Utarbeidelse av Rat oligodendrocyte stamfar kulturer og Kvantifisering av Oligodendrogenesis Bruk Dual-infrarød fluorescens skanning
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Effektiv nerveledning i pattedyrsentralnervesystemet (CNS) krever myelinisering av aksoner ved oligodendrocytter. Under utviklingen oppstår oligodendrocytes fra en pool av oligodendrocyte stamceller (OPCs) som er tenkt å migrere fra ventrikulære soner i utviklingsbrain og nevralrøret en. Etter migrasjons OPCs differensieres til modne, myelinerende oligodendrocytter som ikke bare legge til rette for effektiv impuls forplantning, men også gi aksoner med trofisk støtte to. Den voksne CNS opprettholder en rik bestand av OPCs som er spredt over hele grå og hvit substans som utgjør ca 5-8% av alle celler 3. Etter en demyeliniserende fornærmelse, OPCs migrere til skadestedet, spre seg, og skille for å erstatte tapte eller ødelagte myelin hylser på utsatte aksoner. Men i noen sykdom / skade innstillinger, er denne prosessen funnet å være ineffektiv eller kan mislykkes fullstendig fire. Menskronisk demyelinisering er tenkt å legge til byrden av sykdom, effektiv oligodendrogenesis og remyelinisering kan lindre symptomene 5. Det har derfor vært av interesse å studere OPCs in vitro for å bestemme effekten av eksperimentelle faktorer på oligodendrogenesis.
Innsikt i de ulike faser av oligodendrocytt differensiering har blitt gjort mulig ved identifikasjon av scenen spesifikke cellemarkører. Selv fornye tidlige stamceller er definert av deres uttrykk av plate avledet vekstfaktor reseptor alfa (PDGFRα), neural / glia antigen 2 (NG2) og A2B5 6-8. Som OPCs initiere deres differensiering program og trekke seg fra cellesyklus, de nedregulere uttrykket av disse markørene og begynne å uttrykke proteiner som indikerer premyelinating oligodendrocytes inkludert Syklisk-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) og O4. Til slutt, deres differensiering i mer modne oligodendrocytes er kjennetegnet ved ekspresjon av myelin-assosierte proteiner, inkludert myelin-assosiert glykoprotein (MAG), proteolipidprotein (PLP), og myelin basisk protein (MBP). MBP-prosessoren er en intracellulær perifert membranprotein og en hovedkomponent i myelinlaget. Mus som mangler MBP utvikle en alvorlig fenotype der CNS myelination er betydelig redusert som fører til skjelvinger, kramper og tidlig død 9,10. Denne viktige rollen av MBP i myelinisering har ført til dens anvendelse som en markør for oligodendrocytt differensiering både in vitro og in vivo 11.
Kvantifisering av MBP kan oppnås ved hjelp av flere forskjellige metoder. RT-PCR og Western blot analyse tillater kvantifisering av MBP nivåer under forskjellige behandlingsregimer. Immunocytochemistry er en vanlig kvalitativ tilnærming som også kan være kvantitativ når kamerabaserte mikros tilnærminger brukes. Selv om disse systemene er pålitelig og grunnleggende forstudiet av oligodendrocytt differensiering, de har sine egne ulemper som begrenser deres anvendelse i legemiddel-screening. Først, mengden av primære OPCS som er nødvendig for RT-PCR og Western blot-analyse reduserer antallet variabler som kan undersøkes samtidig. Mens celle kravet for immunocytokjemi er mye lavere, må betydelig tid være viet til hvert eksperiment hvis kvantifisering er målet. Mange bilder må fanges og deretter kvantifisert til rette for eksperimentell analyse. Disse begrensningene blitt viktige hindringer for å vurdere for studier som krever høy gjennomstrømning vurdering. Her beskriver vi en fremgangsmåte som anvender grunnleggende trekk fra både immunocytokjemi og Western blot-metoder for kvantifisering myelin, samtidig som betydelig reduserer både antallet celler som kreves, og tid til å fullføre kvantitativ analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver en rask og pålitelig metode for isolering av rotte OPCS og kvantifisering av in vitro oligodendrogenesis som svar på eksperimentelle faktorer. Ved hjelp av positiv utvelgelse, er høy avkastning av levedyktige og rene OPCs brukes direkte for eksperimentelle formål. Denne fremgangsmåte strømlinjeisolasjons, dyrkning, og differensieringstrinn inn i en uke en tidsramme, og fikserte celler kan hensiktsmessig lagret ved 4 ° C i flere uker uten noe tap i analysesensitiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gi sponsor: National Institutes of Health; Grant Nummer: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
