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Developmental Biology

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

Published: February 17, 2016 doi: 10.3791/53764
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Neurology, Johns Hopkins University, School of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

Efficiente conduzione nervosa nel sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) richiede mielinizzazione degli assoni dagli oligodendrociti. Durante lo sviluppo, oligodendrociti nascono da un pool di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) che si pensa di migrare dalle zone ventricolari del prosencefalo sviluppo e tubo neurale 1. Dopo OPC migrazione differenziano in maturi, oligodendrociti mielinizzanti che non solo facilitare l'utilizzo efficiente di propagazione degli impulsi, ma anche fornire gli assoni con il supporto trofico 2. L'adulto CNS mantiene una popolazione abbondante di OPC che si disperdono in tutta la materia grigia e bianca che comprende circa il 5-8% di tutte le cellule 3. A seguito di un insulto demielinizzante, OPC migrano al sito di lesione, proliferano e si differenziano per sostituire guaine mieliniche persi o danneggiati in assoni esposti. Tuttavia, in alcune impostazioni malattia / infortunio, questo processo si trova ad essere inefficiente o può fallire completamente 4. Mentredemielinizzazione cronica è pensato di aggiungere al peso della malattia, oligodendrogenesis e rimielinizzazione efficiente può alleviare i sintomi 5. È stato quindi interessante studiare OPC in vitro per determinare l'effetto di fattori sperimentali oligodendrogenesis.

Insight nelle diverse fasi di differenziazione degli oligodendrociti è stato reso possibile tramite l'identificazione di marcatori cellulari specifici stadi. Auto-rinnovamento delle cellule progenitrici precoci sono definite dalla loro espressione del fattore di crescita derivato dalle piastrine del recettore alfa (PDGFRα), neurale / glia antigene 2 (NG2) e A2B5 6-8. Come OPC iniziano il loro programma di differenziazione e si ritirano dal ciclo cellulare, che downregulate espressione di questi marcatori e cominciano a esprimere le proteine ​​indicativi di premyelinating oligodendrociti tra ciclico-nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNPase) e O4. Infine, la loro differenziazione in oligodendroc più maturoYtes si caratterizza per l'espressione di proteine ​​della mielina-associata, tra cui glicoproteina mielina-associata (MAG), proteolipid proteina (PLP), e proteina basica della mielina (MBP). MBP è una proteina periferica di membrana intracellulare e una componente importante della guaina mielinica. Topi privi MBP sviluppano una grave fenotipo in cui CNS mielinizzazione è significativamente diminuiti con conseguente tremori, convulsioni e morte precoce 9,10. Questo ruolo importante MBP in myelination ha portato al suo uso come marker di differenziazione degli oligodendrociti sia in vitro che in vivo 11.

La quantificazione del MBP può essere effettuata mediante diverse metodologie differenti. RT-PCR e analisi Western Blot consentono per la quantificazione dei livelli di MBP sotto diversi regimi di trattamento. Immunocytochemistry è un approccio qualitativo comune che può anche essere quantitativa quando si utilizzano approcci microscopia basati su telecamere. Sebbene questi sistemi sono affidabili e fondamentale perlo studio della differenziazione degli oligodendrociti, ognuno ha i propri svantaggi che limitano il loro uso in screening di stupefacenti. In primo luogo, la quantità di OPC primari che sono necessari per la RT-PCR ed analisi Western blot riduce il numero di variabili che possono essere esaminati simultaneamente. Mentre il requisito cella per immunocitochimica è molto più basso, consistente lasso di tempo deve essere dedicato a ogni esperimento, se la quantificazione è l'obiettivo. Numerose immagini devono essere catturate e poi quantificati per facilitare l'analisi sperimentale. Questi avvertimenti diventano ostacoli importanti da considerare per gli studi che richiedono la valutazione elevato throughput. Qui si descrive un metodo che utilizza aspetti fondamentali sia dal immunocitochimica e metodologie Western Blot per mielina quantificazione, riducendo significativamente sia il numero di cellule necessario e il tempo per completare l'analisi quantitativa.

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Protocol

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato (IACUC) e la Johns Hopkins School of Medicine.

1. Preparazione di piatti analisi, soluzioni di riserva, e OPC base per supporti multimediali

Nota: La base di ratto OPC (Sato) i media qui descritte sono state derivate da studi pubblicati in precedenza 12,13. formulazioni dei media alternativi possono anche essere compatibili con questa procedura.

  1. Risospendere poli-L-lisina (PLL) ad una concentrazione di 10 mg / ml in acqua deionizzata sterile. Pipettare 400 ml di PLL diluito in ogni pozzetto di un fondo 24 tessuto ben piatto nero parete, chiaro cultura grado.
  2. Coat piatti di coltura di tessuti per 2 ore a 37 ° C tessuto cultura incubatore o durante la notte in un frigorifero C 4 °.
  3. Aspirare PLL da piatti rivestiti di almeno 20 minuti prima della placcatura. Lasciare il restante PLL asciugare dal pozzo posizionando 24 pozzetti con il coperchio parzialmente socchiusa in coltura tissutalecappuccio. Verificare che i pozzi siano completamente asciutti prima di placcatura OPC isolati. Le cellule non aderiranno alla plastica che ha liquido PLL presente.
  4. Preparare soluzione madre acetil-L-cisteina (NAC) N (1,000x): Sciogliere 100 mg N acetil-L-cisteina (NAC) in 20 ml di mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM). Aliquota e conservare a -20 ° C.
  5. Preparare soluzione madre Idrocortisone (1,000x): Aggiungere 1 ml di etanolo a 1 mg di idrocortisone e agitare per sciogliere. Aggiungere 19 ml di DMEM, miscelare la soluzione, aliquotare e conservare a -20 ° C. L'aggiunta di idrocortisone ai mezzi di base ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza delle cellule gliali 14.
  6. Preparare d-biotina soluzione madre (5,000x): Sciogliere 2,5 mg di d-biotina in 50 ml di PBS. Aggiungere 1-2 x 5 gocce microlitri di 0,1 N NaOH per aiutare nella dissoluzione. Aliquota e conservare a -20 ° C.
  7. Preparare la soluzione di insulina magazzino (100x): Sciogliere 25 mg di insulina in 50 ml di acqua di grado coltura di tessuti. Aggiungere 250 ml of 1 N HCl e mescolare fino a quando la soluzione è chiara. Sterilizzazione con un filtro da 0,22 micron e conservare a 4 ° C, per 6 settimane.
  8. Preparare soluzione madre Sato (100x):
    1. Preparare la soluzione di progesterone magazzino (25 mg / mL): Sciogliere 2,5 mg di progesterone in 100 ml di etanolo.
    2. Preparare la soluzione selenite magazzino di sodio (400 ng / ml): sciogliere 4 mg di sodio selenite in 100 ml di 0,1 N NaOH. Aggiungere 10 ml di DMEM e mescolare.
    3. Per 100 ml di DMEM, aggiungere 1 g di umana apo-transferrina, 1 g di albumina di siero bovino, e 160 mg di putrescina e mescolare per sciogliere completamente. Aggiungere 25 ml di soluzione di progesterone magazzino, 1.000 ml di soluzione di selenite di sodio magazzino, e mescolare. Aliquota e conservare a -20 ° C.
  9. Preparare OPC Base di supporto: per 100 ml di DMEM (con 4,5 g / L D-glucosio, L-glutammina, e 110 mg / l di sodio piruvato), aggiungere 100 ml NAC, 100 ml idrocortisone, 20 ml d-biotina, 1 ml insulina, 1 ml di Sato magazzino, 100 ml oligoelementi B,2 mL B-27 supplemento (50x), e 1 ml di penicillina / streptomicina (100x). Sterilizzare con un filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
  10. Preparare PDGF-AA soluzione madre (1,000x): sciogliere 250 mg a 12,5 ml di PBS con 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) per ottenere una soluzione 20 mg / ml. Aliquota e conservare a -80 ° C.
  11. Preparare OPC mezzi proliferazione: base per supporti multimediali OPC integrato con 20 ng / ml PDGF-AA.
  12. Preparare i media differenziazione OPC: base per supporti multimediali OPC integrato con 45 Nm triiodotironina.
  13. Preparare Colonna Buffer: Per 500 ml di PBS, aggiungere 2,5 g di BSA e 2 ml di 0,5 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e regolare il pH a 7,2. Sterilizzare con un filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C.

2. cervello di ratto dissezione

Nota: cuccioli P5-P7 di ratto vengono utilizzati in questo protocollo. Ogni corteccia dei ratti produce circa 1,5-2,0 x 10 6 A2B5 cellule positive.

  1. Sterilizzare tutte le apparecchiature dissezione con un 2506; C tallone riscaldata sterilizzatore.
  2. Aggiungere 15-20 ml di PBS (senza Ca 2+ e Mg 2+) a 50 ml provette coniche. Un tubo da 50 ml è sufficiente per 3-4 cortecce topo cucciolo. Mettere 50 ml provette coniche su ghiaccio. Utilizzare 50 ml provette coniche per tenere il tessuto corticale dadini durante la dissezione.
  3. Aggiungere PBS freddo a 10 cm Petri. Questo piatto sarà utilizzato per la dissezione al microscopio ottico.
  4. Sacrifice cuccioli di ratto per decapitazione con grandi forbici chirurgiche. Spray testa con il 70% di etanolo.
  5. Estrarre il cervello intero
    1. Utilizzo di piccole forbici tagliare la pelle verso il basso la linea mediana e dietro le orecchie e lembi cutanei buccia indietro. Tagliare il cranio lungo la linea mediana partendo dal tronco cerebrale e termina gli occhi. Fare attenzione a non tagliare troppo profondamente per preservare la struttura della corteccia sottostante.
    2. Fare due tagli laterali inferiori al cervelletto inserendo piccole forbici chirurgiche nel foro occipitale. Effettuare un taglio ulteriore in mezzo agli occhi, formicaerior ai bulbi olfattivi.
    3. buccia con attenzione ogni metà del cranio posteriore. Rimuovere l'intero cervello e mettere in 10 centimetri Petri piatto pieno di PBS freddo.
  6. Sotto il microscopio ottico dissezione, rimuovere i bulbi olfattivi e cervelletto con fini pinza chirurgica.
  7. Capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale è visibile sotto il microscopio ottico.
  8. Uso di pinze diritte sottili eseguire una dissezione smussa mettendo pinze punte chiuse tra la corteccia e l'ipotalamo ad una profondità di circa 2/3 del cervello. Una volta pinze sono in atto consentire alle estremità di aprire. Ripetere l'operazione per l'altro emisfero.
  9. Tease la corteccia dall'ipotalamo e regioni del mesencefalo.
  10. Rimuovere l'ipotalamo, talamo e mesencefalo tenendo mesencefalo alla sua superficie posteriore e peeling verso la fine anteriore del cervello. Sever i collegamenti anteriori.
  11. Rimuovere l'ippocampo da pealing verso l'esterno e poi tranciamento il suo collegamento alcorteccia con pinza sottile dissezione piegate.
  12. Rimuovere restante striato da rottamazione che dalla corteccia sottostante in un movimento verso l'esterno in diagonale con pinza sottile dissezione piegate.
  13. Cancellare tutti i vasi sanguigni e meningi dalla superficie ventrale della corteccia.
  14. Capovolgere il cervello in modo che la superficie dorsale è visibile. Meningi e vasi sanguigni dovrebbe essere evidente. meningi Peel dalla corteccia sottostante con pinze dissezione fine. Avviare peeling dalla posizione olfattiva attacco lampadina.
  15. Completa i passaggi 2,4-2,14 per un totale di 3-4 cuccioli di ratto.
  16. Mettere 3-4 sezionati cortecce ratto cuccioli in una capsula di Petri asciutto e tagliare con una lama di rasoio sterilizzato fino a 1 mm pezzi x 1 mm si ottengono. Raccogliere il tessuto sciacquando piatto con PBS da un tubo da 50 ml (fase 2) quindi inserire di nuovo sul ghiaccio.

3. enzimatica e meccanica dissociazione Tissue

Nota: Per questo passaggio, si consiglia un kit di dissociazione neurali papaina-based. utilizzando NeKit dissociazione Ural (P), sono descritti passaggi speciali che sono ottimali per l'isolamento OPC.

  1. Preparare il primo enzima dissociazione diluendo dell'enzima P con il tampone appropriato. Il contenuto di ogni conica 50 ml (1 campione) saranno risospese con un totale di 1.950 ml di miscela enzimatica. Posto nel mix enzima in un bagno a 37 ° C per 10 min.
    1 campione: 1.900 ml di tampone + 50 ml di enzima papaina
  2. Spin tutti i 50 ml provette coniche contenenti 3-4 dadini cortecce cuccioli di ratto a 300 xg per 3 min.
  3. Aspirare il surnatante e aggiungere 1.950 ml di soluzione enzimatica a ciascuna provetta e rompere a parte il pellet invertendo il tubo e scuotendo delicatamente.
  4. Incubare a 37 ° C tessuto cultura incubatore per 15 min con rotazione tubo continuo.
  5. Durante gli ultimi 5 min di incubazione, preparare la seconda miscela enzimatica A. Diluire l'enzima nel suo buffer appropriata. Sarà aggiunto un totale di 30 microlitriper ogni 50 ml provetta conica.
    1 del campione: 20 ml di tampone + 10 ml di enzima
  6. Dopo incubazione è completato aggiungere 30 microlitri della seconda miscela enzima per ciascuna provetta e miscelare.
  7. Usando una pipetta Pasteur di vetro collegato a un controller pipetta, dissociarsi meccanicamente il tessuto pipettando 10-15 volte o fino a quando i pezzi di tessuto sono di dimensioni ridotte e la soluzione è diventata torbida. Riportare il campione al 37 ° del tessuto C cultura incubatore per 15 minuti con rotazione continua.
  8. Pipettare ciascun campione di tessuto omogenato 10-15 volte con una pipetta 1 ml.
  9. Pipettare ciascun campione di tessuto omogenato 15-20 volte con una pipetta 200 microlitri
  10. Rientro tutti i campioni al 37 ° del tessuto C cultura incubatore per 10 minuti con rotazione continua.
  11. Aggiungere 10 ml di PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) per ogni campione e filtrare l'omogeneizzato attraverso un filtro 40 micron pori posto sopra un 50 ml tubo. Lavare il filtro con un ulteriore 1-2 ml di PBS.
  12. Pool tutti i campioni di omogenato in una provetta da 50 ml conica e acquisire un numero complessivo di cellule.
  13. Dopo aver eseguito il conteggio delle cellule, dividere l'omogeneizzato in modo uniforme in 15 ml provette coniche (1 tubo per ogni campione). Centrifugare per 10-12 min a 300 x g.

4. Anti-A2B5 Bead Application, Purificazione Colonna, e placcatura

  1. Eseguire calcoli per buffer di colonna e microsfere anti-A2B5. Aggiungere 7 ml Colonna buffer per ogni cellule 1 x 10 6. Aggiungere 2 microlitri microsfere anti-A2B5 ogni cellule 1 x 10 6.
  2. Unire tutti i campioni da risospendere le cellule in un volume totale di 10 ml di tampone colonna e centrifugare a 300 xg per 10-12 min.
  3. Risospendere il pellet di cellule in quantità appropriata di tampone colonna come calcolata al punto 4.1. Se il pellet è grande e sciolto, aggiungere solo circa la metà del volume di tampone di colonna per mantenere l'anticorpo alla concentrazione appropriata in risospensione delle cellule.
  4. Incubare la sospensione cellulare per 10 min a 4 ° C.
  5. Aggiungere microsfere anti-A2B5 (calcolata al punto 4.1), capovolgere diverse volte e incubare a 4 ° C per 30-60 min. Capovolgere delicatamente la provetta diverse volte ogni 10 min. tempi di incubazione più lunghi possono aumentare le rese di cellule, ma possono aumentare legame non specifico.
  6. Aggiungere 5 volumi di tampone di colonna. Se le cellule sono risospese in un volume di 1 ml, aggiungere 5 ml di tampone di colonna, mentre se le cellule sono risospese in 2 ml, aggiungere 10 ml di tampone di colonna.
  7. Centrifugare per 10 min a 300 x g.
  8. Determinare il numero di LS colonne saranno necessari per la purificazione. Una colonna LS è sufficiente per 15-20 x 10 6 cellule totali.
  9. Risospendere il pellet cellulare in 1.000 ml di tampone di colonna per colonna LS utilizzato.
  10. Prime ciascuna colonna LS aggiungendo 5 ml di tampone di colonna. Raccogliere il flusso attraverso una provetta conica da 50 ml. Una volta che i bu colonnaffer ha completamente attraversato la camera superiore, applica 1,000 ml di sospensione cellulare per ogni colonna e permettono alle cellule di attraversano per gravità.
    Nota: Se la densità delle cellule è troppo alta, la colonna può funzionare lento.
  11. Subito dopo la sospensione cellulare è passato attraverso la colonna, aggiungere lentamente 3 ml di tampone di colonna per ciascuna colonna per lavare le cellule non legato. Se il lavaggio viene facilmente eseguito attraverso la colonna (1 goccia per ogni 30-45 sec), lavare ancora due volte con 3 ml di tampone di colonna.
  12. Rimuovere ogni colonna e posizionarlo su un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di tampone colonna e precipitare il tampone attraverso la colonna ad una velocità rapida utilizzando il pistone di plastica che si comprime con la colonna. Immergendo sarà rimuovere le cellule legate li rilasciano dalla colonna.
  13. Aumentare la purezza eseguendo il campione attraverso un secondo turno di LS colonne. Utilizzare un terzo del numero di colonne utilizzate durante il primo passaggio. Prime le colonne con 5 ml di tampone di colonna.Lasciare il buffer colonna per passare attraverso la camera superiore.
  14. Poiché il volume di sospensione cellulare sarà molto maggiore, applicare uniformemente 1.000 ml di sospensione cellulare per ogni colonna e consentire la sospensione di passare attraverso la camera superiore della colonna prima reintegro con altri 1.000 ml.
  15. Una volta che la sospensione cellulare è stato completamente applicato al secondo turno di colonne, lavare 2-3 volte con 3 ml di tampone colonna.
  16. Rimuovere ogni colonna e metterlo sopra un tubo da 15 ml sterile. Aggiungere 5 ml di tampone colonna e precipitare il buffer utilizzando lo stantuffo di plastica che viene fornito con la colonna. Immergendo sarà rimuovere le cellule legate li rilasciano dalla colonna.
  17. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 12-15 min. Il pellet deve apparire compatta.
  18. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 ml di mezzi di OPC proliferazione pre-riscaldato (supporto di base OPC integrato con PDGF-AA 20 ng / ml).
  19. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Piastra le cellule. Diluire le cellule a 60.000 cellule / ml con i media OPC proliferazione. In ogni nero, chiaro fondo 24 bene, pipetta 500 ml di cellule lungo il lato del pozzo per ottenere 30.000 cellule per pozzetto. Mescolare le cellule agitando la piastra orizzontale con una figura otto movimento. Se l'esecuzione del saggio in 48, 96, o 384 pozzetti, aggiungere 15.000, 7.500, o 1.500 cellule per pozzetto, rispettivamente. Questi numeri possono essere regolati a seconda dei singoli di targa.
  20. Preparare un piatto a parte per il giorno 0 colture di controllo della linea di base. Questo piatto di controllo deve essere fissato con paraformaldeide al 4% come descritto nel paragrafo 5.7, quando viene avviata la differenziazione al giorno 0.
  21. Cultura le cellule in proliferazione OPC supporti a 37 ° C per 3 giorni con nessun cambiamento media.

5. L'induzione di OPC Differenziazione e fissazione con paraformaldeide al 4%

Nota: Durante il test l'effetto di piccole molecole su oligodendrogenesis, abbiamo quotidianamente dissolve farmaci in dimetilsolfossido (DMSO) per preparare 1,000x stock che possono poi essere conservati a -80 ° C e diluita direttamente nei mezzi di SATO per ottenere una concentrazione finale di 0,1% DMSO. Abbiamo osservato nessun cambiamento sia OPC proliferazione o la differenziazione utilizzando questa concentrazione di DMSO (dati non mostrati).

  1. Pre-caldo supporto di base OPC a 37 ° C e scongelare le scorte di trattamento farmacologico a temperatura ambiente. Quando si eseguono trattamenti in doppio, allestire circa 1,25 ml di media per ogni gruppo di trattamento in una provetta da 1,5 ml. Per i campioni in triplicato, usare 2 tubi ml centrifuga per tenere conto di gioco.
  2. Preparare il master mix di trattamento per i pozzi repliche diluendo le scorte di trattamento direttamente nel supporto di base OPC. Brevemente vortex o mescolare delicatamente ciascun mastermix assicurare una distribuzione omogenea del trattamento.
  3. Preparare 45 nM triiodotironina (T 3) come controllo positivo e il veicolo appropriato come controllo negativo. Diluire 10 mm t 3 stock1: 1.000 in 1 ml di supporti di base OPC e poi ulteriormente diluito nel master mix trattamento per ridurre la concentrazione finale di DMSO se necessario.
  4. Aspirare il supporto dal gruppo un trattamento pozzetti di coltura alla volta in modo da evitare l'essiccazione delle cellule. Utilizzare una punta della pipetta 200 microlitri sull'estremità della pipetta Pasteur di vetro per evitare raschiando nero materiale dalle pareti del pozzo e nella cultura.
  5. Aggiungere lentamente 500 ml di mastermix trattamento lungo il lato del pozzetto usando una pipetta 1 ml.
  6. Incubare le culture per il periodo di tempo desiderato, eseguendo uno scambio completo dei media con i media di trattamento freschi ogni 2-3 giorni. Noi abitualmente osserviamo un 30-40% MBP + cultura dopo 4 giorni nei media differenziazione.
  7. Alla fine del periodo di trattamento desiderato, preparare freschi 4% paraformaldeide (PFA) o scongelare uno stock congelati a temperatura ambiente. ATTENZIONE: PFA è estremamente tossico e deve essere preparato in una cappa aspirante.
  8. Aspirare i media e aggiungere lentamente 4001; l di PFA al lato del pozzetto per fissare le cellule. Incubare la piastra per 20 min a temperatura ambiente.
  9. Aspirare il PFA e aggiungere lentamente 500 ml di sterile D-PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) al lato del pozzo per lavare le cellule. Ripetere il lavaggio per un totale di altre due volte. Non aspirare il lavaggio finale.
  10. Avvolgere il piatto in parafilm e conservare a 4 ° C per la successiva elaborazione o procedere direttamente alla fase successiva. Le piastre possono essere conservate per diverse settimane.

6. Immunocitochimica e la quantificazione di proteina basica della mielina

Nota: Quando si eseguono le procedure di gestione dei liquidi nei 24 pozzetti, si consiglia di lavorare velocemente per evitare l'essiccamento delle cellule. Qui, si raccomanda l'utilizzo di un aspiratore multicanale e pipetta multicanale.

  1. Portare la piastra a temperatura ambiente, aspirare i pozzetti, e aggiungere 250 ml di D-PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) contenente 0,1% Triton X-100 e 5%siero di capra normale (NGS). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente orbitale.
  2. Preparare la soluzione di incubazione primaria diluendo il mouse monoclonale anti-MBP anticorpi 1: 1.000 e l'anticorpo policlonale di coniglio anti-actina 1: 200 in D-PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) contenente 5% NGS. In alternativa, policlonale di coniglio anti-Olig2 a 1: 1.000 può essere utilizzato per oligodendrociti normalizzazione specifico in colture gliali miste. Preparare la soluzione primaria sufficiente per ospitare 250 microlitri per bene.
  3. Incubare gli anticorpi primari a 4 ° C durante la notte per 16-18 ore agitando delicatamente orbitale.
  4. Aspirare la soluzione di incubazione primaria e lavare le cellule 3 x 10 min con 500 ml di D-PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) a temperatura ambiente agitando delicatamente orbitale.
  5. Mentre ci si lava la piastra, preparare la soluzione di incubazione secondaria diluendo anti-topo 680 e anti-coniglio 800 anticorpi 1: 500 in D-PBS (con Ca 2+ 2+) contenente 5% NGS. Ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambientale durante la preparazione di questa soluzione.
  6. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 250 ml di soluzione di incubazione secondaria. Proteggere la piastra dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente orbitale.
  7. Aspirare la soluzione di incubazione secondaria e lavare i pozzetti 3 x 10 min con 500 ml di D-PBS (con Ca 2+ e Mg 2+) a temperatura ambiente agitando delicatamente orbitale.
  8. Eseguire la scansione del piatto utilizzando un sistema di imaging in grado di rilevare 700 nm e 800 nm emissioni di fluorescenza. Come punto di partenza, impostare l'offset a 3 e sensibilità a 1,5 per MBP, 5.0 per actina, e 3.5 per Olig2 focale. Regolare i valori di sensibilità come necessario per evitare la sovraesposizione del segnale.
  9. Quantificare l'entità del oligodendrogenesis con metodi basati su software semi-automatici.
    1. Utilizzando il software, impostare la modalità di analisi piatto a "24 Well" e allineare i cerchi intorno tegli perimetro esterno dei pozzi sottoposti a scansione. Impostare il canale di normalizzazione a "800" ed esportare le intensità totali e relativi fluorescenza per il 700 nm (MBP) e 800 nm (Olig2 / actina) canali.
    2. Dividere la intensità a 700 nm per l'intensità a 800 nm per l'espressione MBP normalizzata in unità di fluorescenza relativa. Calcolare la media di misurazioni ripetute e scalare l'espressione al giorno 0 controlli + PDGF come necessario per l'analisi.

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Representative Results

OPC A2B5-positivi vengono isolati attraverso la selezione delle cellule positivo utilizzando un sistema di separazione della colonna magnetica. Prima della procedura di isolamento, l'intero cervello viene rimosso da cuccioli di ratto che sono tra P5 e P7. Una volta che l'intero cervello si stacca con successo dal cranio, bulbi olfattivi e del cervelletto vengono rimossi con pinza chirurgica sottili (Figura 1A). Per isolare tessuto corticale cerebrale ipotalamo, talamo e mesencefalo vengono asportati mediante accurata dissezione (Figura 1B). Successivamente, l'ippocampo e striato vengono rimossi con piegate pinza chirurgica (Figura 1C - D). Il processo di isolamento elimina in modo efficace le cellule meningee e fibroblasti, ma digestione enzimatica viene migliorata quando meningi e vasi vengono rimossi (Figura 1E). Infine, blocchi di tessuto 1 mm x 1 mm sono preparati per le successive fasi di tessuto dissociazione (figure 1F).

Un buon isolamento OPC dovrebbe tradursi in un pellet di cellule compatta dopo la fase di centrifuga finale (Figura 2A). Una volta placcato queste culture saranno relativamente privo di detriti cellulari se visto sotto un microscopio (Figura 2B). Un isolamento ottimale può causare un grande e soffice pellet per la presenza di grandi quantità di detriti cellulari. Questi detriti aderisce fortemente al recipiente PLL rivestite e può interferire con la cultura (Figura 2C). Se una grande e soffice pellet materializza, può aiutare per risospendere le cellule in 10 ml di PBS e ripetere la centrifuga finale per 10 minuti a <300 x g. Una volta che l'isolamento è completa, la purezza delle colture può essere valutata mediante citometria di flusso per identificare la percentuale di cellule A2B5-positive. Un isolamento di successo dovrebbe tradursi in un pool di cellule che sono> positiva 95% per A2B5 (Figura 2D - F). Rispetto alle cellule colorate con un anticorpo colorante fluorescente coniugato anti-A2B5, le cellule non colorati devono apparire come una popolazione negativa e può essere utilizzato come riferimento di base per gating. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la selezione di OPC con riferimento ai rendimenti A2B5 antigene culture che macchiano positivo per PDGFRα da immunocitochimica 11.

Come dimostrato da immunocitochimica, OPC all'inizio del trattamento (giorno 0) sono Olig2 + / MBP - mentre le cellule sono Olig2 + / MBP + by Day 4 (figura 3). La confluenza ottimale di OPC e oligodendrociti al giorno 0 e 4 ° giorno sono mostrati in immagini in campo chiaro rappresentative (figura 4a). L'assenza di espressione MBP al giorno 0 serve come base per la quantificazione oligodendrogenesis. differenziazione spontanea a seguito di recesso PDGF-AA serve come controllo negativo, mentre 45 nM ormone tiroideo (triiodothyronine; T3) può essere utilizzato come controllo positivo 11,15. Quetiapina, noto anche come Seroquel, e clemastine, noto anche come Tavist, sono farmaci che hanno dimostrato di accelerare in vitro oligodendrogenesis e può essere utilizzato come ulteriori controlli positivi 16,17 approvato dalla FDA. La figura 4B mostra un rappresentante a due canali a infrarossi scansione fluorescente dimostrare i risultati attesi per ciascuna di queste condizioni, in triplice copia. segnali actina e MBP sono stati pseudocolored verde e rosso, rispettivamente, in modo che le culture altamente differenziate appaiono giallo in fusione di immagini. I risultati mostrano che MBP espressione al 4 ° giorno nella condizione PDGF ritiro è stato 4,5 ± 1,4 volte superiore rispetto al giorno 0, mentre i cambiamenti piega in MBP a causa di un trattamento con ormone tiroideo, quetiapina, e clemastine erano 33,9 ± 4.1, 33.4 ± 1.0 , e 32,8 ± 0,5 rispettivamente (Figura 4C). La robustezza e l'accuratezza del test sono dimostrate dal smtutte le deviazioni standard tra i campioni in triplo e il grande finestra di attivazione di trattamento che si trova a circa 20 deviazioni standard al di sopra del controllo di ritiro PDGF.

Mentre actina serve come gene di riferimento affidabile per la normalizzazione in culture oligodendrociti, geni di riferimento alternativi possono anche essere utilizzati. Olig2 è un fattore di trascrizione nucleare che è costitutivamente espresso in cellule della linea oligodendrociti. Il modello specifico e costitutiva espressione pertanto può fornire una strategia di normalizzazione più preferibile in situazioni coltura eterogenee. Figura 5 mostra che nelle culture OPC dissociati con 10 nM ormone tiroideo, la variazione piega calcolata MBP espressione rispetto al PDGF recesso è lo stesso quando utilizzando Olig2 o actina per la normalizzazione. Presumibilmente, poiché le culture OPC in questo esperimento erano molto pura, entrambe le proteine ​​possono essere usate in modo affidabile per la normalizzazione. Tuttavia, abbiamo often osservare una piccola popolazione di cellule Olig2-negativo per 4 ° giorno, ma il rapporto di questa popolazione alla popolazione Olig2-positivo non sembra differire in modo significativo tra il ritiro PDGF e T3 gruppo trattato. Così, la piega-modifiche non sono interessati. Dato uno scenario in cui un trattamento può causare proliferazione di tipi cellulari OLIG2-negativo, la scelta di anticorpi normalizzazione deve essere attentamente valutata.

Figura 1
Figura 1:.. Rat procedura di dissezione del cervello descrizione graduale della procedura di dissezione Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: analisi di citometria a flusso di isolatoOPC. (A) dopo la purificazione della colonna magnetica, la popolazione cellulare associato è immerso dalla colonna e centrifugati a formare una pallina compatta. La quantità di detriti è indicata dalla dimensione del pellet. (B) Se il pellet è compatto, allora detriti sarà minimo nella cultura. (C) un pellet grandi e soffici in genere si traduce in una cultura di detriti pesanti. La purezza della coltura è determinata mediante citometria a flusso utilizzando un anticorpo A2B5 anti-topo topo che è coniugato con APC. (D) Le cellule morte e detriti sono esclusi dall'analisi, come mostrato nella scatter e side scatter trame in avanti. (E) La popolazione positiva A2B5 può essere determinata utilizzando una macchia controllato come riferimento di base per gating. (F) OPC isolate con successo dovrebbe essere> positiva 95% per A2B5. Cliccate qui per viewa più grande versione di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Cultura OPC e la procedura di differenziazione La fluorescenza-scansione (DIFS) saggio dual-infrarossi inizia con OPC ratto isolatedA2B5-positivo di fresco placcato in recipienti di coltura PLL rivestite (3 ° giorno). Tali colture sono moltiplicate per 3 giorni in presenza di 20 ng / ml PDGF-AA, e poi trattati con fattori sperimentali a supporto PDGF-free fresco il giorno 0. supporti trattamento è completamente rifornito il giorno 2, le cellule vengono fissate con paraformaldeide al 4% il giorno 4. Immunocitochimica per Olig2 (verde) e MBP (rosso) è stato eseguito su colture rappresentative al giorno 0 e 4 ° giorno usando Dapi (blu) come una macchia contatore nucleare. Queste culture mostrano colorazione costitutiva per la padella oligodendrociti lignaggio marker delle cellule Olig2 nei giorni 0 e 4, mentre la colorazione per il marcatore oligodendrociti maturo MBP è solo evident dal giorno 4. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: quantificazione MBP usando il saggio di fluorescenza di scansione dual-infrarossi (DIFS) (A) La densità delle culture OPC al giorno 0 e 4 ° giorno necessari per ottimizzare le prestazioni del test.. (B) Rappresentante scansioni fluorescenza dual-infrarossi. OPC sono stati differenziati in piastre da 24 pozzetti per 4 giorni in presenza di 45 nM T3, 1 mM quetiapina, 1 mM clemastine, o 0,1% DMSO in triplicato. Un piatto separato contenente OPC che sono stati fissati al giorno 0 (+ PDGF) è stato elaborato in parallelo. Actina (pseudocolored verde) e MBP (pseudocolored rosso) sono stati quantificati simultaneamente utilizzando uno scanner Odyssey Licor impostato per rilevare 700 nm e 800 nm emissioni. ( Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Olig2 è una proteina di riferimento affidabile per normalizzare espressione MBP in oligodendrociti OPC sono state differenziate in triplicato in presenza di 10 nM T3 o controllo del veicolo 0,1% DMSO a 24 pozzetti per 4 giorni.. Il test dual-infrarossi fluorescenza a scansione è stata effettuata utilizzando anti-Olig2 o anticorpi primari anti-actina per la normalizzazione. Olig2 / actina e MBP sono stati quantificati simultaneamente utilizzando uno scanner Odyssey Licor impostato per rilevare 700 nm e 800 nm emissioni. espressione MBP c'erarmalized a uno Olig2 o espressione di actina, e risultati sono stati scalati al controllo DMSO 0,1%. Le unità relativa fluorescenza media ± DS sono state tracciate utilizzando GraphPad Prism 6. I risultati mostrano che la calcolata pieghevole cambiamento è lo stesso quando la normalizzazione di uno dei due proteine ​​di riferimento.

Figura 6
Figura 6:. Effetto di Triton X-100 sul MBP colorazione OPC erano differenziati in piastre da 24 pozzetti per 4 giorni in presenza di 45 nM T3 o 0,1% DMSO. Le colture sono state poi fissate con 4% PFA e colorate per Olig2 e MBP utilizzando due diversi protocolli di immunocitochimica. Per il campione di alta Triton X-100, le cellule sono state permeabilizzate per 1 ora con 0,4% Triton X -100 e tutte le fasi di incubazione anticorpi sono stati eseguiti in presenza di 0,1% Triton X-100. Per il campione bassa Triton X-100, le cellule sono state permeabilizzate per 1 ora con 0,1% Triton X-100, mentre Antiboincubazioni dy state eseguite senza Triton X-100. Olig2 e MBP sono stati visualizzati con fluorescenti secondari e immagini a colori coniugati sono stati acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza basato su telecamera. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo presentato qui descrive un metodo veloce e affidabile per isolare OPC ratto e quantificare in oligodendrogenesis vitro in risposta a fattori sperimentali. Utilizzando selezione positiva, alte rese di OPC vitali e puri sono utilizzati direttamente a fini sperimentali. Questo metodo semplifica l'isolamento, la coltura, e passi differenziazione in un arco di tempo 1 Settimana, e cellule fissate possono essere convenientemente conservato a 4 ° C per diverse settimane senza alcuna perdita di sensibilità del test.

Uno dei principali vantaggi con saggi di fluorescenza scanner-based è che l'acquisizione e l'analisi dei dati è notevolmente accelerato rispetto a tecniche di microscopia tradizionali basati su telecamere. Anche se la microscopia è stata utilizzata con successo in schermi high-throughput per identificare induttori di differenziazione OPC, l'acquisizione dei dati è intrinsecamente più lento perché richiede la programmazione di sequenze di acquisizione delle immagini, diverse ore di raccolta dei dati, l'analisi di centinaia di thousands di file di immagini, e algoritmi definiti dall'utente per distinguere corpi cellulari individuali per la normalizzazione o l'analisi 18,19. Inoltre, con sistemi di microscopia basati su telecamere non è possibile acquisire dati da tutta la superficie del recipiente di coltura. Invece, le immagini rappresentative devono essere catturati da aree differenti all'interno di un singolo bene, che possono portare a bias di posizione e colpisce falsi positivi. In confronto, questo test rileva l'espressione MBP da tutte le cellule all'interno di un determinato bene, e più piastre può essere scansionato contemporaneamente. Mentre questo metodo può essere adattato all'uso in 96 pozzetti o 384 pozzetti formati, la piastra 24 pozzetti può essere preferito quando minor numero di trattamenti vengono testati. Abbiamo osservato che la perdita di cellule nella piastra a 24 pozzetti per utilizzo liquido è ridotto al minimo, che è una complicazione che deve essere considerato nella progettazione esperimenti alto throughput.

Un parametro critico del test è la densità delle celle quando Differentizione è iniziata in occasione della Giornata 0. Culture con troppo poche cellule sembrano differenziarsi più lentamente e muoiono, mentre le culture ad alta densità mostrano differenziazione spontanea. Entrambe le situazioni possono ridurre la gamma dinamica e l'affidabilità del saggio. Per raggiungere un equilibrio ottimale tra la salute delle cellule e la densità cellulare, abbiamo la cultura le OPC per 3 giorni senza uno scambio multimediale o supplementazione di fresco PDGF-AA. Abbiamo ipotizzato che poiché la concentrazione di PDGF-AA nei cali media by Day 3 in vitro (giorno 0) come risultato del catabolismo cellulare, il tasso di proliferazione delle cellule rallenterà tale che la proliferazione è ridotta attraverso il primo giorno del PDGF ritiro AA. Questa tecnica funziona meglio quando le cellule sono distribuiti uniformemente durante la placcatura. Pipettando le cellule lungo il lato del bene e mescolandoli con un movimento figura otto promuova una distribuzione uniforme. Pipettaggio al centro del pozzo tende a produrre gruppi di cellule intorno ai bordi del pozzo con pochecellule er aderenti al centro. Questo fenomeno può essere dovuto alla rottura dello strato PLL recente secco da forze di pipettaggio liquidi. L'accumulo di cellule perimetrali può ridurre la sensibilità del test a causa della differenziazione dipendente dalla densità. È importante notare che le differenze significative di intensità del segnale / Olig2 Actina possono verificarsi tra droga-trattati e di controllo, PDGF culture ritiro. Notevolmente diminuito actina segnale / Olig2 può indicare la tossicità del farmaco, mentre significativo aumento del segnale / Olig2 actina può indicare la proliferazione indotta da farmaci. Normalmente osserva un segnale di actina / Olig2 leggermente superiore da cellule trattate con farmaci pro-differenziazione rispetto ai controlli ritiro PDGF. Noi attribuiamo questa differenza per un più alto tasso di apoptosi spontanea nel gruppo di ritiro PDGF nel corso della procedura di differenziazione di 4 giorni. Nel valutare oligodendrogenesis, normalizzazione del MBP di actina / Olig2 dovrebbe correggere le differenze numero delle cellule. Per valutare toxicittà e la proliferazione da questo test, il MBP anti-anticorpo può essere scambiato per anticorpi primari diretti contro i marcatori appropriati.

Quando esperimenti richiedono sia la valutazione quantitativa e qualitativa, è importante limitare l'esposizione dei ratti oligodendrociti culture fisse a Triton X-100 utilizzando 4% PFA per fissare le cellule. Altri protocolli immunocitochimica per culture oligodendrociti, che tipicamente includono Triton X-100 durante entrambi i passaggi anticorpi incubazione per migliorare l'accessibilità anticorpi epitopo, possono essere utilizzati con successo a seconda delle esigenze sperimentali. D'altra parte, anche se MBP è una proteina intracellulare può essere possibile escludere Triton X-100 tutto se metodi di fissazione alternativi sono impiegati che adeguatamente permeabilize le cellule. Usando le condizioni qui descritte, abbiamo osservato che Triton X-100 colpisce la morfologia osservata degli oligodendrociti e la localizzazione di MBP colorazionequando usato ad alte concentrazioni. Noi non vediamo un calo significativo degli anticorpi colorazione quando Triton X-100 viene omesso dai gradini anticorpi di incubazione. Come mostrato in figura 6, tra 0,4% Triton X-100 in permeabilizzazione e passo di blocco, e 0,1% Triton X-100 durante l'incubazione anticorpo, riduce la rilevazione dei processi mielina e risultati in discontinuo colorazione MBP. Pertanto, per la valutazione quantitativa e qualitativa può essere sufficiente utilizzare una minore concentrazione di Triton X-100 come descritto qui.

Mentre l'uso di OPC A2B5-selezionati da ratti può essere vantaggioso, abbiamo osservato risultati comparabili nel test dual-infrarossi fluorescenza scansione (DIFS) utilizzando OPC A2B5-selezionati da C57BL / 6 topi, anche se la resa delle cellule per il mouse è in genere molto inferiori (dati non mostrati). Altri protocolli per la depurazione OPC possono anche essere compatibili con questo test. Ad esempio, marcatore oligodendrociti O4 può essere utilizzato come antigene per purificare intermediate precursori degli oligodendrociti fase utilizzando sfere magnetiche 20. Come alternativa ai metodi magnetici a base di OPC possono essere arricchiti da antiche culture gliali miste 9 al giorno contenenti astrociti e microglia da hi-velocità orbitale agitazione e di adesione differenziale metodi 21. Inoltre, immuno-panning procedure che incorporano sia la selezione delle cellule negativo e positivo può essere utilizzato se la cultura purezza è preferito rispetto ai rendimenti alta cella 22. Oltre ad esaminare come terapie possono aumentare direttamente la differenziazione delle OPC in colture pure, a volte è necessario prendere in considerazione gli effetti indiretti dei farmaci attraverso altri tipi di cellule in un sistema di co-coltura. Nella SM, l'infiltrazione di cellule T effettrici autoreactive nel sistema nervoso centrale è pensato di svolgere un ruolo nella progressione della malattia 23. cellule T effettrici possono secernere fattori pro-infiammatori che possono inibire la differenziazione delle OPC in siti di demielinizzazione. È quindi di interesse per identificare therapeutics che possono proteggere le OPC e bloccare questi fattori pro-infiammatori da esacerbando lesioni. Il test DIFS può essere ideale per la modellazione di questa attività come le cellule T si sviluppano in sospensione e possono essere lavati via dalla cultura oligodendrociti prima MBP quantificazione. Per gli studi di co-coltura che coinvolgono cellule aderenti come i neuroni, astrociti e microglia, Olig2 normalizzazione può essere impiegato per raccogliere i dati dai oligodendrociti in particolare. Così, la flessibilità del test DIFS può facilitare una varietà di disegni sperimentali.

In conclusione, questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per quantificare la oligodendrogenesis di OPC ratto A2B5-positivi in vitro. Questo metodo di isolamento garantisce sempre alte rese di OPC vitali che sono sensibili ai segnali di differenziazione stabiliti. analisi sensibile può essere eseguita in vasi di formato multi-pozzetto utilizzando una varietà di paradigmi sperimentali, che estende l'utilità di questo sistema many diverse applicazioni. Inoltre, il test DIFS può essere adattato per il vaglio di farmaci ad alto rendimento, o può essere utilizzato per verificare i risultati delle analisi a basso throughput, come la PCR quantitativa e Western Blot. È importante sottolineare che questo sistema può offrire un mezzo semplice ma efficace per l'identificazione di terapie mirate OPC in malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Concedere sponsor: National Institutes of Health; codice di autorizzazione: R37 NS041435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/ml
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/ml
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/ml
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/ml
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/ml
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/ml
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/ml
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/ml
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/ml
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/ml
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 108 Oligodendrocyte cellule progenitrici oligodendrogenesis A2B5 cytoblot proteina basica della mielina
Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione
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