kultur studier med heftende celler som nevroner, astrocytter og microglia, kan Olig2 normalisering brukes til å samle inn data fra oligodendrocytes spesielt. Således kan fleksibiliteten av DIFS assay lette en rekke eksperimentelle design.
Som konklusjon, gir denne protokollen en rask og pålitelig metode for å kvantifisere oligodendrogenesis av A2B5-positive rotte OPCs in vitro. Denne isolasjonen metoden leverer konsekvent høy avkastning av levedyktige OPCs som er lydhør overfor etablerte differensierings signaler. Sensitiv analyse kan utføres i multi-brønn format fartøy ved hjelp av en rekke eksperimentelle paradigmer som utvider nytten av dette systemet til many forskjellige applikasjoner. Videre kan DIFS analysen være tilpasset for high-throughput screening medikament, eller kan anvendes til å bekrefte resultatene av lav-throughput-analyser som kvantitativ PCR og Western blot. Viktigere, kan dette systemet tilby et enkelt, men effektivt middel for identifikasjon av OPC målrettet terapi i demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Gi sponsor: National Institutes of Health; Grant Nummer: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
