Introduction
Эффективное нервной проводимости в центральной нервной системе млекопитающих (ЦНС) требует миелинизации аксонов путем олигодендроцитов. Во время разработки, олигодендроциты возникает из совокупности клеток олигодендроцитов предшественников (OPCS), которые считаются мигрировать из желудочковой зоны развивающегося переднего мозга и нервной трубки 1. После миграции OPCs дифференцироваться в зрелые, myelinating олигодендроцитов, что не только способствует эффективному распространению импульса, но и обеспечить аксоны с трофической поддержки 2. Взрослых ЦНС содержит обильные население OPCs, что разбросаны по всему серого и белого вещества, содержащего примерно 5-8% всех клеток 3. После демиелинизирующих оскорбление, OPCs мигрируют к месту повреждения, размножаются, и дифференцируются, чтобы заменить утраченные или поврежденные миелиновые оболочки на открытых аксонов. Тем не менее, в некоторых ситуациях болезнь / травмы, этот процесс оказывается неэффективным или может не полностью 4. В то время какхронический демиелинизация думали, чтобы добавить к бремени болезней, эффективного oligodendrogenesis и ремиелинизации может облегчить симптомы 5. Поэтому было интересно изучить OPCs в пробирке, чтобы определить влияние экспериментальных факторов на oligodendrogenesis.
Понимание различных этапах олигодендроцитов дифференциации стало возможным путем идентификации стадии конкретных клеточных маркеров. Самообновляющихся ранние клетки-предшественники определяются их экспрессии, полученный из тромбоцитов альфа рецептора фактора роста (PDGFRα), нейронная / глии антиген 2 (NG2) и A2B5 6 - 8. Как OPCs инициировать их дифференциации программы и вывести из клеточного цикла, они подавляют экспрессию этих маркеров и начинают экспрессировать белки, свидетельствующие о premyelinating олигодендроциты включая циклические нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNPase) и O4. Наконец, их дифференциация в более зрелом oligodendrocytes характеризуется экспрессией миелиновых белков, ассоциированных, в том числе миелиновой-ассоциированный гликопротеин (MAG), протеолипидного белка (PLP), и основного белка миелина (ОБМ). МВР является внутриклеточным периферической мембранным белком и является основным компонентом миелиновой оболочки. Мыши, лишенные MBP разработать тяжелый фенотип, в которых ЦНС миелинизации значительно снижается, ведущий к тремор, судороги и ранней смерти 9,10. Это важная роль MBP в миелинизации привело к его использованию в качестве маркера олигодендроцитов дифференциации в пробирке и в естественных условиях 11.
Количественное определение MBP может быть достигнуто с использованием нескольких различных методик. ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга позволяют количественно оценить уровни ОБМ при различных схемах лечения. Иммуноцитохимическая является общей качественный подход, который также может быть количественным, когда используются подходы микроскопии камеры на основе. Хотя эти системы являются надежными и фундаментальное значение дляизучение олигодендроцитов дифференциации, каждый из них имеет свои собственные недостатки, которые ограничивают их использование в скрининге лекарственных. Во-первых, количество первичных OPCs, которые необходимы для ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализа снижает количество переменных, которые могут быть рассмотрены одновременно. В то время как требование ячейка для иммуноцитохимию значительно ниже, существенное время должно быть посвящено каждого эксперимента, если количественное и есть цель. Многочисленные изображения должны быть захвачены, а затем количественно для облегчения анализа экспериментальных. Эти оговорки стали важными препятствиями, которые следует учитывать для исследований, которые требуют высокую оценку пропускную способность. Здесь мы описываем способ, который использует основные аспекты от обоих иммуноцитохимию и западных методик блоттинга для миелина количественного, при этом значительно снижая как количество клеток, необходимых и времени, чтобы завершить количественный анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, связанные с предметов животного были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) и Джона Хопкинса Школе медицины.
1. Подготовка Планшеты исходные растворы и OPC медиа базу
Примечание: Крыса OPC базовые (Sato) СМИ, описанные здесь, была получена из ранее опубликованных исследований 12,13. Альтернативные препараты СМИ могут также быть совместимы с этой процедурой.
- Ресуспендируют поли-L-лизин (PLL) до концентрации 10 мкг / мл в стерильной деионизированной воде. Внесите 400 мкл разбавленного PLL в каждую лунку черной стеной, ясно нижней 24 и тканей класса культура блюдо.
- Coat блюда культуры тканей в течение 2 часов в 37 ° C культуре ткани инкубатор или на ночь в 4 ° C холодильнике.
- Аспирируйте PLL из блюд с покрытием не менее 20 мин до обшивки. Разрешить оставшиеся PLL высохнуть из колодца путем размещения 24-луночные планшеты с крышкой частично приоткрыта в тканевой культурекапот. Убедитесь, что лунки полностью высохнуть, прежде чем покрытие изолированных OPCs. Клетки не будет придерживаться пластика, который имеет жидкую PLL подарок.
- Подготовьте N-Ацетил-L-цистеин (NAC) маточного раствора (1,000x): Растворить 100 мг N-ацетил-L-цистеин (NAC) в 20 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- Подготовьте гидрокортизон маточного раствора (1,000x): Добавить 1 мл этанола до 1 мг гидрокортизона и водоворот, чтобы растворить. Добавить 19 мл DMEM, перемешать раствор, аликвоты и хранят при -20 ° С. Добавление гидрокортизона к базовой сред было показано для повышения выживаемости клеток глии 14.
- Подготовьте D-Биотин маточного раствора (5,000x): Растворить 2,5 мг Д-биотин в 50 мл PBS. Добавьте 1-2 х 5 мкл капель 0,1 N NaOH, чтобы помочь в растворения. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- Подготовьте Инсулин маточного раствора (100x): Растворить 25 мг Инсулин в 50 мл очищенной воды тканевой культуральной. Добавить 250 мкл OF 1 N HCl и перемешивают до раствор не станет прозрачным. Стерилизация с фильтром 0,22 мкм и хранят при температуре 4 ° С в течение до 6 недель.
- Подготовьте Sato маточного раствора (100x):
- Подготовьте прогестерона маточного раствора (25 мкг / мкл): Растворить 2,5 мг прогестерона в 100 мкл этанола.
- Подготовьте селенит натрия маточного раствора (400 нг / мкл): Растворить 4 мг селенита натрия в 100 мкл 0,1 N NaOH. Добавьте 10 мл DMEM и перемешать.
- К 100 мл DMEM, добавляют 1 г человеческой апо-трансферрина, 1 г бычьего сывороточного альбумина и 160 мг путресцина и перемешать до полного растворения. Добавить 25 мкл исходного раствора прогестерона, 1000 мкл селенит натрия маточного раствора, и перемешать. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- Подготовьте OPC медиа базу: на 100 мл DMEM (с 4,5 г / л D-глюкозы, L-глутамина, и 110 мг / л пирувата натрия), добавьте 100 мкл NAC 100 мкл гидрокортизон, 20 мкл D-биотин, 1 мл инсулина, 1 мл Сато складе, 100 мкл микроэлементы B,2 мл B-27 добавка (50x), и 1 мл пенициллина / стрептомицина (100х). Стерилизация с фильтром и магазина 0,22 мкм при 4 ° С.
- Подготовьте PDGF-AA маточного раствора (1,000x): Растворить 250 мкг в 12,5 мл PBS с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы сделать 20 мкг раствора / мл. Алиготе и хранить при температуре -80 ° C.
- Подготовьте OPC носитель пролиферации: OPC базовые дополненной 20 нг / мл PDGF-AA.
- Подготовьте OPC среде для дифференцировки: OPC базовых дополненной 45 нМ трийодтиронина.
- Подготовьте буфер столбец: К 500 мл PBS, добавить 2,5 г BSA и 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и доведения рН до 7,2. Стерилизация с фильтром и магазина 0,22 мкм при 4 ° С.
2. мозга крысы Препарирование
Примечание: щенки P5-P7 крысы используются в данном протоколе. Каждый крысят кора дает примерно 1,5-2,0 × 10 6 A2B5 положительных клеток.
- Стерилизовать все рассечение оборудование, используя 2506 С подогревом шарик стерилизатор.
- Добавить 15-20 мл ФБР (без Ca 2+ и Mg 2+) до 50 мл конические пробирки. Один 50 мл коническую трубку достаточно для 3-4 крысят коры. Поместите 50 мл конические пробирки на льду. Используйте 50 мл конические пробирки провести нарезанный кубиками коры ткани во время вскрытия.
- Добавить холодным ФСБ в 10 см чашку Петри. Это блюдо будет использоваться для рассечения под световым микроскопом.
- Жертвоприношение крысят путем декапитации с большими хирургическими ножницами. Спрей голову с 70% этанола.
- Выписка весь мозг
- Использование маленькие ножницы порезать кожу вниз по средней линии и за ушами и очистить кожных лоскутов обратно. Вырезать череп вниз среднюю линию, начиная с мозга и заканчивая глазами. Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком далеко, чтобы сохранить структуру основного коры.
- Сделать две боковые порезы уступает мозжечка, вставив небольшие хирургические ножницы в затылочное отверстие. Сделать дополнительный разрез между глазами, муравейerior к обонятельной луковицы.
- Аккуратно снимите каждую половину черепа обратно. Удалить весь мозг и место в 10 см чашке Петри заполнены холодной PBS.
- Под рассечение световом микроскопе, удалить обонятельные луковицы и мозжечок с мелкими хирургическими щипцами.
- Флип мозг таким образом, что вентральная поверхность видна в световом микроскопе.
- Использование тонких прямые щипцы выполнить тупым путем размещения закрытые щипцы советы между корой и гипоталамуса на глубину около 2/3 мозга. После щипцы на месте позволяют концы, чтобы открыть. Повторите для другой полушарии.
- Дразнить кору от гипоталамуса и среднего мозга регионов.
- Удалить гипоталамус, таламус, а средний мозг, удерживая средний мозг на ее задней поверхности и шелушение его к переднему концу мозга. Север передние соединения.
- Удалить гиппокамп от пилинг его наружу, а затем разрывая ее связь скора с использованием тонких изогнутых рассечение пинцет.
- Удалить остатки полосатое тело, избавляясь его от основной коры в наружу диагонали движения с использованием тонких изогнутых рассечение пинцет.
- Очистить все кровеносные сосуды и мозговые оболочки из вентральной поверхности коры.
- Флип мозг таким образом, что верхняя сторона видна. Мозговых оболочек и кровеносных сосудов должны быть очевидны. Пил оболочек от подстилающей коры с использованием тонких рассечение пинцет. Начало пилинг из обонятельной месте крепления лампы.
- Полный шаги 2.4-2.14 в общей сложности 3-4 крысят.
- Поместите 3-4 расчлененный крысят кору в сухую чашку Петри и нарезать стерилизованной лезвием до 1 мм х 1 мм куски не будут достигнуты. Собрать ткань путем промывки блюдо с PBS с одного 50 мл коническую пробирку (шаг 2) Затем поместите обратно на лед.
3. Ферментативный-механический ткани Диссоциация
Примечание: На этом этапе, рекомендуется комплект нейронная диссоциации папаин основе. Используя NeУральский диссоциация Kit (P), специальные шаги, которые являются оптимальными для выделения OPC описаны.
- Подготовьте первую диссоциации фермент разбавлением фермента P с соответствующим буфером. Содержимое каждой 50 мл коническую (1 образец) будет ресуспендировали в общей сложности 1,950 мкл смеси ферментов. Место в ферментной смеси в бане с температурой 37 ° в течение 10 мин.
1 Примеры: 1,900 мкл буфера + 50 мкл фермента папаина - Спин всех 50 мл конические пробирки, содержащие 3-4 кубиками щенок кору крыс при 300 мкг в течение 3 мин.
- Аспирируйте супернатант и добавить 1950 мкл ферментного раствора к каждому пробирку и распадаются осадок от переворачивания пробирки и встряхивая осторожно.
- Инкубируйте в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 15 мин с вращением непрерывной трубки.
- В течение последних 5 мин инкубации, подготовить второй фермент смесь А. Развести фермента в его соответствующем буфере. В общей сложности 30 мкл будут добавленыКаждому 50 мл коническую пробирку.
1 Образец: 20 мкл буфера + 10 мкл фермента - После инкубации завершена добавить 30 мкл второго фермента смеси в каждую пробирку и инвертировать перемешать.
- Используя стеклянную пипетку Пастера, прикрепленный к контроллеру пипетки, механически отделить ткань с помощью пипетки в 10-15 раз или до кусочки ткани уменьшаются в размерах и раствор стал мутным. Возвращение образца на 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 15 мин при непрерывном вращении.
- Внесите каждой ткани гомогенат Sample 10-15 раз с помощью 1 мл пипетки.
- Внесите каждой ткани гомогенат Sample 15-20 раз с помощью 200 мкл пипетки
- Возвращение все образцы в 37 ° C культуре ткани инкубаторе в течение 10 мин при непрерывном вращении.
- Добавьте 10 мл PBS (с Са 2+ и Mg 2+) к каждому образцу и фильтровать гомогената через 40 мкм поры фильтра помещенном над 50 мл трубка. Промыть фильтр с дополнительными 1-2 мл PBS.
- Бассейн все образцы гомогенатов в один 50 мл коническую пробирку и приобретают общую подсчет клеток.
- После выполнения подсчет клеток, разделить гомогената равномерно в 15 мл конические пробирки (1 пробирка для каждого образца). Центрифуга в течение 10-12 мин при 300 х г.
4. Анти-A2B5 бисера Применение, колонны очистки, и покрытие
- Выполните вычисления для буфера столбца и анти-A2B5 микросфер. Добавить 7 мкл буфер столбец за каждый 1 × 10 6 клеток. Добавить 2 мкл анти-A2B5 микрошарики на каждый 1 × 10 6 клеток.
- Зерноуборочный всех образцах путем ресуспендирования клеток в общем объеме 10 мл колоночного буфера и центрифуге при 300 мкг в течение 10-12 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в соответствующем количестве колоночного буфера, рассчитанный на шаге 4.1. Если осадок большой и рыхлый, только добавить примерно половину объема буфера колонку, чтобы держать антиТело в соответствующей концентрации в клеточной взмучивания.
- Инкубируйте клеточной суспензии в течение 10 мин при 4 ° С.
- Добавить анти-A2B5 микрошарики (вычисленное на этапе 4.1), инвертировать несколько раз и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30-60 мин. Аккуратно переверните трубку несколько раз через каждые 10 мин. Более длительное время инкубации может повысить урожайность клеток, но может увеличить неспецифическое связывание.
- Добавьте 5 объемами колоночного буфера. Если клетки ресуспендировали в объеме 1 мл, добавляют 5 мл колоночного буфера, тогда как, если клетки ресуспендируют в 2 мл, добавляют 10 мл колоночного буфера.
- Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г в.
- Определите, сколько LS колонки будут нужны для очистки. Одна колонка LS является достаточным для 15-20 х 10 6 общего числа клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1000 мкл буфера колонку в колонке LS используется.
- Prime каждый столбец LS добавлением 5 мл колоночного буфера. Сбор поток через в 50 мл коническую трубку. После того, как бу столбцовffer полностью проходить через верхнюю камеру, применяются 1,000 мкл клеточной суспензии в каждой колонке и позволяют клеткам проходить через самотеком.
Примечание: Если плотность клеток слишком высок, колонна может работать медленно. - Сразу же после клеточную суспензию прошла через колонку, медленно добавить 3 мл колоночного буфера для каждого столбца, чтобы промыть несвязанных клеток. Если мыть легко проходит через колонку (1 капле на каждый 30-45 сек), мыть два дополнительных раза с 3 мл колоночного буфера.
- Удалить каждую колонку и поместить его на коническую трубку 15 мл. Добавьте 5 мл колоночного буфера и погрузить буфер через колонку с высокой скоростью, используя пластиковую поршень, содержащийся с колонкой. Погружаясь будет сместить связанные клетки выпускать их из колонки.
- Увеличение чистоты, запустив образца через второй раунд LS колонок. Используйте одну треть число столбцов, используемых во время первого прохода. Премьер столбцы с 5 мл буфера столбца.Разрешить буфер столбец проходить через верхнюю камеру.
- Поскольку объем клеточной суспензии будет значительно больше, равномерно распределить 1000 мкл клеточной суспензии в каждой колонке и дать суспензии проходить через верхнюю камеру колонки, прежде чем пополнение с дополнительными 1000 мкл.
- После того, как клеточная суспензия была полностью применяется ко второму раунду колонн, мыть 2-3 раза с 3 мл буфера столбца.
- Удалить каждую колонку и поместите его над стерильной 15 мл коническую трубку. Добавьте 5 мл буфера столбца и погрузить буфер, используя пластиковую поршень, который в комплекте с колонки. Погружаясь будет сместить связанные клетки выпускать их из колонки.
- Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 12-15 мин. Осадок должен появиться компактный.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5-10 мл подогретого СМИ OPC пролиферации (OPC базовые дополненной PDGF-AA 20 нг / мл).
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Пластина клеток. Развести клетки до 60000 клеток / мл с массовой информации OPC пролиферации. В каждую черный, прозрачным дном 24 и, пипетки 500 мкл клеток вдоль стороны скважины для получения 30000 клеток на лунку. Смешайте клетки путем встряхивания пластины горизонтально с помощью восьмерку движение. При выполнении анализа в 48, 96 или 384-луночных планшетах, добавить 15000, 7500, или 1500 клеток на лунку, соответственно. Эти числа могут быть отрегулированы в зависимости от индивидуальных спецификации плит.
- Подготовьте отдельную тарелку для культур базовый контроля день 0. Этот контроль пластина должна быть фиксировали 4% параформальдегидом, как описано в разделе 5.7, когда дифференциация инициируется на день 0.
- Культуры клеток в OPC СМИ пролиферации при 37 ° С в течение 3 дней без смены носителя.
5. Индукция OPC дифференциации и фиксации 4% параформальдегидом
Примечание: При тестировании влияние малых молекул на oligodendrogenesis, мы обычно dissolvе препараты в диметилсульфоксиде (ДМСО), чтобы подготовить 1,000x запасы, которые затем могут быть сохранены при -80 ° C и разбавленные непосредственно в SATO сред для получения конечной концентрации 0,1% ДМСО. Мы не наблюдали никаких изменений ни в одном OPC пролиферации или дифференцировки использовании этого концентрацию ДМСО (данные не показаны).
- Предварительно теплой OPC база СМИ до 37 ° С и оттепели запасы лечения наркотической зависимости до комнатной температуры. При выполнении процедуры в двух экземплярах, подготовить около 1,25 мл среды на группу лечения в 1,5 мл трубки. Для трех образцов с помощью 2 мл емкость центрифужные пробирки для учета слабину.
- Подготовьте лечения мастер смеси для повторных скважин путем разбавления акции лечения непосредственно в OPC базовой СМИ. Кратко вихрь или осторожно перемешать каждый Mastermix чтобы обеспечить однородное распределение лечения.
- Подготовьте 45 Нм трийодтиронин (Т 3) в качестве положительного контроля и соответствующей транспортном средстве в качестве отрицательного контроля. Развести 10 мм т 3 акции1: 1000 в 1 мл OPC базовых сред, а затем дополнительно разбавить в мастер лечение смеси, чтобы снизить конечную концентрацию ДМСО в случае необходимости.
- Аспирируйте носитель из культуральной скважин группы один лечения одновременно с тем, чтобы избежать сушки клетки. Используйте 200 мкл пипетки наконечник на конце стеклянной Пастера пипетки, чтобы избежать соскабливания черный материал от боковых сторон колодца и в культуре.
- Медленно добавить 500 мкл лечения Mastermix вдоль стороны колодца с использованием 1 мл пипетки.
- Инкубируйте культур для требуемого периода времени, выполняя полную обмен медиа свежей средой лечения каждые 2-3 дня. Мы регулярно наблюдаем 30-40% MBP + культуру после 4 дней в среде для дифференцировки.
- В конце желаемого периода лечения, подготовить свежий 4% параформальдегида (PFA) или оттаивать замороженную запас до комнатной температуры. ВНИМАНИЕ: PFA является чрезвычайно токсичным и должны быть готовы в вытяжном шкафу.
- Аспирируйте СМИ и медленно добавить 4001; л PFA в сторону скважины, чтобы зафиксировать клетки. Инкубируйте планшет в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте PFA и медленно добавить 500 мкл стерильной D-PBS (с Са 2+ и Mg 2+) к стороне скважины промыть клетки. Повторите стирке в общей сложности более двух раз. Не аспирации последней промывки.
- Обертка пластину в парафином и хранить при температуре 4 ° С для последующей обработки или сразу перейти к следующему шагу. Плиты могут быть сохранены в течение нескольких недель.
6. Иммуноцитохимическая и количественное определение основного белка миелина
Примечание: При выполнении процедур обработки жидких в 24-луночные планшеты, рекомендуется работать быстро, чтобы избежать сушки клетки. Здесь рекомендуется использование вакуумного аспиратора многоканальной пипетки и многоканального.
- Доведите пластину к комнатной температуре, аспирации скважин, а также добавить 250 мкл D-PBS (с Са 2+ и Mg 2+), содержащих 0,1% Triton X-100 и 5%нормальной козьей сыворотки (NGS). Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
- Подготовьте первичный инкубационную разбавлением мышиное моноклональное анти-МВР антител 1: 1000 и кроличьи поликлональные анти-актин антитела 1: 200 в D-PBS (с Са 2+ и Mg 2+), содержащий 5% NGS. Альтернативно, кроличье поликлональное антитело против Olig2 на 1: 1,000 могут быть использованы для олигодендроцитов конкретной нормализации в смешанных глиальных культур. Подготовьте достаточно первичную решение для размещения 250 мкл на лунку.
- Инкубируйте первичных антител при 4 ° С в течение ночи для 16-18 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
- Аспирируйте первичный инкубационную и промыть клетки 3 х 10 мин с 500 мкл D-PBS (с Са 2+ и Mg 2+) при комнатной температуре при осторожном встряхивании орбитальной.
- Хотя промывания планшета, подготовить вторичную инкубационную разбавлением анти-мышь 680 и анти-кроличий 800 антител 1: 500 в D-PBS (с Ca 2+ Mg 2+), содержащий 5% NGS. Свести к минимуму воздействие внешней освещенности при подготовке этого решения.
- Аспирируйте окончательной промывки и добавить 250 мкл вторичного раствора инкубации. Защита пластину от света и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном встряхивании орбитальной.
- Аспирируйте вторичную решение инкубации и промывки лунки 3 х 10 мин с 500 мкл D-PBS (с Са 2+ и Mg 2+) при комнатной температуре при осторожном встряхивании орбитальной.
- Сканирование пластины с использованием системы визуализации, способный обнаруживать 700 нм и 800 нм эмиссии флуоресценции. В качестве отправной точки, Установите фокусное смещение 3 и чувствительностью до 1,5 для MBP, 5,0 актина и 3,5 для OLIG2. Отрегулируйте значения чувствительности по мере необходимости, чтобы избежать сигнала передержки.
- Количественной оценки степени oligodendrogenesis используя полу-автоматизированное программное обеспечение на основе методов.
- Использование программного обеспечения, установить режим пластина анализа для "24 скважина» и выровнять круги вокруг тон внешний периметр отсканированных скважин. Установите нормализации канала на "800" и экспортировать общие и относительные интенсивности флуоресценции для 700 нм (MBP) и 800 нм каналах (Olig2 / Актиновые).
- Разделить интенсивность при 700 нм по интенсивности при 800 нм, чтобы дать нормализованное выражение MBP в относительных единицах флуоресценции. Рассчитать среднее повторных измерений и масштабировать выражение в день 0 управления + PDGF мере необходимости для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2B5-положительным OPCs выделяют посредством позитивной селекции клеток с использованием магнитного разделительную систему колонка. До процедуры выделения, весь мозг удаляют из крысят, которые между Р5 и P7. После того, как весь мозг успешно отделен от черепа, обонятельной луковицы и мозжечок удаляют с использованием тонких хирургических щипцов (рис 1а). Для того чтобы выделить церебральную ткани коры гипоталамус, таламус и средний мозг иссекали путем тщательного вскрытия (Фиг.1В). Далее, гиппокамп и полосатое удаляются с помощью изогнутых хирургических щипцов (фиг.1С - D). Способ выделения эффективно устраняет менингеальные и фибробластов клетки, но ферментативное расщепление улучшается, когда мозговые оболочки и сосудистой сети удаляются (рис 1E). Наконец, тканевые блоки 1 мм х 1 мм получают в последующих стадиях ткани диссоциации (рисЮр 1F).
Хороший изоляция OPC должно привести в компактном клеточного осадка после окончательного спин стадии (Фигура 2А). После гальваническим эти культуры будут относительно свободны от клеточного дебриса, если смотреть под микроскопом (рис 2В). Субоптимальный изоляция может привести к большому и пушистый гранулы из-за наличия большого количества продуктов распада клеток. Этот мусор будет сильно прилипать к судна PLL покрытием и может вмешиваться в культуре (рис 2С). Если большое и пушистое осадок материализуется, это может помочь ресуспендирования клеток в 10 мл PBS и повторить окончательного отжима в течение 10 мин при <300 х г. После того, как изоляция является полной, чистота культур может быть оценена с помощью проточной цитометрии, чтобы определить процент A2B5-позитивных клеток. Успешная изоляция должна привести к пула клеток, которые> 95% положительный результат на A2B5 (рис 2D - F), По сравнению с клеток, окрашенных флуоресцентным красителем, конъюгированным анти-A2B5 антитела, неокрашенные клетки должен появиться в качестве отрицательного населения и могут быть использованы в качестве базового эталона для стробирования. Кроме того, мы уже показали, что выбор OPCs использованием выходы A2B5 антиген культур это пятно положительным для PDGFRα иммуноцитохимически 11.
Как показали иммуноцитохимию, OPCs в начале лечения (день 0) являются Olig2 + / MBP - тогда клетки Olig2 + / MBP + по 4-й день (Рисунок 3). Оптимальное конфлуэнтности из OPCs и олигодендроциты в день 0 и 4-й день, приведены в представительных яркие образы поля (рис 4а). Отсутствие экспрессии ОБМ в день 0 служит в качестве основы для количественной oligodendrogenesis. Спонтанной дифференцировки в результате вывода PDGF-AA служит в качестве отрицательного контроля, тогда как 45 нМ гормона щитовидной железы (triiodothyronine; Т3) могут быть использованы в качестве положительного контроля 11,15. Кветиапина, также известный как Seroquel, и клемастин, также известный как Tavist, которые FDA утвержденных препаратов, которые, как было показано, чтобы ускорить экстракорпорального oligodendrogenesis и могут быть использованы в качестве дополнительных положительных контролей 16,17. 4Б показан примерный двухканальный инфракрасный флуоресцентный сканирования демонстрируя ожидаемые результаты для каждого из этих условий в трех экземплярах. Актин и МВР сигналы псевдоцветной зеленый и красный соответственно так, что высоко дифференцированные культуры появляются желтые присоединяемых изображений. Результаты показывают, что экспрессия ОБМ 4 дню в состоянии абстинентного PDGF составила 4,5 ± 1,4 раза выше по сравнению с днем 0, в то время как изменения сгиба в MBP-за лечения гормон щитовидной железы, кветиапин и клемастин были 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 и 32,8 ± 0,5 соответственно (рис 4C). Надежность и точность анализа продемонстрированы на смвсе стандартные отклонения среди тройных образцов и большого окна активации лечения, что составляет около 20 стандартных отклонений выше контроля вывода PDGF.
В то время как актин служит надежной контрольного гена для нормализации в олигодендроцитов культур, также могут быть использованы альтернативные опорные гены. Olig2 является фактором ядерного транскрипции, который конститутивно экспрессируется в клетках олигодендроцитов линии. Его удельный и конститутивный характер экспрессии, следовательно, может обеспечить более предпочтительный стратегию нормализации в гетерогенных ситуациях культуры. На рисунке 5 показано, что в OPC культур дифференцированных с 10 нМ гормона щитовидной железы, рассчитанное раза изменение MBP экспрессии по отношению к изъятию PDGF то же самое при использовании либо Olig2 или актина нормализации. Предположительно, поскольку OPC культур в этом эксперименте были очень чистыми, оба белка может быть надежно использован для нормализации. Тем не менее, мы ofteп наблюдать небольшую популяцию OLIG2-отрицательных клеток День 4, но отношение этого населения к OLIG2-положительным населения, похоже, не сильно отличаются между выводом PDGF и Т3 группе, получавшей. Таким образом, диван-изменения не затрагиваются. Учитывая сценарий, где лечение может привести к распространению OLIG2-отрицательных типов клеток, выбор нормализации антитела должны быть тщательно продуманы.
Рисунок 1:.. Крыса процедура мозг рассечение Поэтапное описание процедуры вскрытия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2: Проточная цитометрия анализ изолированныхOPCs. (А) после очистки магнитного колонке, связанный клеточная популяция погружается из колонны и центрифугировали с образованием компактной осадок. Количество обломков обозначено размере гранул. (B) Если осадок компактно, то мусор будет минимальным в культуре. (С) Большой и пушистый осадок, как правило, приводит к культуре с тяжелой мусора. Чистоту культуры определяется с помощью проточной цитометрии с использованием анти-мышиных антител A2B5, сопряженную с APC. (D) Мертвые клетки и мусор, исключены из анализа, как показано на переднее рассеяние и боковой разброс участков. (Е) Положительный население A2B5 можно определить с помощью неокрашенной пробы в качестве базового эталона для стробирования. (F) Успешно изолированных OPCs должна быть> 95% положительный результат на A2B5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы соперничатьва крупная версия этой фигуре.
Рисунок 3:. OPC культура и порядок дифференциация двойного инфракрасного флуоресцентного сканирования (DIFS) Анализ начинается со свежей isolatedA2B5-положительных OPCs крыс высевали на PLL покрытием сосудов культуры (День 3). Эти культуры распространились в течение 3 дней в присутствии 20 нг / мл PDGF-AA, а затем обрабатывают с экспериментальными факторов в свежем PDGF-свободных СМИ в день 0. Treatment сред полностью пополнены на 2-й день, а клетки фиксировали 4% параформальдегида в день 4. иммуноцитохимию для OLIG2 (зеленый) и МВР (красный) проводили на репрезентативных культур в день 0 и день 4, используя DAPI (синий) в качестве контр пятно ядерной. Эти культуры обладают конститутивной окрашивание на сковороде олигодендроцитов клонов клеток маркера OLIG2 в дни 0 и 4, тогда как окрашивание для зрелого олигодендроцитов маркера МВР только эвидент ко Дню 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4: МВР количественное использованием анализа двойного инфракрасного флуоресцентного-сканирование (DIFS) (А) Плотность OPC культур в день 0 и день 4 требуется для оптимальной производительности анализа.. (Б) Характерные двойного инфракрасные флуоресцентные сканирует. OPCs были дифференцированы в 24-луночные планшеты в течение 4 дней в присутствии 45 нМ T3, 1 мкМ кветиапин 1 мкМ клемастин, или 0,1% ДМСО в трех экземплярах. Отдельная пластина, содержащая OPCs, что были зафиксированы на 0-й день (+ PDGF) был обработан в параллель. Актина (псевдоцветной зеленый) и МВР (псевдоцветной красный) одновременно количественно с помощью сканера Odyssey Licor набор для обнаружения 700 нм и 800 нм выбросов. (
Рисунок 5: Olig2 это надежный белок для нормализации экспрессии ОБМ в олигодендроциты OPCs были дифференцированы в трех экземплярах в присутствии 10 нМ T3 или 0,1% ДМСО управления транспортным средством в 24-луночные планшеты в течение 4 дней.. Анализ двойного инфракрасного флуоресцентного-сканирование проводили с использованием анти-OLIG2 или анти-актина первичных антител для нормализации. Olig2 / актин и МВР были одновременно количественно с помощью сканера Odyssey Licor набор для обнаружения 700 нм и 800 нм выбросов. Выражение MBP не былоrmalized либо OLIG2 или экспрессии актина, и результаты были пересчитаны в контроле ДМСО 0,1%. Средние блоки относительная флуоресценции ± SD строили с применением GraphPad Prism 6. Результаты показывают, что рассчитанное сгиба изменение такое же, при нормализации к одному из двух эталонных белков.
Рисунок 6:. Влияние Тритона Х-100 на MBP окрашивания OPCs были дифференцированы в 24-луночные планшеты в течение 4 дней в присутствии 45 нМ T3 или 0,1% ДМСО. Затем культуры фиксировали 4% PFA и окрашивают в течение Olig2 и МВР с использованием двух различных протоколов иммуноцитохимию. За высокий образец Тритон Х-100, клетки проницаемыми в течение 1 часа 0,4% -ным Triton X -100 и все стадии инкубации антител проводили в присутствии 0,1% Triton X-100. Для низкой образца Тритон Х-100, клетки проницаемыми в течение 1 часа 0,1% -ным Triton X-100, в то время как antiboDy инкубации осуществляли без Triton X-100. Olig2 и МВР были визуализированы с флуоресцентным красителем-сопряженных вторичные и изображения были получены с помощью камеры на основе флуоресцентного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь описывает быстрый и надежный метод для выделения OPCs крыс и количественной экстракорпоральное oligodendrogenesis в ответ на экспериментальных факторов. Используя положительный выбор, высокие урожаи жизнеспособных и чистых OPCs используются непосредственно для экспериментальных целей. Этот метод упрощает выделения, культивирования и шаги дифференцировке в сроки 1 недели, и фиксированные клетки могут быть удобно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель без каких-либо потерь в чувствительности анализа.
Одним из основных преимуществ с помощью сканера на основе флуоресцентных анализов является то, что сбор и анализ данных, что значительно ускорило по сравнению с традиционными методами микроскопии камеры на основе. Хотя микроскопия успешно применяется в экранах с высокой пропускной способностью, чтобы идентифицировать индукторов OPC дифференциации, сбор данных по своей сути медленнее, потому что она требует программирования последовательностей захвата изображения, несколько часов сбора данных, анализ сотен до гоousands файлов изображений и алгоритмов, определяемых пользователем, чтобы различить отдельные органы клеток для нормализации или анализа 18,19. Кроме того, с системами микроскопии камеры на основе это не представляется возможным, чтобы получать данные со всей поверхности культурального сосуда. Вместо этого, представительные изображения должны быть захвачены из разных областей в пределах одной скважины, что может привести к позиционной предвзятости и ложно-положительных хитами. Для сравнения, этот анализ обнаруживает выражение MBP от всех клеток в данной скважине, а также несколько пластин могут быть отсканированы одновременно. Хотя этот метод может быть адаптирован для использования в 96-луночных или 384-луночных форматах, 24-луночный планшет может быть предпочтительным, когда меньше процедуры не проходит проверку. Мы наблюдали, что клеточная гибель в 24-луночный планшет из-за жидкой обработки сведено к минимуму, который является осложнением, что следует учитывать при проектировании экспериментов выше-пропускной.
Критический параметр анализе составляет плотность клеток при differentiвания инициируется в День 0. Культуры с слишком мало клеток появляются, чтобы дифференцировать более медленно и отмирают, а культуры высокой плотности обладают спонтанной дифференцировке. Обе ситуации могут уменьшить динамический диапазон и надежность анализа. Для достижения оптимального баланса между здоровьем клеток и плотности клеток, мы культура в OPCs в течение 3 дней без обмена медиа или добавок свежей PDGF-AA. Мы предположили, что поскольку концентрация PDGF-AA в снижение медиа по 3-й день в пробирке (день 0) в результате клеточного катаболизма, пролиферативная скорость клеток будет медленным, такие, что распространение уменьшается посредством первого дня PDGF- вывод А.А.. Этот метод работает лучше всего, когда эти клетки равномерно распределены во обшивки. Пипетки клетки вдоль стороны колодца и смешивая их с помощью движения восьмерка должна способствовать равномерному распределению. Раскапывание в центре скважины имеет тенденцию производить скопления клеток по краям колодца с немногимиэр клетки, прилипшие к центру. Это явление может быть связано с нарушением свежевысушенную слоя PLL жидкими пипеток сил. Накопление клеток по периметру может снизить чувствительность анализа по причине зависящей от плотности дифференциации. Важно отметить, что существенных различий в интенсивности сигнала / OLIG2 Актина может происходить между обработанными наркотиками и контрольных, культур абстиненции PDGF. Значительно уменьшились актина / сигнал OLIG2 может указывать токсичность препаратов, в то время как значительно увеличилось / Olig2 сигнал актин может указывать пролиферацию медикаментозный. Мы обычно наблюдаем несколько более высокий сигнал актин / OLIG2 из клеток, обработанных про-дифференциации препаратов по сравнению с контрольной абстиненции PDGF. Мы объясняем эту разницу к более высокому уровню спонтанного апоптоза в выводе группы PDGF над процедурой дифференциации 4 дня. При оценке oligodendrogenesis, нормализации MBP с актином / Olig2 должны скорректировать количество клеток различий. Для оценки Toxiгород и пролиферация помощью этого теста, анти-МВР антитела могут быть обменены на первичных антител, направленных против соответствующих маркеров.
При проведении экспериментов требуют как количественную и качественную оценку, важно ограничить воздействие на фиксированных крыс олигодендроцитов культур к Тритон Х-100 при использовании 4% PFA исправить клетки. Другие протоколы иммуноцитохимия для олигодендроцитов культур, которые обычно включают Тритон Х-100 в течение обоих этапов инкубации антитело, чтобы улучшить антитела эпитоп доступности, может быть успешно использован в зависимости от экспериментальных условий. С другой стороны, хотя МВР является внутриклеточным белком может быть возможно исключить Triton X-100 полностью, если альтернативные методы фиксации используются, адекватно клетки проницаемыми. Использование условий, описанных здесь, мы наблюдали, что Тритон Х-100 воздействует на наблюдаемую морфологию олигодендроцитов, а также локализацию MBP окрашиванияпри использовании в высоких концентрациях. Мы не видим значительное снижение меченых антител при Тритон Х-100 будет исключена из этапов инкубации антитела. Как показано на рисунке 6, в том числе 0,4% Тритон Х-100 в проницаемости и стадии блокирования и 0,1% Triton X-100 в ходе инкубации антитело, снижает обнаружение миелиновых процессов и результатов в прерывистом MBP окрашивания. Поэтому для количественной и качественной оценки может быть достаточным, чтобы использовать более низкую концентрацию Triton X-100, как описано здесь.
Хотя использование A2B5-выбран OPCs от крыс может быть выгодным, мы наблюдали сопоставимые результаты в тесте с двойным инфракрасного флуоресцентного-сканирование (DIFS), используя A2B5-выбран OPCs от мышей C57BL / 6, хотя выход клеток на мышь обычно намного нижние (данные не показаны). Другие протоколы для очистки OPC также могут быть использованы для данного анализа. Например, олигодендроцитов маркер О4 могут быть использованы в качестве антигена, чтобы очистить Intermediate предшественники этап олигодендроцитов использованием магнитных шариков 20. В качестве альтернативы магнитных методов, основанных, OPCs может быть обогащен с 9-дневных смешанных глиальных культур, содержащих астроцитов и микроглии от привет скорость орбитальное вращение и дифференциальная адгезии методов 21. Кроме того, иммуно-панорамирование процедуры, которые включают положительные и отрицательные выбор ячейки может быть использован, если чистота культура предпочтительнее, чем доходность 22 высокого клеток. Помимо изучения как терапевтические средства могут напрямую повысить дифференциацию OPCs в чистых культурах, иногда бывает необходимо рассмотреть косвенные эффекты лекарств через другие типы клеток в системе с совместным культивированием. В MS, инфильтрация аутореактивных Т клеток-эффекторов в ЦНС, как полагают, играют определенную роль в прогрессировании заболевания 23. Эффекторные Т-клетки могут секретировать провоспалительные факторы, которые могут препятствовать дифференциации OPCs на участках демиелинизации. Поэтому представляет интерес для выявления Therapeutics что может защитить OPCs и блокируют эти провоспалительных факторов от нагнетания травмы. Анализ DIFS может быть идеальным для моделирования этой деятельности в качестве Т-клетки растут в виде суспензии и может быть смыта с олигодендроцитов культуры до MBP количественной оценке. Для исследований совместного культивирования с участием прилипшие клетки, такие как нейроны, астроциты и микроглии, Olig2 нормализации могут быть использованы для сбора данных из олигодендроцитов конкретно. Таким образом, гибкость анализа DIFS может облегчить разнообразие экспериментальных конструкций.
В заключение, этот протокол обеспечивает быстрый и надежный метод количественного определения oligodendrogenesis из A2B5-положительных OPCs крыс в пробирке. Этот метод изоляции последовательно поставляет высокие урожаи жизнеспособных OPCs, которые реагируют на сигналы установленных дифференцировки. Чувствительный анализ может быть проведен в сосудах формата мульти-луночных использованием разнообразных экспериментальных парадигм, которая простирается полезность этой системы к маNY различных приложений. Кроме того, анализ DIFS могут быть адаптированы для высокопроизводительного скрининга лекарственных средств, или может быть использован для проверки результатов низкого пропускной анализов, таких как количественной ПЦР и Вестерн-блоттинга. Важно отметить, что эта система может предложить простой, но эффективный способ для идентификации OPC целенаправленной терапии в демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Грант спонсора: Национальные институты здравоохранения; Количество Грант: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
