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Developmental Biology

चूहा Oligodendrocyte पूर्वज संस्कृति की तैयारी और Oligodendrogenesis की मात्रा दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग का उपयोग

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53764
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में कुशल तंत्रिका चालन oligodendrocytes द्वारा axons की myelination की आवश्यकता है। विकास के दौरान, oligodendrocytes oligodendrocyte पूर्वज कोशिकाओं (OPCs) है कि विकासशील अग्रमस्तिष्क और न्यूरल ट्यूब 1 की वेंट्रिकुलर क्षेत्रों से पलायन करने के लिए लगा रहे हैं का एक पूल से उत्पन्न होती हैं। बाद पलायन OPCs परिपक्व, myelinating oligodendrocytes में अंतर यह है कि न केवल कुशल आवेग प्रचार की सुविधा है, लेकिन यह भी पौष्टिकता समर्थन 2 के साथ एक्सोन प्रदान करते हैं। वयस्क सीएनएस OPCs कि सभी कोशिकाओं 3 में से लगभग 5-8% शामिल ग्रे और सफेद पदार्थ भर में बिखरे हैं की एक प्रचुर मात्रा में आबादी बनाए रखता है। एक demyelinating अपमान के बाद, OPCs, चोट के स्थल की ओर पलायन पैदा करना, और उजागर एक्सोन पर खो दिया है या क्षतिग्रस्त मेलिन शीथ को बदलने के लिए अलग। हालांकि, कुछ रोग / चोट सेटिंग्स में, इस प्रक्रिया को अक्षम हो पाया है या पूरी तरह से 4 विफल कर सकते हैं। जबकिपुरानी माइलिन रहित रोग, कुशल oligodendrogenesis और remyelination के बोझ को जोड़ने के लिए 5 लक्षणों को कम कर सकते सोचा है। यह इसलिए इन विट्रो में OPCs अध्ययन करने के लिए oligodendrogenesis पर प्रयोगात्मक कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए ब्याज की गई है।

oligodendrocyte भेदभाव के विभिन्न चरणों में इनसाइट चरण विशेष सेल मार्कर की पहचान के द्वारा ही संभव बनाया गया है। स्वयं renewing जल्दी पूर्वज कोशिकाओं प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर अल्फा की उनकी अभिव्यक्ति (PDGFRα) द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, तंत्रिका / glia एंटीजन 2 (NG2) और A2B5 6 - 8। OPCs उनके भेदभाव कार्यक्रम शुरू करने और सेल चक्र से वापस लेने के रूप में, वे इन मार्करों की अभिव्यक्ति downregulate और चक्रीय न्यूक्लियोटाइड 3'-phosphodiesterase (CNPase) और O4 सहित oligodendrocytes premyelinating का संकेत प्रोटीन व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं। अंत में, और अधिक परिपक्व oligodendroc में उनके भेदभावytes माइलिन जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन (पत्रिका), proteolipid प्रोटीन (पीएलपी), और माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP) सहित माइलिन जुड़े प्रोटीन की अभिव्यक्ति की विशेषता है। MBP एक intracellular परिधीय झिल्ली प्रोटीन और माइलिन आवरण का एक प्रमुख घटक है। MBP कमी चूहे एक गंभीर लक्षण प्रारूप है जिसमें सीएनएस myelination काफी झटके, आक्षेप और जल्दी मौत 9,10 करने के लिए अग्रणी विकसित की कमी हुई। Myelination में MBP के इस महत्वपूर्ण भूमिका दोनों इन विट्रो और इन विवो 11 में oligodendrocyte भेदभाव के एक मार्कर के रूप में इसके उपयोग के लिए प्रेरित किया है।

MBP की मात्रा कई अलग अलग तरीकों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। आरटी पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण अलग उपचार परहेजों के तहत MBP स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देते हैं। Immunocytochemistry एक आम गुणात्मक दृष्टिकोण भी है कि मात्रात्मक जब कैमरा आधारित माइक्रोस्कोपी तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है हो सकता है। हालांकि इन प्रणालियों विश्वसनीय और के लिए मौलिक हैंoligodendrocyte भेदभाव के अध्ययन के लिए, वे एक अपने ही नुकसान है कि दवा स्क्रीनिंग में उनके उपयोग को सीमित कर दिया है। सबसे पहले, प्राथमिक OPCs की राशि है कि आरटी पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं चर है कि एक साथ जांच की जा सकती की संख्या कम कर देता है। जबकि immunocytochemistry के लिए सेल की आवश्यकता बहुत कम है, पर्याप्त समय एक प्रयोग के लिए समर्पित किया जाना चाहिए अगर मात्रा का ठहराव लक्ष्य है। कई छवियों पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए और उसके बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण की सुविधा के लिए मात्रा। इन निरंतर महत्वपूर्ण बाधाओं अध्ययन है कि उच्च throughput मूल्यांकन की आवश्यकता के लिए विचार करने के लिए हो गया है। यहाँ हम एक तरीका है कि दोनों immunocytochemistry और माइलिन मात्रा का ठहराव के लिए पश्चिमी धब्बा तरीके से बुनियादी पहलुओं का इस्तेमाल का वर्णन करते हुए काफी दोनों आवश्यक कोशिकाओं की संख्या और मात्रात्मक विश्लेषण पूरा करने के लिए समय को कम करने।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और मेडिसिन के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. परख प्लेटें, स्टॉक समाधान, और ओपीसी आधार मीडिया की तैयारी

नोट: चूहे ओपीसी आधार (सातो) मीडिया यहाँ वर्णित पहले से प्रकाशित अध्ययन 12,13 से प्राप्त किया गया है। वैकल्पिक मीडिया योगों भी इस प्रक्रिया के साथ संगत हो सकता है।

  1. Resuspend पाली एल लाइसिन (पीएलएल) बाँझ विआयनीकृत पानी में 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए। पिपेट एक काले रंग की दीवारों, स्पष्ट नीचे 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर ग्रेड पकवान के प्रत्येक कुएं में पतला पीएलएल के 400 μl।
  2. एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में या रात एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में 2 घंटे के लिए कोट टिशू कल्चर व्यंजन।
  3. लेपित बर्तन में कम से कम 20 मिनट के लिए पहले से चढ़ाना महाप्राण पीएलएल। एक टिशू कल्चर में ढक्कन के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें रखने आंशिक रूप से अधखुला द्वारा शेष पीएलएल अच्छी तरह से सूखे की अनुमति देंहुड। सत्यापित करें कि कुओं पृथक OPCs चढ़ाना पहले पूरी तरह से सूख रहे हैं। प्रकोष्ठों प्लास्टिक है कि तरल पीएलएल वर्तमान का पालन नहीं करेंगे।
  4. एन -Acetyl-एल सिस्टीन (एनएसी) शेयर समाधान (1,000x) तैयार: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 20 मिलीलीटर में 100 मिलीग्राम एन -Acetyl-एल सिस्टीन (एनएसी) भंग। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. Hydrocortisone शेयर समाधान (1,000x) तैयार: 1 मिलीग्राम Hydrocortisone और भंग करने के लिए चक्कर आने के लिए इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें। , DMEM के 19 मिलीलीटर जोड़ें -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान, विभाज्य और दुकान मिश्रण। मीडिया के लिए आधार hydrocortisone के अलावा glial कोशिकाओं 14 के अस्तित्व को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है।
  6. डी बायोटिन शेयर समाधान (5,000x) तैयार: पीबीएस के 50 मिलीलीटर में डी बायोटिन की 2.5 मिलीग्राम भंग। विघटन में सहायता करने के लिए 0.1 एन NaOH के 1-2 एक्स 5 μl बूँदें जोड़ें। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  7. इंसुलिन शेयर समाधान (100x) तैयार: टिशू कल्चर ग्रेड पानी की 50 मिलीलीटर में 25 मिलीग्राम इंसुलिन भंग। 250 μl हे जोड़ेंएफ 1 एन एचसीएल और मिश्रण जब तक समाधान स्पष्ट है। एक 0.22 माइक्रोन तक 6 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर और दुकान के साथ बाँझ।
  8. सातो शेयर समाधान (100x) तैयार करें:
    1. प्रोजेस्टेरोन शेयर समाधान (25 माइक्रोग्राम / μl) तैयार: इथेनॉल के 100 μl में 2.5 मिलीग्राम प्रोजेस्टेरोन भंग।
    2. सोडियम Selenite शेयर समाधान (400 एनजी / μl) तैयार: 0.1 एन NaOH के 100 μl में 4 मिलीग्राम सोडियम Selenite भंग। DMEM के 10 मिलीलीटर और मिश्रण जोड़ें।
    3. DMEM के 100 मिलीलीटर के लिए, मानव APO-Transferrin की 1 ग्राम, गोजातीय सीरम albumin की 1 ग्राम, और प्यूटर्साइन के 160 मिलीग्राम जोड़ सकते हैं और पूरी तरह से भंग करने के लिए मिश्रण। प्रोजेस्टेरोन शेयर समाधान के 25 μl, सोडियम Selenite शेयर समाधान के 1,000 μl, और मिश्रण जोड़ें। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  9. , DMEM के 100 मिलीलीटर प्रति (4.5 छ / एल डी ग्लूकोज, एल glutamine, और 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट) के साथ 100 μl एनएसी, 100 μl hydrocortisone, 20 μl डी बायोटिन, 1 मिलीलीटर जोड़ें: ओपीसी बेस मीडिया तैयार इंसुलिन, 1 मिलीलीटर सातो शेयर, 100 μl तत्वों का पता लगाने बी,2 एमएल बी -27 पूरक (50x), और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x) के 1 मिलीलीटर। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के साथ जीवाणुरहित।
  10. PDGF-एए शेयर समाधान (1,000x) तैयार: 250 माइक्रोग्राम प्रति 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पीबीएस के 12.5 मिलीलीटर में 20 माइक्रोग्राम / एमएल समाधान बनाने के लिए भंग। अशेष और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  11. ओपीसी प्रसार मीडिया तैयार: ओपीसी आधार मीडिया 20 एनजी / एमएल PDGF-एए के साथ पूरक।
  12. ओपीसी भेदभाव मीडिया तैयार: 45 एनएम ट्राईआयोडोथायरोनिन के साथ पूरक ओपीसी आधार मीडिया।
  13. तैयार स्तंभ बफर: पीबीएस के 500 मिलीलीटर के लिए बीएसए की 2.5 ग्राम और 2 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड की मिलीलीटर (EDTA) जोड़ सकते हैं और 7.2 पीएच को समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के साथ जीवाणुरहित।

2. चूहा मस्तिष्क विच्छेदन

नोट: पी -5-P7 चूहे पिल्ले इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं। प्रत्येक चूहे पिल्ला कोर्टेक्स लगभग 1.5-2.0 x 10 6 A2B5 सकारात्मक कोशिकाओं पैदावार।

  1. एक 250 का उपयोग करते हुए सभी विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित6, सी गर्म मनका अजीवाणु।
  2. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए पीबीएस के (सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना) 15-20 मिलीलीटर जोड़ें। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 3-4 चूहे पिल्ला cortices के लिए पर्याप्त है। बर्फ पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों रखें। विच्छेदन के दौरान diced कोर्टेक्स ऊतक धारण करने के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें।
  3. एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए ठंड पीबीएस जोड़ें। यह पकवान प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. बड़ी शल्य कैंची के साथ कत्ल द्वारा चूहे पिल्ले बलिदान। 70% इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे।
  5. पूरे दिमाग निकालें
    1. का उपयोग कर छोटे कैंची midline नीचे और कान और छील त्वचा फ्लैप पीठ के पीछे त्वचा में कटौती। कपाल नीचे midline brainstem से शुरू करने और आंखों पर समाप्त कट। आदेश अंतर्निहित कोर्टेक्स की संरचना को संरक्षित करने में भी गहराई से कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    2. दो पार्श्व में कटौती रंध्र मैग्नम में छोटी सी शल्य कैंची डालने से सेरिबैलम के लिए अवर बनाओ। आंखों के बीच एक अतिरिक्त कटौती करें, चींटीघ्राण बल्ब को erior।
    3. ध्यान से कपाल के प्रत्येक आधा वापस छील। ठंड पीबीएस के साथ भरा 10 सेमी पेट्री डिश में पूरे मस्तिष्क और जगह निकालें।
  6. विच्छेदन प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, घ्राण बल्ब और ठीक शल्य चिकित्सा संदंश के साथ सेरिबैलम हटा दें।
  7. मस्तिष्क फ्लिप इतना है कि उदर सतह प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई दे रहा है।
  8. का प्रयोग ठीक संदंश सीधे मस्तिष्क के 2/3 के बारे में गहराई तक कोर्टेक्स और हाइपोथेलेमस के बीच बंद संदंश सुझाव दिए रखकर एक कुंद विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं। एक बार संदंश जगह में हैं सिरों को खोलने के लिए अनुमति देते हैं। अन्य गोलार्द्ध के लिए दोहराएँ।
  9. हाइपोथेलेमस और मध्यमस्तिष्क क्षेत्रों से कोर्टेक्स को छेड़ो।
  10. इसके पीछे की सतह पर मध्यमस्तिष्क पकड़ रहा है और मस्तिष्क के पूर्वकाल अंत में यह छीलने से हाइपोथैलेमस, चेतक, और मध्यमस्तिष्क निकालें। पूर्वकाल कनेक्शन तोड़।
  11. यह जावक pealing और उसके बाद से इसका कनेक्शन विच्छेद करके हिप्पोकैम्पस हटायेकोर्टेक्स ठीक मुड़े विच्छेदन संदंश का उपयोग।
  12. एक जावक विकर्ण गति में अंतर्निहित प्रांतस्था से यह समाप्त ठीक मुड़े विच्छेदन संदंश का उपयोग करके शेष स्ट्रिएटम निकालें।
  13. कोर्टेक्स के उदर सतह से किसी भी रक्त वाहिकाओं और तानिका साफ़ करें।
  14. मस्तिष्क फ्लिप इतना है कि पृष्ठीय सतह दिख रहा है। तानिका और रक्त वाहिकाओं को स्पष्ट किया जाना चाहिए। अंतर्निहित प्रांतस्था से पील तानिका ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग। घ्राण बल्ब लगाव स्थान से छीलने की शुरुआत करें।
  15. 3-4 चूहे पिल्ले की कुल के लिए पूरा चरणों 2.4-2.14।
  16. 3-4 विच्छेदित चूहे पिल्ला cortices एक सूखी पेट्री डिश में रखें और एक निष्फल धार के साथ काट जब तक 1 मिमी x 1 मिमी हिस्सा प्राप्त कर रहे हैं। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (चरण 2) फिर बर्फ पर वापस जगह से पीबीएस के साथ पकवान rinsing द्वारा ऊतक लीजिए।

3. एंजाइमी और यांत्रिक ऊतक हदबंदी

नोट: इस कदम के लिए, एक papain आधारित तंत्रिका हदबंदी किट की सिफारिश की है। Ne का प्रयोगयूराल हदबंदी किट (पी), विशेष कदम है कि ओपीसी अलगाव के लिए उपयोगी हैं वर्णित हैं।

  1. उचित बफर के साथ एंजाइम पी गिराए द्वारा पहले हदबंदी एंजाइम तैयार करें। प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार (1 नमूना) की सामग्री एंजाइम मिश्रण के 1,950 μl की कुल के साथ resuspended कर दिया जाएगा। 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस के स्नान में एंजाइम मिश्रण में रखें।
    1 नमूना: बफर के 1,900 μl + 50 papain एंजाइम की μl
  2. सभी 50 मिलीलीटर 3 मिनट के लिए 300 XG पर 3-4 diced चूहा पिल्ला cortices युक्त शंक्वाकार ट्यूबों स्पिन।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और प्रत्येक नमूना ट्यूब एंजाइम समाधान के 1,950 μl जोड़ें और inverting ट्यूब और धीरे झटकों से गोली तोड़ने के अलावा।
  4. निरंतर ट्यूब रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के अंतिम 5 मिनट के दौरान, तैयार दूसरी एंजाइम मिश्रण ए इसकी उचित बफर में एंजाइम पतला। 30 μl के कुल जोड़ दिया जाएगाप्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नमूना ट्यूब के लिए।
    1 नमूना: बफर के 20 μl + 10 एंजाइम की μl
  6. एक बार जब ऊष्मायन पूरा हो गया है प्रत्येक ट्यूब दूसरी एंजाइम मिश्रण के 30 μl जोड़ने और मिश्रण को पलटना।
  7. एक गिलास पाश्चर विंदुक एक पिपेट नियंत्रक से जुड़ी का उपयोग करना, यंत्रवत् 10-15 बार pipetting द्वारा या जब तक ऊतक टुकड़े आकार में कम कर रहे हैं और समाधान बादल बन गया है ऊतक अलग कर देना। निरंतर रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के लिए नमूना लौटें।
  8. 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक ऊतक homogenate नमूना पिपेट 10-15 बार।
  9. एक 200 μl पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक ऊतक homogenate नमूना पिपेट 15-20 गुना
  10. निरंतर रोटेशन के साथ 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर सभी नमूनों लौटें।
  11. एक 40 माइक्रोन ताकना एक 50 मीटर पर रखा फिल्टर के माध्यम से प्रत्येक नमूने के लिए (2 + सीए 2 और मिलीग्राम) के साथ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और homogenate फिल्टरएल ट्यूब। पीबीएस के एक अतिरिक्त 1-2 मिलीलीटर के साथ फिल्टर कुल्ला।
  12. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में homogenate नमूनों की सभी पूल और एक समग्र कोशिका गिनती के अधिग्रहण।
  13. कोशिका गिनती प्रदर्शन के बाद, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में समान रूप से विभाजित homogenate (1 प्रत्येक नमूना के लिए ट्यूब)। 300 x जी 10-12 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।

4. विरोधी A2B5 मनका आवेदन, स्तंभ शुद्धि, और चढ़ाना

  1. स्तंभ बफर और विरोधी A2B5 microbeads के लिए गणना प्रदर्शन। हर 1 x 10 6 कोशिकाओं के लिए 7 μl स्तंभ बफर जोड़ें। हर 1 x 10 6 कोशिकाओं के लिए 2 μl विरोधी A2B5 microbeads जोड़ें।
  2. 10-12 मिनट के लिए 300 XG पर स्तंभ बफर और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा में कोशिकाओं resuspending द्वारा नमूने के सभी जुडा है।
  3. स्तंभ बफर का उचित मात्रा में सेल गोली Resuspend 4.1 चरण में गणना के रूप में। अगर गोली बड़े और ढीला है, केवल स्तंभ बफर की मात्रा का लगभग आधा जोड़ने विरोधी रखने के लिएसेल मेजबान में उचित एकाग्रता में शरीर।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेल निलंबन सेते हैं।
  5. , विरोधी A2B5 microbeads जोड़ें (4.1 चरण में गणना) कई बार पलटना और 30-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। धीरे ट्यूब कई बार हर 10 मिनट पलटना। अब ऊष्मायन बार सेल पैदावार में वृद्धि हो सकती है, लेकिन गैर विशिष्ट बंधन वृद्धि हो सकती है।
  6. स्तंभ बफर के 5 संस्करणों जोड़ें। कोशिकाओं 1 मिलीलीटर की मात्रा में resuspended रहे हैं, तो, स्तंभ बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ने जबकि कोशिकाओं 2 मिलीलीटर में resuspended हैं, तो स्तंभ बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. 300 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  8. निर्धारित बनाने के लिए कितने लोकसभा कॉलम शुद्धि के लिए आवश्यक हो जाएगा। एक लोकसभा स्तंभ 15-20 x 10 6 कुल कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है।
  9. लोकसभा स्तंभ प्रति स्तंभ बफर के 1,000 μl में सेल गोली Resuspend इस्तेमाल किया जा रहा है।
  10. प्रधानमंत्री स्तंभ बफर के 5 मिलीलीटर जोड़कर प्रत्येक लोकसभा स्तंभ। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए। एक बार स्तंभ बूffer पूरी तरह से ऊपरी सदन के माध्यम से पारित कर दिया गया है, प्रत्येक स्तंभ के लिए सेल निलंबन के 1,000 μl लागू करते हैं और कोशिकाओं को गंभीरता से के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: कोशिकाओं का घनत्व बहुत अधिक है, तो स्तंभ धीमी गति से चला सकते हैं।
  11. इसके तत्काल बाद सेल निलंबन कॉलम के माध्यम से पारित कर दिया गया है, धीरे-धीरे अनबाउंड कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक स्तंभ के लिए स्तंभ बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें। धोने आसानी स्तंभ (1 हर 30-45 सेकंड के लिए ड्रॉप) के माध्यम से चल रहा है, स्तंभ बफर के 3 मिलीलीटर के साथ दो अतिरिक्त बार धो लो।
  12. प्रत्येक स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर जगह है। स्तंभ बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक तेजी से प्लास्टिक सवार उस स्तंभ के साथ पैक किया जाता है का उपयोग कर दर पर कॉलम के माध्यम से बफर उतर रही है। डूबनेवाला उन्हें स्तंभ से रिहा बाध्य कोशिकाओं को बेदखल होगा।
  13. लोकसभा कॉलम के दूसरे दौर के माध्यम से नमूना चलाने के द्वारा पवित्रता बढ़ाएँ। पहले पास के दौरान इस्तेमाल किया स्तंभों की संख्या की एक तिहाई का प्रयोग करें। प्रधानमंत्री स्तंभ बफर के 5 मिलीलीटर के साथ कॉलम।स्तंभ बफर ऊपरी सदन के माध्यम से पारित करने की अनुमति दें।
  14. चूंकि सेल निलंबन की मात्रा बहुत अधिक हो जाएगा, समान रूप से प्रत्येक स्तंभ के लिए सेल निलंबन के 1,000 μl लागू करते हैं और निलंबन एक अतिरिक्त 1,000 μl के साथ भरपाई पहले स्तंभ के ऊपरी सदन के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  15. एक बार सेल निलंबन पूरी तरह से कॉलम के दूसरे दौर के लिए लागू किया गया है, स्तंभ बफर के 3 मिलीलीटर के साथ 2-3 बार धो लें।
  16. प्रत्येक स्तंभ निकालें और एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर यह जगह। स्तंभ बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और बफर प्लास्टिक सवार उस स्तंभ के साथ पैक किया जाता है का उपयोग कर उतर रही है। डूबनेवाला उन्हें स्तंभ से रिहा बाध्य कोशिकाओं को बेदखल होगा।
  17. 12-15 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। गोली कॉम्पैक्ट दिखाई देनी चाहिए।
  18. पूर्व गर्म ओपीसी प्रसार मीडिया (ओपीसी आधार PDGF-एए 20 एनजी / एमएल के साथ पूरक मीडिया) के 5-10 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend।
  19. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। कोशिकाओं थाली। ओपीसी प्रसार मीडिया के साथ 60,000 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं पतला। प्रत्येक काले में, स्पष्ट नीचे 24 अच्छी तरह से, pipet 500 के पक्ष के साथ अच्छी तरह से कोशिकाओं की μl 30,000 कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति प्राप्त करने के लिए। क्षैतिज प्लेट मिलाते हुए एक आंकड़ा आठ गति का उपयोग करके कोशिकाओं मिश्रण। तो 48, 96, या 384 अच्छी तरह से प्लेटों में परख प्रदर्शन, क्रमश: अच्छी तरह से प्रति 15,000, 7,500, 1,500 या कोशिकाओं जोड़ें। इन नंबरों को अलग-अलग प्लेट विशिष्टताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  20. दिवस 0 आधारभूत नियंत्रण संस्कृतियों के लिए एक अलग प्लेट तैयार करें। इस पर नियंत्रण की थाली, धारा 5.7 में वर्णित के रूप में 4% paraformaldehyde के साथ तय की जानी चाहिए जब भेदभाव दिवस 0 पर शुरू की है।
  21. संस्कृति कोई मीडिया परिवर्तन के साथ 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ओपीसी प्रसार में मीडिया में कोशिकाओं।

4% paraformaldehyde के साथ भेदभाव और ओपीसी निर्धारण की प्रेरण 5.

नोट: oligodendrogenesis पर छोटे अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करते हैं, हम नियमित तौर पर dissolvडाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में ई दवाओं है कि तब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 0.1% DMSO के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सीधे SATO मीडिया में पतला 1,000x शेयरों तैयार करने के लिए। हम या तो ओपीसी प्रसार या भेदभाव DMSO के इस एकाग्रता का प्रयोग करने में कोई बदलाव नहीं देखा है (डेटा) नहीं दिखाया।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म ओपीसी आधार मीडिया और कमरे के तापमान को नशीली दवाओं के उपचार के शेयरों पिघलना। जब दो प्रतियों में उपचार प्रदर्शन, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में इलाज के समूह प्रति मीडिया के लगभग 1.25 मिलीलीटर तैयार करते हैं। तीन प्रतियों के नमूने लिए, सुस्त के लिए खाते में 2 मिलीलीटर क्षमता अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें।
  2. सीधे ओपीसी आधार मीडिया में उपचार के शेयरों में गिराए द्वारा दोहराने कुओं के लिए उपचार मास्टर घोला जा सकता है तैयार करें। संक्षेप में भंवर या धीरे प्रत्येक mastermix मिश्रण उपचार के सजातीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
  3. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नियंत्रण के रूप में उपयुक्त वाहन के रूप में 45 एनएम ट्राईआयोडोथायरोनिन (टी 3) तैयार करें। 10 मिमी पतला टी 3 शेयर1: 1,000 ओपीसी आधार मीडिया के 1 मिलीलीटर में और उसके बाद आगे के इलाज के मास्टर मिश्रण में पतला DMSO के अंतिम एकाग्रता कम करने के लिए यदि आवश्यक है।
  4. एक समय में संस्कृति कुओं एक इलाज के समूह से मीडिया aspirate इतनी के रूप में कोशिकाओं को सुखाने से बचने के लिए। अच्छी तरह से की तरफ से और संस्कृति में काले पदार्थ बंद scraping से बचने के लिए कांच पाश्चर pipet के अंत पर एक 200 μl pipet टिप का उपयोग करें।
  5. धीरे-धीरे अच्छी तरह से एक 1 मिलीलीटर pipet का उपयोग के पक्ष के साथ उपचार mastermix के 500 μl जोड़ें।
  6. वांछित समय सीमा के लिए संस्कृतियों सेते हैं, ताजा उपचार मीडिया के साथ एक पूर्ण मीडिया विनिमय प्रदर्शन हर 2-3 दिनों के लिए। हम नियमित रूप से भेदभाव मीडिया में 4 दिनों के बाद एक 30-40% MBP + संस्कृति निरीक्षण करते हैं।
  7. वांछित उपचार की अवधि के अंत में, ताजा 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार है या कमरे के तापमान को एक जमे हुए शेयर पिघलना। चेतावनी: पीएफए ​​अत्यंत विषैला होता है और एक धूआं हुड में तैयार किया जाना चाहिए।
  8. मीडिया Aspirate और धीरे-धीरे 400 जोड़ने1, अच्छी तरह से कोशिकाओं को ठीक करने के पक्ष में पीएफए ​​के एल। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  9. पीएफए ​​Aspirate और धीरे धीरे कोशिकाओं को धोने के लिए अच्छी तरह से की ओर से बाँझ डी-पीबीएस (सीए के साथ 2 + और ​​2 मिलीग्राम +) के 500 μl जोड़ें। धोने और दो बार की कुल दोहराएँ। अंतिम धोने aspirate मत करो।
  10. बाद में प्रसंस्करण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और दुकान में प्लेट की चादर या अगले कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना। प्लेट्स कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है।

6. Immunocytochemistry और माइलिन बुनियादी प्रोटीन मात्रा का ठहराव

नोट: जब 24 अच्छी तरह प्लेटें में तरल से निपटने प्रक्रियाओं के प्रदर्शन, यह कोशिकाओं सुखाने से बचने के लिए तेजी से काम करने के लिए सिफारिश की है। इधर, एक मल्टी चैनल वैक्यूम खींचने की मशीन और मल्टी चैनल pipet के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं।

  1. कमरे के तापमान के लिए थाली ले आओ कुओं aspirate, और जोड़ने के डी-पीबीएस (सीए के साथ 2 + और ​​2 मिलीग्राम +) के 250 μl 0.1% ट्राइटन X-100 और 5% से युक्तसामान्य बकरी सीरम (NGS)। कोमल कक्षीय झटकों के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं।
  2. और 1000 खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी actin एंटीबॉडी 1: माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी MBP 1 गिराए द्वारा प्राथमिक ऊष्मायन समाधान तैयार डी पीबीएस में 200 (सीए के साथ 2 + और ​​2 मिलीग्राम +) 5% NGS हैं। वैकल्पिक रूप से, खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी Olig2 1: 1,000 मिश्रित glial संस्कृतियों में oligodendrocyte विशिष्ट सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अच्छी तरह से प्रति 250 μl को समायोजित करने के लिए पर्याप्त प्राथमिक समाधान तैयार है।
  3. कोमल कक्षीय झटकों के साथ 16-18 घंटे के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं।
  4. प्राथमिक ऊष्मायन समाधान Aspirate और कोशिकाओं कोमल कक्षीय झटकों के साथ कमरे के तापमान पर डी-पीबीएस (सीए के साथ 2 + और ​​2 मिलीग्राम +) के 500 μl के साथ 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
  5. प्लेट धोने, वहीं विरोधी माउस 680 और विरोधी खरगोश 800 एंटीबॉडी 1 गिराए द्वारा माध्यमिक ऊष्मायन समाधान तैयार: (डी पीबीएस में 500 सीए के साथ 2 + 2 मिलीग्राम +) 5% NGS हैं। परिवेश प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए जब इस समाधान की तैयारी।
  6. अंतिम धोने Aspirate और माध्यमिक ऊष्मायन समाधान के 250 μl जोड़ें। प्रकाश से प्लेट को सुरक्षित रखें और कोमल कक्षीय झटकों के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं।
  7. माध्यमिक ऊष्मायन समाधान Aspirate और कुओं कोमल कक्षीय झटकों के साथ कमरे के तापमान पर डी-पीबीएस (सीए के साथ 2 + और ​​2 मिलीग्राम +) के 500 μl के साथ 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
  8. प्लेट एक इमेजिंग प्रणाली 700 एनएम और 800 एनएम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने में सक्षम का उपयोग कर स्कैन करें। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, फोकल MBP के लिए 1.5 से 3 और संवेदनशीलता, 5.0 actin के लिए, और Olig2 के लिए 3.5 करने के लिए ऑफसेट की स्थापना की। के रूप में संकेत overexposure से बचने की जरूरत संवेदनशीलता मूल्यों को समायोजित करें।
  9. अर्द्ध स्वचालित सॉफ्टवेयर आधारित तरीकों का उपयोग कर oligodendrogenesis की हद तक यों।
    1. सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, थाली विश्लेषण मोड के लिए "24 अच्छी तरह से" सेट और टी के आसपास हलकों संरेखितवह स्कैन कुओं की बाहरी परिधि। "800" को सामान्य बनाने चैनल सेट और 700 एनएम (MBP) और 800 एनएम (Olig2 / actin) चैनलों के लिए कुल और रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्यात।
    2. 800 एनएम पर तीव्रता से 700 एनएम पर तीव्रता फूट डालो रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों में सामान्यीकृत MBP अभिव्यक्ति देने के लिए। दोहराने माप के औसत की गणना के रूप में और विश्लेषण के लिए आवश्यक दिवस के पैमाने पर अभिव्यक्ति 0 + PDGF नियंत्रित करता है।

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Representative Results

A2B5 पॉजिटिव OPCs एक चुंबकीय स्तंभ जुदाई प्रणाली का उपयोग कर सकारात्मक सेल के चयन के माध्यम से अलग कर रहे हैं। अलगाव की प्रक्रिया के लिए पहले, पूरे दिमाग चूहे पिल्ले कि पी -5 और P7 के बीच से निकाल दिया जाता है। एक बार जब पूरे दिमाग सफलतापूर्वक खोपड़ी से अलग है, घ्राण बल्ब और सेरिबैलम ठीक शल्य चिकित्सा संदंश (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर हटा रहे हैं। आदेश मस्तिष्क cortical ऊतक को अलग करने में हाइपोथैलेमस, चेतक और मध्यमस्तिष्क सावधान विच्छेदन (चित्रा 1 बी) द्वारा excised हैं। अगले, हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम मुड़े शल्य चिकित्सा संदंश (- डी चित्रा 1 सी) का उपयोग कर हटा रहे हैं। अलगाव की प्रक्रिया कुशलता तानिका और fibroblast कोशिकाओं को समाप्त, लेकिन जब तानिका और वाहिका को हटा रहे हैं (चित्रा 1E) enzymatic पाचन में सुधार हुआ है। अंत में, 1 मिमी x 1 मिमी ऊतक ब्लॉक बाद में ऊतक हदबंदी कदम के लिए तैयार कर रहे हैं अंजीर (Ure 1F)।

एक अच्छा ओपीसी अलगाव अंतिम स्पिन कदम (2A चित्रा) के बाद एक कॉम्पैक्ट सेल गोली में परिणाम चाहिए। एक बार चढ़ाया इन संस्कृतियों सेलुलर मलबे के अपेक्षाकृत मुक्त है जब एक माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी) के तहत देखा जाएगा। सबऑप्टिमल अलगाव सेलुलर मलबे की बड़ी मात्रा की उपस्थिति के कारण एक बड़े और शराबी गोली में हो सकता है। इस मलबे पीएलएल लेपित पोत को दृढ़ता से पालन करना होगा और संस्कृति (चित्रा 2 सी) के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। एक बड़े और शराबी गोली materializes हैं, तो यह पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और <300 x जी पर 10 मिनट के लिए अंतिम स्पिन को दोहराने के लिए मदद मिल सकती है। एक बार अलगाव पूरा हो गया है, संस्कृतियों की पवित्रता A2B5 पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत पहचान करने के लिए प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। एक सफल अलगाव कोशिकाओं है कि> 95% A2B5 लिए सकारात्मक रहे हैं की एक पूल में परिणाम चाहिए (चित्रा 2 डी - एफ)। एक फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित विरोधी A2B5 एंटीबॉडी के साथ दाग कोशिकाओं की तुलना में, बेदाग कोशिकाओं एक नकारात्मक जनसंख्या के रूप में प्रकट करना चाहिए और gating के लिए एक आधारभूत संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, हम पहले से A2B5 प्रतिजन पैदावार संस्कृतियों है कि 11 immunocytochemistry द्वारा PDGFRα के लिए सकारात्मक दाग का उपयोग कर OPCs की है कि चयन से पता चला है।

Immunocytochemistry द्वारा प्रदर्शन के रूप में, इलाज की शुरुआत (0 दिन) पर OPCs Olig2 + / MBP हैं - जबकि कोशिकाओं Olig2 + / MBP 4 दिन से + (चित्रा 3) कर रहे हैं। दिवस 0 और 4 दिन में OPCs और oligodendrocytes का इष्टतम confluency प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (चित्रा 4 ए) में दिखाया जाता है। 0 दिवस पर MBP अभिव्यक्ति के अभाव oligodendrogenesis बढ़ाता के लिए एक आधार रेखा के रूप में कार्य करता है। PDGF-एए वापसी का एक परिणाम के रूप में सहज भेदभाव, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जबकि 45 एनएम थायराइड हार्मोन (triiodothyronine; T3) एक सकारात्मक नियंत्रण 11,15 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Quetiapine भी Seroquel, और clemastine भी Tavist रूप में जाना जाता, कर रहे हैं एफडीए को मंजूरी दी दवाओं है कि इन विट्रो oligodendrogenesis में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है और अतिरिक्त सकारात्मक नियंत्रण 16,17 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 4 बी एक प्रतिनिधि दो चैनल अवरक्त चलता फ्लोरोसेंट स्कैन तीन प्रतियों में इन शर्तों में से प्रत्येक के लिए अपेक्षित परिणाम का प्रदर्शन है। Actin और MBP संकेतों क्रमश हरे और लाल pseudocolored रहे थे तो यह है कि अत्यधिक विभेदित संस्कृतियों मर्ज किए गए चित्र में पीले रंग दिखाई देते हैं। परिणाम बताते हैं कि PDGF वापसी हालत में 4 दिन में MBP अभिव्यक्ति थी 4.5 ± 1.4 गुना दिवस 0 की तुलना में अधिक है, जबकि MBP में गुना परिवर्तन थायराइड हार्मोन, quetiapine, और clemastine साथ इलाज के लिए कारण थे 33.9 ± 4.1, 33.4 ± 1.0 और 32.8 ± 0.5 क्रमशः (चित्रा 4C)। मजबूती और परख की सटीकता एसएम द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैंतीन प्रतियों के नमूने और बड़े उपचार सक्रियण खिड़की है कि PDGF वापसी नियंत्रण से ऊपर के बारे में 20 मानक विचलन के बीच सभी मानक विचलन।

एक्टिन oligodendrocyte संस्कृतियों में सामान्य बनाने के लिए एक विश्वसनीय संदर्भ जीन के रूप में कार्य करता है, जबकि वैकल्पिक संदर्भ जीनों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। Olig2 एक परमाणु प्रतिलेखन कारक है कि अनिवार्यता से oligodendrocyte वंश की कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। अपनी विशिष्ट और विधान अभिव्यक्ति पैटर्न इस प्रकार विषम स्थितियों में एक संस्कृति और अधिक बेहतर सामान्य बनाने की रणनीति प्रदान कर सकता है। चित्रा 5 से पता चलता है कि 10 एनएम थायराइड हार्मोन के साथ भेदभाव ओपीसी संस्कृतियों में, PDGF वापसी करने में MBP अभिव्यक्ति रिश्तेदार गणना गुना परिवर्तन जब या तो उपयोग कर एक ही है Olig2 या सामान्य बनाने के लिए एक्टिन। मुमकिन है, क्योंकि इस प्रयोग में ओपीसी संस्कृतियों बहुत शुद्ध थे, दोनों प्रोटीन मज़बूती से सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, हम often दिन 4 से Olig2 नकारात्मक कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी का निरीक्षण, लेकिन Olig2 पॉजिटिव आबादी के लिए इस आबादी के अनुपात में काफी PDGF वापसी और T3 इलाज समूह के बीच अलग प्रतीत नहीं होता है। इस प्रकार, गुना-परिवर्तन से प्रभावित नहीं हैं। एक परिदृश्य है, जहां एक उपचार Olig2 नकारात्मक प्रकार की कोशिकाओं के प्रसार के कारण हो सकता है को देखते हुए, सामान्य बनाने एंटीबॉडी के चुनाव को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1:।। चूहा मस्तिष्क विच्छेदन प्रक्रिया विच्छेदन प्रक्रिया का विवरण stepwise यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पृथक के प्रवाह cytometry विश्लेषणOPCs। (ए) चुंबकीय स्तंभ शुद्धि के बाद, बाध्य सेल की आबादी स्तंभ से बाहर कूद पड़े और एक कॉम्पैक्ट गोली फार्म के लिए centrifuged है। मलबे की राशि गोली के आकार से संकेत दिया है। (ख) यदि गोली कॉम्पैक्ट है, तो मलबे संस्कृति में कम हो जाएगा। (सी) एक बड़े और शराबी गोली आमतौर पर भारी मलबे के साथ एक संस्कृति में यह परिणाम है। संस्कृति की पवित्रता को एक चूहे विरोधी माउस A2B5 एंटीबॉडी कि एपीसी संयुग्मित है का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जाता है। (डी) मृत कोशिकाओं और मलबे से विश्लेषण के रूप में आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर भूखंडों में दिखाया बाहर रखा गया है। (ई) A2B5 सकारात्मक आबादी एक बेदाग gating के लिए एक संदर्भ के रूप में आधारभूत जांचा का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। (एफ) को सफलतापूर्वक अलग-थलग OPCs> 95% A2B5 के लिए सकारात्मक होना चाहिए। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3:। ओपीसी संस्कृति और भेदभाव प्रक्रिया दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग (DIFS) परख हौसले isolatedA2B5 पॉजिटिव चूहे OPCs के साथ शुरू होता पीएलएल लेपित संस्कृति वाहिकाओं (3 दिन) पर चढ़ाया। इन संस्कृतियों 20 एनजी / एमएल PDGF-एए की उपस्थिति में 3 दिनों के लिए प्रचुर मात्रा में कर रहे हैं, और फिर पूरी तरह से दिन 2 पर मंगाया है डे 0. उपचार मीडिया पर ताजा PDGF मुक्त मीडिया में प्रयोगात्मक कारकों के साथ इलाज किया, और कोशिकाओं के साथ तय कर रहे हैं पर 4 दिन Olig2 (हरा) और MBP (लाल) के लिए Immunocytochemistry 4% paraformaldehyde दिवस 0 और 4 दिन में प्रतिनिधि संस्कृतियों पर प्रदर्शन किया गया था एक परमाणु काउंटर दाग के रूप में DAPI (नीला) के प्रयोग से। इन संस्कृतियों 0 दिन और 4 पर पैन oligodendrocyte वंश सेल मार्कर Olig2 के लिए विधान धुंधला दिखा रहे हैं, परिपक्व oligodendrocyte मार्कर के लिए धुंधला हो जाना, जबकि MBP केवल EV है4 दिन से अध्यक्ष यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: MBP मात्रा का ठहराव दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग (DIFS) परख का उपयोग (ए) दिवस 0 पर ओपीसी संस्कृतियों का घनत्व और 4 दिन इष्टतम परख प्रदर्शन के लिए जरूरी है।। (बी) के प्रतिनिधि दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैन। OPCs 45 एनएम T3, 1 माइक्रोन quetiapine, 1 माइक्रोन clemastine, या तीन प्रतियों में 0.1% DMSO की उपस्थिति में 4 दिनों के लिए 24 अच्छी तरह प्लेटें में भेदभाव कर रहे थे। एक अलग प्लेट OPCs युक्त कि 0 (+ PDGF) दिवस पर तय किया गया समानांतर में संसाधित किया गया था। Actin (हरी pseudocolored) और MBP (लाल pseudocolored) एक साथ एक Licor ओडिसी स्कैनर 700 एनएम और 800 एनएम उत्सर्जन का पता लगाने के लिए सेट का उपयोग मात्रा गया। ( यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Olig2 oligodendrocytes में MBP अभिव्यक्ति को सामान्य बनाने के लिए एक विश्वसनीय संदर्भ प्रोटीन है OPCs 4 दिनों के लिए 24 अच्छी तरह प्लेटें में 10 एनएम T3 या 0.1% DMSO के वाहन पर नियंत्रण की उपस्थिति में तीन प्रतियों में भेदभाव कर रहे थे।। दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग परख सामान्य बनाने के लिए विरोधी Olig2 या विरोधी एक्टिन प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। Olig2 / actin और MBP एक साथ एक Licor ओडिसी स्कैनर 700 एनएम और 800 एनएम उत्सर्जन का पता लगाने के लिए सेट का उपयोग मात्रा गया। MBP अभिव्यक्ति नहीं थाया तो Olig2 या actin अभिव्यक्ति के लिए rmalized, और परिणाम 0.1% DMSO नियंत्रण करने के लिए बढ़ाया गया था। ± एसडी मतलब रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों GraphPad चश्मे का उपयोग कर साजिश रची थे 6. परिणाम बताते हैं कि गणना गुना परिवर्तन ही जब दो संदर्भ प्रोटीन के लिए या तो सामान्य है।

चित्रा 6
चित्रा 6:। ट्राइटन X-100 MBP धुंधला पर का प्रभाव OPCs 45 एनएम T3 या 0.1% DMSO की उपस्थिति में 4 दिनों के लिए 24 अच्छी तरह प्लेटें में भेदभाव कर रहे थे। संस्कृतियों तो 4% पीएफए ​​के साथ तय की और Olig2 और MBP दो अलग immunocytochemistry प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए दाग रहे थे। उच्च ट्राइटन X-100 नमूने लिए, कोशिकाओं को 0.4% ट्राइटन X -100 के साथ 1 घंटे के लिए permeabilized थे और सभी एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम 0.1% ट्राइटन X-100 की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया। कम ट्राइटन X-100 नमूने लिए, कोशिकाओं को 0.1% ट्राइटन X-100 है, जबकि antibo के साथ 1 घंटे के लिए permeabilized थेवि incubations ट्राइटन X-100 के बिना प्रदर्शन किया गया। Olig2 और MBP के साथ फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित द्वितीयक और छवियों को एक कैमरा आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया कल्पना थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहा OPCs अलग और प्रयोगात्मक कारकों के जवाब में इन विट्रो oligodendrogenesis में बढ़ाता के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि का वर्णन है। सकारात्मक चयन का उपयोग करना, व्यवहार्य और शुद्ध OPCs की उच्च पैदावार प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाता है। इस विधि अलगाव, संवर्धन, और भेदभाव एक 1 सप्ताह समय सीमा में कदम सुव्यवस्थित, और तय कोशिकाओं आसानी से परख संवेदनशीलता में बिना किसी नुकसान के कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

स्कैनर आधारित प्रतिदीप्ति assays के साथ एक प्रमुख लाभ यह है कि डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण बहुत पारंपरिक कैमरा आधारित माइक्रोस्कोपी तकनीक बनाम तेजी लाई जाती है। हालांकि माइक्रोस्कोपी उच्च throughput स्क्रीन में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है ओपीसी भेदभाव के inducers की पहचान करने, डाटा अधिग्रहण स्वाभाविक धीमी है क्योंकि यह छवि पर कब्जा दृश्यों की प्रोग्रामिंग, डाटा संग्रह के कई घंटे, सैकड़ों के विश्लेषण की आवश्यकता वेंछवि फ़ाइलों, और उपयोगकर्ता परिभाषित एल्गोरिदम के ousands सामान्य बनाने या विश्लेषण 18,19 के लिए व्यक्तिगत सेल निकायों भेद करने के लिए। इसके अलावा, कैमरा आधारित माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के साथ यह संभव नहीं संस्कृति पोत की पूरी सतह से डेटा प्राप्त करने के लिए है। इसके बजाय, प्रतिनिधि छवियों एक भी अच्छी तरह से भीतर विभिन्न क्षेत्रों, जो स्थितीय पूर्वाग्रह और झूठी सकारात्मक हिट करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से कब्जा कर लिया जाना चाहिए। तुलना करके, इस परख अच्छी तरह से एक दिया भीतर सभी कोशिकाओं से MBP अभिव्यक्ति का पता लगाता है, और कई प्लेटें एक साथ स्कैन किया जा सकता। इस विधि 96 अच्छी तरह से या 384 अच्छी तरह स्वरूपों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि 24 अच्छी तरह से थाली जब कम उपचार परीक्षण किया जा रहा पसंद किया जा सकता है। हमने देखा है कि तरल से निपटने के कारण 24 अच्छी तरह से थाली में सेल नुकसान कम से कम है, जो एक जटिलता है कि जब उच्च throughput प्रयोगों को डिजाइन विचार किया जाना चाहिए।

परख का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर कोशिकाओं के घनत्व जब differenti हैव्यावहारिक दिवस पर शुरू की है भी कुछ कोशिकाओं के साथ 0. संस्कृतियों, और धीरे धीरे अंतर और है, जबकि उच्च घनत्व संस्कृतियों सहज भेदभाव का प्रदर्शन बंद कर मरने के लिए दिखाई देते हैं। दोनों स्थितियों गतिशील रेंज और परख की विश्वसनीयता को कम कर सकता है। सेल स्वास्थ्य और सेल घनत्व के बीच एक इष्टतम संतुलन हासिल करने के लिए हमें संस्कृति एक मीडिया आदान-प्रदान या ताजा PDGF-एए की पूरकता के बिना 3 दिन के लिए OPCs। हम धारणा है कि इन विट्रो (0 दिन) सेलुलर अपचय का एक परिणाम के रूप में 3 दिन से मीडिया में गिरावट आती है में PDGF-एए की एकाग्रता के बाद से, कोशिकाओं के proliferative दर धीमी हो जाएगी कि इस तरह के प्रसार PDGF- के पहले दिन के माध्यम से कम हो जाता है ए.ए. वापसी। इस तकनीक को सबसे अच्छा है जब कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं चढ़ाना के दौरान काम करता है। अच्छी तरह से पक्ष के साथ कोशिकाओं pipetting और एक आंकड़ा आठ गति का उपयोग एक भी वितरण को बढ़ावा देना चाहिए उन्हें मिश्रण। अच्छी तरह से केंद्र में pipetting कुछ के साथ अच्छी तरह के किनारों के आसपास कोशिकाओं के समूहों का उत्पादन करता हैएर कोशिकाओं केंद्र का पालन कर। इस घटना तरल pipetting बलों द्वारा हौसले सूखे पीएलएल परत के विघटन के कारण हो सकता है। परिधि के चारों ओर कोशिकाओं के संचय के घनत्व पर निर्भर भेदभाव की वजह से परख संवेदनशीलता को कम कर सकता है। यह ध्यान रखें कि actin / Olig2 संकेत की तीव्रता में काफी अंतर दवा इलाज और नियंत्रण, PDGF वापसी संस्कृतियों के बीच हो सकता है महत्वपूर्ण है। गौरतलब है कि एक्टिन / Olig2 संकेत कमी आई है दवा विषाक्तता का संकेत हो सकता है, जबकि काफी वृद्धि हुई एक्टिन / Olig2 संकेत दवा प्रेरित प्रसार का संकेत हो सकता। हम आम तौर पर समर्थक भेदभाव दवाओं के साथ इलाज किया कोशिकाओं से एक से थोड़ा अधिक एक्टिन / Olig2 संकेत निरीक्षण PDGF वापसी नियंत्रण की तुलना में। हम PDGF वापसी समूह में सहज apoptosis के एक उच्च दर 4 दिन भेदभाव प्रक्रिया खत्म करने के लिए इस अंतर को बताते हैं। जब oligodendrogenesis, actin के लिए MBP के सामान्य होने का आकलन / Olig2 सेल नंबर मतभेद के लिए सही होना चाहिए। toxi आकलन करने के लिएशहर और प्रसार इस परख का उपयोग, विरोधी MBP एंटीबॉडी उचित मार्कर के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विमर्श किया जा सकता है।

प्रयोगों दोनों मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है, यह तय करने के लिए चूहे oligodendrocyte संस्कृतियों के जोखिम को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है ट्राइटन X-100 जब 4% पीएफए ​​का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करने के लिए। oligodendrocyte संस्कृतियों के लिए अन्य immunocytochemistry प्रोटोकॉल, जो आम तौर पर एंटीबॉडी मिलान पहुंच में सुधार करने के लिए एंटीबॉडी ऊष्मायन चरणों के दौरान दोनों ट्राइटन X-100 में शामिल हैं, प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। दूसरी ओर, हालांकि MBP एक intracellular प्रोटीन होता है यह ट्राइटन X-100 बाहर करने के लिए पूरी तरह से अगर वैकल्पिक निर्धारण के तरीकों कार्यरत हैं कि पर्याप्त रूप से कोशिकाओं permeabilize संभव हो सकता है। यहाँ वर्णित शर्तों का उपयोग करना, हमने देखा है कि ट्राइटन X-100 oligodendrocytes मनाया आकृति विज्ञान के साथ-साथ MBP धुंधला की स्थानीयकरण प्रभावितजब उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया। जब ट्राइटन X-100 एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम से छोड़ा जाता है हम एंटीबॉडी धुंधला में एक महत्वपूर्ण गिरावट नहीं देख पा रहे हैं। जैसा कि एंटीबॉडी ऊष्मायन के दौरान 6 चित्र में दिखाया गया है, सहित 0.4% ट्राइटन X-100 permeabilization और अवरुद्ध चरण में, और 0.1% ट्राइटन X-100, माइलिन प्रक्रियाओं और असंतत MBP धुंधला में परिणाम का पता लगाने कम कर देता है। इसलिए, मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन के लिए यह रूप में यहाँ वर्णित ट्राइटन X-100 के एक कम एकाग्रता का उपयोग करने के लिए पर्याप्त हो सकता है।

चूहों से A2B5 चयनित OPCs के उपयोग के लिए फायदेमंद हो सकता है, हम दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग (DIFS) परख में तुलनीय परिणाम C57BL / 6 चूहों से A2B5 चयनित OPCs का उपयोग करते हुए देखा है, हालांकि माउस प्रति सेल उपज आम तौर पर ज्यादा है कम (डेटा) नहीं दिखाया। ओपीसी शुद्धि के लिए अन्य प्रोटोकॉल भी इस परख के साथ संगत हो सकता है। उदाहरण के लिए, oligodendrocyte मार्कर O4 एक प्रतिजन int को शुद्ध करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैermediate चरण oligodendrocyte चुंबकीय मोती का उपयोग कर 20 व्यापारियों। चुंबकीय आधारित विधियों के लिए एक विकल्प के रूप में, OPCs 9 दिन पुराने मिश्रित glial हाई स्पीड कक्षीय मिलाते और अंतर आसंजन तरीकों 21 से astrocytes और microglia युक्त संस्कृतियों से समृद्ध बनाया जा सकता है। इसके अलावा, इम्युनो-पैनिंग प्रक्रियाओं को शामिल जो संस्कृति पवित्रता उच्च सेल पैदावार 22 से अधिक पसंद किया जाता है, तो सकारात्मक और नकारात्मक दोनों सेल के चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चिकित्सा विज्ञान की जांच कैसे सीधे शुद्ध संस्कृतियों में OPCs के भेदभाव को बढ़ाने सकता है के अलावा, यह कभी कभी अप्रत्यक्ष एक सह संस्कृति प्रणाली में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के माध्यम से दवाओं के प्रभाव पर विचार करने के लिए आवश्यक है। एमएस में, सीएनएस में autoreactive टी प्रेरक कोशिकाओं की घुसपैठ रोग प्रगति 23 में एक भूमिका निभाने के लिए सोचा है। Effector टी कोशिकाओं समर्थक भड़काऊ कारक है कि माइलिन रहित के स्थलों पर OPCs के भेदभाव को बाधित कर सकते छिपाना सकता है। यह Thera की पहचान के लिए ब्याज की है इसलिएpeutics OPCs की रक्षा और चोट exacerbating से इन समर्थक भड़काऊ कारकों को ब्लॉक कर सकते हैं। DIFS परख इस गतिविधि मॉडलिंग के रूप में टी कोशिकाओं निलंबन में आगे बढ़ने और दूर oligodendrocyte संस्कृति से MBP मात्रा का ठहराव करने से पहले धोया जा सकता है के लिए आदर्श हो सकता है। इस तरह के न्यूरॉन्स, astrocytes, और microglia के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं को शामिल सह-संस्कृति के अध्ययन के लिए, Olig2 सामान्य बनाने के लिए विशेष रूप से oligodendrocytes डेटा एकत्र करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, DIFS परख के लचीलेपन प्रयोगात्मक डिजाइन की एक किस्म की सुविधा हो सकती है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में A2B5 पॉजिटिव चूहे OPCs की oligodendrogenesis यों तो एक तेज और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। इस अलगाव विधि लगातार व्यवहार्य OPCs कि स्थापित भेदभाव संकेतों के लिए उत्तरदायी हैं की उच्च पैदावार बचाता है। संवेदनशील विश्लेषण प्रयोगात्मक मानदंड की एक किस्म है, जो माँ के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का विस्तार का उपयोग कर बहु ​​अच्छी तरह प्रारूप वाहिकाओं में किया जा सकता हैएनवाई विभिन्न अनुप्रयोगों। इसके अलावा, DIFS परख उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी धब्बा के रूप में कम throughput assays के परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली में इस तरह के एकाधिक काठिन्य जैसे रोगों demyelinating में ओपीसी लक्षित चिकित्सा की पहचान के लिए एक सरल अभी तक प्रभावी साधन प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

प्रायोजक अनुदान: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान; अनुदान संख्या: R37 NS041435।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/ml
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/ml
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/ml
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/ml
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/ml
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/ml
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/ml
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/ml
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/ml
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/ml
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 108 Oligodendrocyte पूर्वज सेल oligodendrogenesis A2B5 cytoblot माइलिन बुनियादी प्रोटीन
चूहा Oligodendrocyte पूर्वज संस्कृति की तैयारी और Oligodendrogenesis की मात्रा दोहरे अवरक्त प्रतिदीप्ति स्कैनिंग का उपयोग
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Schott, J. T., Kirby, L. A.,… More

Schott, J. T., Kirby, L. A., Calabresi, P. A., Baxi, E. G. Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (108), e53764, doi:10.3791/53764 (2016).

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