Introduction
Effektiv nervledning i det centrala nervsystemet hos däggdjur (CNS) kräver myelinisering av axoner genom oligodendrocyter. Under utveckling, oligodendrocyter härrör från en pool av oligodendrocyt progenitorceller (OPCs) som är tänkt att migrera från kammarzoner utvecklingshjärnan och neuralrörsdefekter en. Efter migrations OPCs differentiera till mogna, myeliniserande oligodendrocyter som inte bara underlätta en effektiv impuls förökning, men också ge axoner med trofiska stöd 2. Den vuxna CNS upprätthåller en riklig population av OPCs som är spridda över hela grå och vit substans som innefattar cirka 5-8% av alla celler 3. Efter en demyeliniserande förolämpning, OPCs migrera till platsen för skadan, föröka sig och differentiera att ersätta förlorade eller skadade myelinskidorna på utsatta axoner. Men i vissa inställningar sjukdom / skada, är denna process visar sig vara ineffektiva eller kan misslyckas helt 4. Medankronisk demyelinisering tros lägga till sjukdomsbördan, effektiv oligodendrogenesis och remyelinisering kan lindra symtomen 5. Det har därför varit av intresse att studera OPCs in vitro för att bestämma effekten av experimentella faktorer på oligodendrogenesis.
Insikt i de olika faserna av oligodendrocyt differentiering har möjliggjorts genom att identifiera scenen specifika cellmarkörer. Självförnyande tidiga progenitorceller definieras genom deras uttryck av blodplättshärledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα), neurala / glia antigen 2 (NG2) och A2B5 6-8. Som OPC initiera deras differentiering program och dra sig tillbaka från cellcykeln, de nedreglera uttryck av dessa markörer och börjar uttrycka proteiner indikerar premyelinating oligodendrocyter inklusive cyklisk nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNPase) och O4. Slutligen deras differentiering till mognare oligodendrocytes kännetecknas av uttrycket av myelinassocierade proteiner, inklusive myelinassocierat glykoprotein (MAG), proteolipidprotein (PLP), och myelingrundprotein (MBP). MBP är en intracellulär perifert membranprotein och en huvudkomponent i myelinskidan. Möss som saknar MBP utvecklar en allvarlig fenotyp där CNS myelination signifikant minskade leder till skakningar, kramper och tidig död 9,10. Denna viktiga roll MBP i myeline har lett till dess användning som en markör för oligodendrocyt differentiering både in vitro och in vivo 11.
Kvantifiering av MBP kan uppnås med hjälp av flera olika metoder. RT-PCR och Western blot-analys medger kvantifiering av MBP-halter under olika behandlingsregimer. Immunocytokemi är en gemensam kvalitativ metod som också kan vara kvantitativ när kamerabaserade mikroskopi metoder används. Även om dessa system är tillförlitliga och grundläggande förstudiet av oligodendrocyt differentiering, de har alla sina egna nackdelar som begränsar deras användning i läkemedelsscreening. Första, Mängden primära OPCs som behövs för RT-PCR och Western blot-analys reducerar antalet variabler som kan granskas samtidigt. Medan kravet cell för immuncytokemi är mycket lägre, måste avsevärd tid ägnas åt varje experiment om kvantifiering är målet. Ett stort antal bilder måste fångas och sedan kvantifieras för att underlätta experimentell analys. Dessa varningar blivit viktiga hinder att tänka på för studier som kräver hög genomströmning bedömning. Här beskriver vi en metod som utnyttjar grundläggande aspekter från både immunocytokemi och Western blot-metoder för myelin kvantifiering, och samtidigt avsevärt minska både antalet celler som krävs och tid för att slutföra en kvantitativ analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och Johns Hopkins School of Medicine.
1. Beredning av analysplattor, stamlösningar och OPC Base Media
Obs: Råttan OPC bas (Sato) media som beskrivs här har hämtats från tidigare publicerade studier 12,13. Alternativa medier formuleringar kan också vara kompatibla med den här proceduren.
- Resuspendera poly-L-lysin (PLL) till en koncentration av 10 | ig / ml i sterilt avjoniserat vatten. Pipettera 400 | il av den utspädda PLL i varje brunn i en svart-walled, klar botten 24 brunnars vävnadsodlingsgrad skålen.
- Coat vävnadsodlingsskålar under 2 timmar i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator eller över natten i en 4 ° C kylskåp.
- Aspirera PLL från belagda rätter åtminstone 20 min före plätering. Låt återstående PLL att torka ur brunnen genom att placera plattor med 24 brunnar med locket delvis på glänt i en vävnadsodlinghuva. Kontrollera att brunnarna är helt torra innan plätering isolerade OPCs. Celler kommer inte följa plast som har vätska PLL närvarande.
- Förbereda N-acetyl-L-cystein (NAC) stamlösning (1,000x): Lös 100 mg N-acetyl-L-cystein (NAC) i 20 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda Hydrokortison stamlösning (1,000x): Tillsätt 1 ml etanol till 1 mg Hydrokortison och skaka för att lösa. Lägga 19 ml av DMEM, blanda lösningen, alikvot och förvara vid -20 ° C. Tillsatsen av hydrokortison till basen media har visats öka överlevnaden av gliaceller 14.
- Förbereda d-biotin stamlösning (5,000x): Lös 2,5 mg d-biotin i 50 ml PBS. Lägg 1-2 x 5 l droppar 0,1 N NaOH för att hjälpa i upplösningen. Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda Insulin stamlösning (100x): Lös 25 mg Insulin i 50 ml vävnadsodlingsgrad vatten. Lägg 250 pl of 1 N HCl och blanda tills lösningen är klar. Sterilisera med en 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C i upp till 6 veckor.
- Förbereda Sato stamlösning (100x):
- Förbereda progesteron stamlösning (25 mikrogram / l): Lös 2,5 mg progesteron i 100 pl etanol.
- Förbereda natriumselenit stamlösning (400 ng / ul): Lös 4 mg natriumselenit i 100 pl 0,1 N NaOH. Tillsätt 10 ml DMEM och blanda.
- Till 100 ml av DMEM, tillsätt 1 g humant apo-transferrin, 1 g bovint serumalbumin, och 160 mg av putrescin och blanda till fullständig upplösning. Tillsätt 25 pl av progesteronstamlösning, 1,000 pl av natriumselenit stamlösning, och blanda. Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbered OPC Base Media: per 100 ml DMEM (med 4,5 g / L D-glukos, L-glutamin, och 110 mg / L natriumpyruvat), tillsätt 100 l NAC, 100 pl hydrokortison, 20 l d-biotin, 1 ml insulin, en ml Sato lager, 100 pl spårämnen B,2 ml B-27 tillägg (50x), och 1 ml penicillin / streptomycin (100x). Sterilisera med en 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C.
- Förbereda PDGF-AA stamlösning (1,000x): Lös 250 | j, g i 12,5 ml PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) för att göra en 20 | j, g / ml lösning. Alikvotera och förvara vid -80 ° C.
- Förbered OPC spridning media: OPC base media kompletterat med 20 ng / ml PDGF-AA.
- Förbered OPC differentiering media: OPC base media kompletterat med 45 nM trijodtyronin.
- Förbereda kolonnbuffert: Till 500 ml PBS, tillsätt 2,5 g BSA och 2 ml 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och justera pH till 7,2. Sterilisera med en 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C.
2. råtthjärna Dissection
Obs: P5-P7 råttungar används i detta protokoll. Varje råtta valp cortex ger ungefär 1,5 till 2,0 x 10 6 A2B5-positiva celler.
- Sterilisera alla dissektion utrustning med en 2506, C uppvärmd pärla autoklav.
- Lägga 15-20 ml PBS (utan Ca2 + och Mg2 +) till 50 ml koniska rör. En 50 ml koniskt rör är tillräcklig för 3-4 råtta pup cortex. Placera 50 ml koniska rör på is. Använd 50 ml koniska rör för att hålla tärnade cortex vävnad under dissektion.
- Tillsätt kallt PBS till en 10 cm petriskål. Denna maträtt kommer att användas för dissekering under ljusmikroskop.
- Offra råttungar genom halshuggning med stora kirurgiska saxar. Spray huvud med 70% etanol.
- Utdrag Helhjärnstänkande
- Använda en liten sax skära in i huden ner mittlinjen och bakom öronen och skal hud klaffar tillbaka. Skär kraniet ner mittlinjen med början från hjärnstammen och slutar vid ögonen. Var noga med att inte skära för djupt för att bevara strukturen av den underliggande cortex.
- Gör två sido snitt sämre än lillhjärnan genom att sätta små kirurgiska saxar i foramen magnum. Gör en extra snitt mellan ögonen, anterior till de lukt glödlampor.
- Dra försiktigt varje halva av kraniet tillbaka. Ta bort hela hjärnan och placera i 10 cm petriskål fylld med kall PBS.
- Enligt dissektion ljusmikroskop, ta bort lukt glödlampor och lillhjärnan med fina kirurgiska pincett.
- Vänd hjärnan så att den ventrala ytan syns under ljusmikroskop.
- Med fin raka pincett utföra en trubbig dissektion genom att placera slutna pincett tips mellan cortex och hypotalamus till ett djup om 2/3 av hjärnan. När pincett är på plats tillåter ändarna öppna. Upprepa för den andra halvklotet.
- Retas cortex från hypotalamus och mitthjärnan regioner.
- Avlägsna hypotalamus, talamus och mellanhjärnan genom att hålla mellanhjärnan vid dess bakre yta och skalar den mot den främre änden av hjärnan. Avskilja de främre anslutningarna.
- Ta hippocampus genom pealing det utåt och sedan bryta sin anslutning tillcortex med fina böjda dissektion pincett.
- Ta bort återstående striatum genom skrotning den från den underliggande cortex i en utåtriktad diagonal rörelse med fina böjda dissektion pincett.
- Rensa alla blodkärl och hjärnhinnorna från ventrala ytan av hjärnbarken.
- Vänd på hjärnan så att den dorsala ytan är synlig. Hjärnhinnorna och blodkärl borde vara uppenbart. Skal hjärnhinnorna från den underliggande cortex med fina dissektion pincett. Börja skalar från luktloben fäst plats.
- Komplett steg från 2,4 till 2,14 för totalt 3-4 råttungar.
- Placera 3-4 dissekerade råtta pup cortex i en torr petriskål och hugga med en steriliserad rakblad tills en mm x 1 mm bitar uppnås. Samla in vävnad genom att skölja skålen med PBS från en 50 ml koniskt rör (steg 2) sedan placera tillbaka på is.
3. Enzymatisk och mekaniska vävnadsdissociering
Obs! För det här steget är ett papain-baserade neurala dissociation kit rekommenderas. med Neural Dissociation Kit (P), är särskilda åtgärder som är optimala för OPC isolering beskrivits.
- Förbered första dissociation enzymet genom att späda enzymet P med lämplig buffert. Innehållet i varje 50 ml konisk (1 prov) kommer att utspätt med totalt 1,950 il enzymblandning. Plats i enzymblandningen i ett 37 ° C bad under 10 min.
1 Exempel: 1.900 il buffert + 50 pl papain enzym - Snurra alla 50 ml koniska rör som innehåller 3-4 tärnade råttunge cortex vid 300 xg under 3 min.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 1,950 | il enzymlösning till varje provrör och bryta isär pelleten genom att vända röret och lätt skakning.
- Inkubera i en 37 ° C vävnadskultur inkubator under 15 min med kontinuerligt rör rotation.
- Under den sista 5 min av inkubationen, förbereda den andra enzymblandning A. Späd enzymet i dess lämplig buffert. Totalt 30 pl kommer att läggastill var och en 50 ml koniskt provrör.
1 Prov: 20 pl Buffert + 10 | j, l av enzym - När inkubationen är avslutad tillsätts 30 | il av den andra enzymblandning till varje rör och invertera att blanda.
- Med användning av ett glas pasteurpipett fäst till en pipett controller, mekaniskt dissociera vävnaden genom att pipettera 10-15 gånger eller tills vävnaden bitar minskas i storlek och lösningen har blivit grumlig. Återgå provet till 37 ° C vävnadskultur inkubator under 15 min med kontinuerlig rotation.
- Pipett varje vävnad homogenatet prov 10-15 gånger med hjälp av en 1 ml pipett.
- Pipett varje vävnad homogenatet prov 15-20 gånger med hjälp av en 200 l pipett
- Returnera alla prover till 37 ° C vävnadskultur inkubator under 10 min med kontinuerlig rotation.
- Tillsätt 10 ml PBS (med Ca2 + och Mg2 +) till varje prov och filtrera homogenatet genom en 40 | im por-filter placeras över en 50 ml röret. Skölj filtret med ytterligare 1-2 ml PBS.
- Pool alla homogenatet prov i en 50 ml koniska rör och få en övergripande celltal.
- Efter att ha utfört celltal, dela homogenatet jämnt i 15 ml koniska rör (1 rör för varje prov). Centrifugera i 10-12 minuter vid 300 x g.
4. Anti-A2B5 Bead Application, kolonnrening och plätering
- Utföra beräkningar för kolonnbuffert och anti-A2B5 mikropärlor. Lägg 7 l kolonnbuffert för varje 1 x 10 6 celler. Tillsätt 2 pl Anti-A2B5 mikrokulor för varje 1 x 10 6 celler.
- Kombinera alla av proverna genom att återsuspendera cellerna i en total volym av 10 ml av kolonnbuffert och centrifugera vid 300 xg under 10-12 min.
- Resuspendera cellpelleten i den lämpliga mängden av kolonnbuffert som beräknats i steg 4,1. Om pelleten är stort och löst, bara lägga ungefär hälften av volymen av kolonnbuffert för att hålla antikroppen vid lämplig koncentration i cell resuspension.
- Inkubera cellsuspensionen under 10 min vid 4 ° C.
- Lägg anti-A2B5 mikropärlor (beräknat i steg 4,1), invertera flera gånger och inkubera vid 4 ° C under 30-60 min. Vänd försiktigt röret flera gånger varje 10 min. Längre inkubationstider kan öka cellutbyten men kan öka icke-specifik bindning.
- Tillsätt 5 volymer av kolonnbuffert. Om cellerna återsuspenderas i en volym av 1 ml, tillsätt 5 ml kolonnbuffert, medan om cellerna återsuspenderades i 2 ml, tillsätt 10 ml av kolonnbuffert.
- Centrifugera i 10 min vid 300 x g.
- Bestäm hur många LS kolumner kommer att behövas för rening. En LS kolumnen är tillräcklig för 15-20 x 10 6 celler totalt.
- Resuspendera cellpelleten i 1000 ^ il kolonnbuffert per LS-kolonn som används.
- Prime varje LS-kolonn genom att tillsätta 5 ml av kolonnbuffert. Samla flödet genom i ett 50 ml koniskt rör. När kolumn buffer helt har passerat genom den övre kammaren, tillämpa 1000 pl av cellsuspensionen till varje kolonn och tillåta cellerna att köra igenom av tyngdkraften.
Obs: Om densiteten av celler är för hög, kan kolonnen köra långsamt. - Omedelbart efter det att cellsuspensionen har passerat genom kolonnen, tillsätt långsamt 3 ml kolonnbuffert till varje kolumn för att tvätta de obundna cellerna. Om tvätt lätt körs genom kolonnen (en droppe för varje 30-45 sek), tvätta ytterligare två gånger med 3 ml kolonnbuffert.
- Ta bort varje kolumn och placera den på en 15 ml koniskt rör. Tillsätt 5 ml kolonnbuffert och störta bufferten genom kolonnen med en snabb hastighet med hjälp av plastkolv som är förpackad med kolonnen. Skär kommer rubba de bundna cellerna frisätter dem från kolonnen.
- Öka renhet genom att köra provet genom en andra omgång av LS kolumner. Använda en tredjedel av det antal kolumner som används under den första passagen. Prime kolonnerna med 5 ml av kolonnbuffert.Låt kolonnen buffert för att passera genom den övre kammaren.
- Eftersom volymen av cellsuspensionen kommer att bli mycket större, jämnt gälla 1000 il cellsuspension till varje kolumn och tillåta suspensionen att passera genom den övre kammaren av kolonnen före påfyllning med ytterligare 1000 il.
- När cellsuspensionen har helt tillämpas den andra omgången av kolonner, tvätta 2-3 gånger med 3 ml kolonnbuffert.
- Ta bort varje kolumn och placera den över en steril 15 ml koniska rör. Tillsätt 5 ml kolonnbuffert och störta bufferten med användning av plastkolv som är förpackad med kolonnen. Skär kommer rubba de bundna cellerna frisätter dem från kolonnen.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 12-15 min. Pelleten bör visas kompakt.
- Resuspendera cellpelleten i 5-10 ml förvärmda OPC proliferation media (OPC base media kompletterade med PDGF-AA 20 ng / ml).
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Plate cellerna. Späd cellerna till 60.000 celler / ml med OPC proliferation media. In i varje svart, klar botten 24 väl, pipet 500 pl celler längs sidan av brunnen för att erhålla 30.000 celler per brunn. Blanda cellerna genom att skaka plattan horisontellt med hjälp av en åtta rörelse. Om analysen utförs i 48, 96 eller 384-brunnsplattor, lägg 15.000, 7500, eller 1500 celler per brunn, respektive. Dessa siffror kan justeras beroende på individuella platt specifikationer.
- Förbered en separat platta för Dag 0 baslinjen kontrollodlingar. Denna kontrollplatta bör fastställas med 4% paraformaldehyd som beskrivs i avsnitt 5.7, när differentieringen initieras på dag 0.
- Kultur cellerna i OPC spridning media vid 37 ° C under 3 dagar utan media förändring.
5. Induktion av OPC Differentiering och Fixering med 4% paraformaldehyd
Anmärkning: Vid provning av effekten av små molekyler på oligodendrogenesis, vi rutinmässigt dissolve droger i dimetylsulfoxid (DMSO) för framställning av 1,000x lager som sedan kan lagras vid -80 ° C och späddes direkt i SATO media för att erhålla en slutlig koncentration av 0,1% DMSO. Vi har observerat några förändringar i vare sig OPC proliferation eller differentiering med hjälp av denna koncentration av DMSO (data ej visade).
- Pre-varm OPC bas media till 37 ° C och tina missbruksbehandling lager till rumstemperatur. När du utför behandlingar i två exemplar, förbereda ca 1,25 ml av media per behandlingsgrupp i ett 1,5 ml rör. För trippelprover, använd 2 ml kapacitet centrifugrör till svars för slack.
- Förbered behandlings huvudmixarna för replikatbrunnar genom att späda behandlingslager direkt in OPC bas media. Kortfattat virvel eller blanda försiktigt varje mastermix att säkerställa en jämn fördelning av behandlingen.
- Förbered 45 nM trijodtyronin (T3) som den positiva kontrollen och den lämpliga fordon som den negativa kontrollen. Späd 10 mM T3 lager1: 1000 i 1 ml OPC basmedium och sedan ytterligare späda i behandlings Master Mix för att reducera den slutliga koncentrationen av DMSO vid behov.
- Aspirera media från odlingsbrunnar en behandlingsgrupp i taget för att undvika torkning av cellerna. Använda en 200 | j, l pipett spets på änden av glas Pasteur-pipett för att undvika skrapning av svart material från sidorna av brunnen och i kulturen.
- Tillsätt långsamt 500 ^ il behandlings mastermix längs sidan av brunnen med användning av en 1 ml pipett.
- Inkubera kulturerna för den önskade tidsramen, utför en fullständig media utbyte med färska behandlingsmedier var 2-3 dagar. Vi observerar rutinmässigt 30-40% MBP + kultur efter 4 dagar i differentieringsmedia.
- Vid slutet av den önskade behandlingsperioden, bered nya 4% paraformaldehyd (PFA) eller tina en frusen lager till rumstemperatur. VARNING: PFA är extremt giftigt och måste beredas i ett dragskåp.
- Aspirera media och tillsätt långsamt 4001; l av PFA till sidan av brunnen för att fixera cellerna. Inkubera plattan under 20 min vid rumstemperatur.
- Aspirera PFA och tillsätt långsamt 500 | il av steril D-PBS (med Ca2 + och Mg2 +) på sidan av brunnen för att tvätta cellerna. Upprepa tvätta totalt två gånger till. Behöver inte aspirera den slutliga tvätten.
- Linda plattan i parafilm och förvara vid 4 ° C för senare bearbetning eller gå direkt till nästa steg. Plattorna kan lagras under flera veckor.
6. Immuncytokemi och kvantifiering av myelinbasprotein
Obs: När du utför procedurer vätskehanterings i plattor med 24 brunnar, rekommenderas att arbeta snabbt för att undvika uttorkning cellerna. Här, är användning av en flerkanals vakuumsug och flerkanals pipett rekommenderas.
- Föra plattan till rumstemperatur, aspirera brunnarna och tillsätt 250 | il av D-PBS (med Ca2 + och Mg2 +) innehållande 0,1% Triton X-100 och 5%normalt getserum (NGS). Inkubera plattan vid rumstemperatur under 1 h med försiktig orbital skakning.
- Förbereda den primära inkubationen lösning genom utspädning musmonoklonal anti-MBP-antikropp 1: 1000 och kanin polyklonal anti-Actin antikropp 1: 200 i D-PBS (med Ca2 + och Mg2 +), som innehöll 5% NGS. Alternativt, kanin polyklonal anti-Olig2 på 1: kan 1000 användas för oligodendrocyt specifik normalisering i blandade gliaceller kulturer. Förbered tillräckligt primära lösning för att rymma 250 pl per brunn.
- Inkubera primära antikroppar vid 4 ° C över natten för 16-18 timmar med varsam orbital skakning.
- Aspirera den primära inkubationen lösningen och tvätta cellerna tre x 10 min med 500 pl D-PBS (med Ca2 + och Mg2 +) vid rumstemperatur med försiktig orbital skakning.
- Medan tvätta plattan, förbereda den sekundära inkubation lösning genom att späda anti-mus 680 och anti-kanin 800-antikroppar 1: 500 i D-PBS (med Ca2 + 2+) innehållande 5% NGS. Minimera omgivande ljusexponering vid utarbetandet av denna lösning.
- Aspirera den slutliga tvättningen och tillsätt 250 pl sekundär inkubation lösning. Skydda plåten från ljus och inkubera det vid rumstemperatur under 1 timme med varsam orbital skakning.
- Aspirera sekundära inkubationslösningen och tvätta brunnarna 3 x 10 min med 500 pl D-PBS (med Ca2 + och Mg2 +) vid rumstemperatur med försiktig orbital skakning.
- Skanna plattan med hjälp av ett bildsystem som kan detektera 700 nm och 800 nm fluorescensemissioner. Som utgångspunkt ställa in fokus offset till 3 och känslighet till 1,5 för MBP, 5,0 för aktin, och 3,5 för Olig2. Justera känslighetsvärden som behövs för att undvika signalexponering.
- Kvantifiera omfattningen av oligodendrogenesis med användning av semi-automatiserade mjukvarubaserade metoder.
- Med hjälp av programvaran, sätta plattan analysläge till "24 Well" och rikta cirklar runt tHan yttre omkretsen av de skannade brunnarna. Ställ normalisering kanal till "800" och exportera den totala och relativa fluorescensintensiteter för 700 nm (MBP) och 800 nm (Olig2 / aktin) kanaler.
- Dividera intensiteten vid 700 nm av intensiteten vid 800 nm för att ge den normaliserade MBP uttryck i relativa fluorescensenheter. Beräkna medelvärdet av upprepade mätningar och skala uttryck för Dag 0 + PDGF kontroller som behövs för analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A2B5-positiva OPCs isoleras genom positiv cellselektion med hjälp av en magnetisk kolonn separationssystem. Före isoleringsförfarandet, är hela hjärnan avlägsnades från råttungar som är mellan P5 och P7. När hela hjärnan framgångsrikt fristående från skallen, är lukt glödlampor och lillhjärnan avlägsnas med fina kirurgiska pincett (Figur 1A). För att isolera cerebral kortikal vävnad hypotalamus, talamus och mellanhjärnan excideras genom noggrann dissektion (Figur 1B). Därefter hippocampus och striatum avlägsnades med användning av böjda kirurgisk tång (Figur 1C - D). Isolerings process eliminerar effektivt meningeal och fibroblastceller, men enzymatisk spjälkning förbättras när hjärnhinnorna och kärl avlägsnas (Figur 1E). Slutligen vävnadsblock av 1 mm x 1 mm förberedd för de efterföljande vävnadsdissociering steg (Figure 1F).
En bra OPC isolering bör resultera i en kompakt cellpellet efter slutcentrifugering steg (Figur 2A). Gång pläterade dessa kulturer kommer att vara relativt fri från cellrester när den betraktas under ett mikroskop (Figur 2B). En suboptimal isolering kan resultera i en stor och fluffig pellets på grund av närvaron av stora mängder cellulärt skräp. Detta skräp kommer att vidhäfta kraftigt till PLL-belagda kärl och kan störa odlingen (figur 2C). Om en stor och fluffig pellet realiseras kan det hjälpa att resuspendera cellerna i 10 ml PBS och upprepa slutcentrifugering under 10 minuter vid <300 x g. När isoleringen är klar, kan bedömas renheten av kulturerna genom flödescytometri för att identifiera andelen A2B5-positiva celler. En framgångsrik isolering bör resultera i en pool av celler som är> 95% positiva för A2B5 (Figur 2D - F). Jämfört med celler färgade med ett fluorescerande färgämne-konjugerad anti-A2B5 antikropp, bör ofärgade celler visas som en negativ befolknings och kan användas som en baslinje referens för gating. Dessutom har vi tidigare visat att valet av OPCs med användning av de A2B5 antigen avkastningar kulturer som färgas positivt för PDGFRα genom immuncytokemi 11.
Vilket framgår av immunocytokemi, OPCs vid början av behandlingen (dag 0) är Olig2 + / MBP - medan celler är Olig2 + / MBP + vid dag 4 (figur 3). Den optimala konfluens av OPCs och oligodendrocyter vid dag 0 och dag 4 visas i representativa ljusa fält bilder (Figur 4A). Frånvaron av MBP uttryck vid dag 0 tjänar som en grund för att kvantifiera oligodendrogenesis. Spontan differentiering till följd av PDGF-AA indragning tjänar som en negativ kontroll, medan 45 nM sköldkörtelhormon (triiodothyronine; T3) kan användas som en positiv kontroll 11,15. Quetiapin, även känd som Seroquel och klemastin, även känd som Tavist är FDA-godkända läkemedel som har visat sig accelerera in vitro oligodendrogenesis och kan användas som extra positiva kontroller 16,17. Figur 4B visar ett representativt två-kanals IR fluorescerande scan visar de förväntade resultaten för vart och ett av dessa villkor i tre exemplar. Aktin och MBP signaler pseudocolored grönt och rött respektive så att mycket differentierade kulturer visas gul i sammanslagna bilder. Resultaten visar att MBP uttryck på dag 4 i PDGF tillbakadragande tillstånd var 4,5 ± 1,4 gånger högre jämfört med dag 0, medan faldiga förändringar i MBP på grund av behandling med sköldkörtelhormon, quetiapin, och klemastin var 33,9 ± 4,1, 33,4 ± 1,0 och 32,8 ± 0,5 respektive (Figur 4C). Robust och analysens noggrannhet demonstreras av smalla standardavvikelser mellan de triplikatprover och den stora behandlingsaktiveringsfönster som är cirka 20 standardavvikelser ovanför PDGF indragning kontroll.
Medan aktin fungerar som en tillförlitlig referens genen för normalisering i oligodendrocyt kulturer, kan alternativa referens gener också användas. Olig2 är en nukleär transkriptionsfaktor som konstitutivt uttrycks i celler av oligodendrocythärkomst. Dess specifika och konstitutiv uttrycksmönster därmed kan ge en mer föredra normalisering strategi i heterogena kultur situationer. Figur 5 visar att i OPC kulturer differentierade med 10 nM sköldkörtelhormon, är den beräknade faldig förändring i MBP uttryck i förhållande till PDGF indragning samma vid användning av antingen Olig2 eller Actin för normalisering. Förmodligen, eftersom OPC kulturer i detta experiment var mycket ren, båda proteinerna kan användas tillförlitligt för normalisering. Vi emellertid often observera en liten population av Olig2-negativa celler vid dag 4, men förhållandet mellan denna population till Olig2 positiva populationen verkar inte skilja sig avsevärt mellan PDGF tillbakadragande och T3 behandlade gruppen. Således är de fold-changes påverkas inte. Med tanke på ett scenario där en behandling kan orsaka spridning av Olig2-negativa celltyper, bör valet av normalisering antikropp noga övervägas.
Figur 1:.. Råtthjärna dissektion förfarande Stegvis beskrivning av dissektion förfarande Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödescytometrianalys av isoleradeOPCs. (A) efter magnetisk kolonnrening, är den bundna cellpopulationen plunged ut ur kolonnen och centrifugerades för att bilda en kompakt pellet. Mängden skräp indikeras av storleken av pelleten. (B) Om pelleten är kompakt, då skräp kommer att vara minimala i kulturen. (C) En stor och fluffig pelleten resulterar typiskt i en kultur med tungt skräp. Renheten av odlingen bestäms genom flödescytometri med användning av en rått-anti-mus-A2B5 antikropp som är konjugerad till APC. (D) Döda celler och debris exkluderas från analysen, som visas i framåtspridning och sidospridningsdiagram. (E) Den A2B5 positiva befolkningen kan bestämmas med hjälp av en ofärgad samplas som en baslinje referens för gating. (F) framgångsrikt isolerade OPCs bör vara> 95% positiva för A2B5. Klicka här för att tävlawa större version av denna siffra.
Figur 3:. OPC kultur och differentiering förfarande med dubbla infraröda fluorescens-scanning (DIFS) analys börjar med färskt isolatedA2B5-positiv råtta OPCs pläterade på PLL-belagda odlingskärl (dag 3). Dessa kulturer prolifereras under 3 dagar i närvaro av 20 ng / ml PDGF-AA, och behandlades sedan med experimentella faktorer i färskt PDGF fria medier på dag 0. Behandling media är helt fylls på dag 2 och cellerna fixeras med 4% paraformaldehyd på dag 4. Immuncytokemi för Olig2 (grön) och MBP (röd) utfördes på representativa kulturer vid dag 0 och dag 4 med användning av Dapi (blå) som en nukleär räknare fläck. Dessa kulturer uppvisar konstitutiv färgning för pannan oligodendrocythärkomst cellmarkör Olig2 dag 0 och 4, medan färgning för den mogna oligodendrocyt markör MBP är bara evident av Dag 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: MBP kvantifiering med hjälp av dubbla infraröda fluorescens-scanning (DIFS) analys (A) densitet OPC kulturer vid dag 0 och dag 4 krävs för optimal analysprestanda.. (B) Representativa dubbla infraröda fluorescens skanningar. OPCs differentierades i plattor med 24 brunnar under 4 dagar i närvaro av 45 nM T3, 1 | iM quetiapin, 1 | iM klemastin, eller 0,1% DMSO i triplikat. En separat platta innehållande OPCs som fixerades på dag 0 (+ PDGF) bearbetades parallellt. Aktin (pseudocolored grönt) och MBP (pseudocolored röd) sattes samtidigt kvantifierades med användning av en Licor Odyssey scanner inställd för att detektera 700 nm och 800 nm utsläpp. (
Figur 5: Olig2 är en pålitlig referensprotein för att normalisera MBP uttryck i oligodendrocyter OPCs differentierades i tre exemplar i närvaro av 10 nM T3 eller 0,1% DMSO fordonskontroll i plattor med 24 brunnar under 4 dagar.. Den dubbla infraröd fluorescens-scanning analys utfördes med användning av anti-Olig2 eller anti-aktin primära antikroppar för normalisering. Olig2 / aktin och MBP samtidigt kvantifieras med hjälp av en Licor Odyssey skanner inställd för att detektera 700 nm och 800 nm utsläpp. MBP uttryck var ingenrmalized till antingen Olig2 eller Actin uttryck, och resulterar skalades till DMSO-kontrollen 0,1%. Den genomsnittliga relativa fluorescensenheter ± SD avsattes med hjälp av GraphPad Prism 6. Resultaten visar att den beräknade flerfaldiga förändringen är densamma när normalisering till någon av de två referensproteiner.
Figur 6:. Effekt av Triton X-100 på MBP-färgning OPCs differentierades i plattor med 24 brunnar under 4 dagar i närvaro av 45 nM T3 eller 0,1% DMSO. Kulturer fixerades sedan med 4% PFA och färgas för Olig2 och MBP med hjälp av två olika immuncytokemi protokoll. För den höga Triton X-100 prov, cellerna permeabiliserades under 1 h med 0,4% Triton X -100 och alla antikropps inkubationssteg utfördes i närvaro av 0,1% Triton X-100. För den låga Triton X-100 prov, cellerna permeabiliserades under 1 h med 0,1% Triton X-100, medan Antibody inkubationer utfördes utan Triton X-100. Olig2 och MBP visualiserades med fluorescerande färgämne-konjugerad sekundär och bilder förvärvades med hjälp av ett kamerabaserat fluorescensmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver en snabb och pålitlig metod för att isolera rått OPCs och kvantifiera in vitro oligodendrogenesis som svar på experimentella faktorer. Med användning av positiv selektion, är höga utbyten av viabla och rena OPCs användes direkt för försöksändamål. Denna metod förenklar isolering, odling och differentiering steg till en 1 vecka tidsram, och fixerade celler kan lämpligen lagras vid 4 ° C under flera veckor utan någon förlust i analyskänslighet.
En stor fördel med scanner baserade fluorescensanalyser är att datainsamling och analys är mycket snabbare jämfört med traditionella kamerabaserade mikroskope tekniker. Även mikroskopi har använts med framgång i hög genomströmning skärmar för att identifiera inducerare av OPC differentiering, är datainsamling sig långsammare eftersom det kräver programmering av bildtagningssekvenser, flera timmar av datainsamling, analys av hundratals till thousands av bildfiler, och användardefinierade algoritmer för att urskilja enskilda cellkroppar för normalisering eller analys 18,19. Vidare är det med kamerabaserade mikroskopi system inte är möjligt att samla in data från hela ytan av odlingskärlet. I stället måste representativa bilder fångas från olika områden inom en enda väl, vilket kan leda till läges fördomar och falska positiva träffar. Som jämförelse, upptäcker denna analys MBP uttryck från alla celler i en given väl, och flera plattor kan skannas samtidigt. Även om denna metod kan anpassas för användning i 96-brunnars eller 384-brunnars format, kan den 24-brunnar föredras när färre behandlingar håller på att testas. Vi har observerat att cellförlust i det 24-brunnar på grund av vätskehanterings minimeras, vilket är en komplikation som bör beaktas när man utformar högre genomströmning experiment.
En kritisk parameter vid analysen är densiteten av cellerna när differentition initieras på dag 0. Kulturer med alltför få celler verkar skilja långsammare och dör, medan hög densitet kulturer uppvisar spontan differentiering. Båda situationerna kan reducera det dynamiska området och tillförlitligheten hos analysen. För att uppnå en optimal balans mellan cellhälsa och celldensitet, vi kulturen de OPCs för 3 dagar utan en media utbyte eller komplettering av färsk PDGF-AA. Vi antog att eftersom koncentrationen av PDGF-AA i media minskar vid dag 3 in vitro (dag 0) till följd av cellulär katabolism, kommer den proliferativa hastigheten av cellerna sakta så att spridning reduceras genom den första dagen av PDGF- AA tillbakadragande. Denna teknik fungerar bäst när cellerna är jämnt fördelade under plätering. Pipettera cellerna längs sidan av brunnen och blanda dem med hjälp av en siffra åtta rörelse bör främja en jämn fördelning. Pipett till mitten av brunnen tenderar att producera kluster av celler runt kanterna på brunnen med fåER-celler som ansluter sig till centrum. Detta fenomen kan bero på störningar i färskt torkad PLL skikt av flytande pipetteringskrafter. Ansamling av celler runt omkretsen kan minska analysens känslighet på grund av densitetsberoende differentiering. Det är viktigt att notera att betydande skillnader i intensiteten för Actin / Olig2 signalen kan uppträda mellan läkemedelsbehandlade och kontroll, PDGF abstinens kulturer. Signifikant minskade aktin / Olig2 signal kan tyda på läkemedelstoxicitet, medan signifikant ökad Actin / Olig2 signal kan tyda på läkemedelsinducerad proliferation. Vi observerar normalt en något högre aktin / Olig2 signal från celler som behandlats med pro-differentierings läkemedel jämfört med en indragning kontroller PDGF. Vi tillskriver denna skillnad till en högre frekvens av spontan apoptos i PDGF tillbakadragande gruppen under fyra dagar differentieringsförfarandet. Vid bedömningen oligodendrogenesis, normalisering av MBP till aktin / Olig2 bör korrigera för cell nummer skillnader. Att bedöma toxiort och proliferation med användning av denna analys kan den anti-MBP-antikropp bytas mot primära antikroppar riktade mot de lämpliga markörer.
När experiment kräver både kvantitativ och kvalitativ bedömning, är det viktigt att begränsa exponeringen av de fasta rått oligodendrocyt kulturer till Triton X-100 vid användning av 4% PFA att fixera cellerna. Andra immuncytokemi protokoll för oligodendrocyt kulturer, som typiskt inkluderar Triton X-100 under de båda antikropps inkuberingssteg för att förbättra antikroppsepitop tillgänglighet, kan användas med framgång beroende på experimentella krav. Å andra sidan, även om MBP är ett intracellulärt protein kan det vara möjligt att utesluta Triton X-100 helt om alternativa fixeringsmetoder används som på ett adekvat permeabilisera cellerna. Med användning av de betingelser som beskrivs här, har vi observerat att Triton X-100 påverkar den observerade morfologin hos oligodendrocyter samt lokalisering av MBP-färgningnär de används vid höga koncentrationer. Vi ser inte en betydande nedgång i antikroppsfärgning när Triton X-100 utelämnas från antikropps inkuberingssteg. Såsom visas i fig 6, inklusive 0,4% Triton X-100 i permeabilization och blockeringssteget, och 0,1% Triton X-100 under antikropp inkubation, reducerar detektering av myelinprocesser och resulterar i diskontinuerlig MBP-färgning. Därför, för kvantitativ och kvalitativ bedömning kan det vara tillräckligt att använda en lägre koncentration av Triton X-100, såsom beskrivits här.
Även om användningen av A2B5-valda OPCs från råttor kan vara fördelaktigt, har vi observerat jämförbara resultat i dubbla infraröda fluorescens-scanning (DIFS) analys med hjälp av A2B5-valda OPCs från C57BL / 6-möss, även om cellutbytet per mus är typiskt mycket lägre (data visas ej). Andra protokoll för OPC rening kan också vara kompatibla med denna analys. Till exempel kan oligodendrocyt markör O4 användas som ett antigen för att rena intermediate skede oligodendrocyt prekursorer med hjälp av magnetiska kulor 20. Som ett alternativ till magnetiska baserade metoder, kan OPCs anrikas från 9 dagar gamla blandade gliaceller kulturer innehållande astrocyter och mikroglia genom hög-hastighets orbital skakning och olika vidhäftningsmetoder 21. Vidare, immune-panorering förfaranden vilka inkorporerar både negativ och positiv cellselektion kan användas om odlingsrenhet är att föredra framför hög cellutbyten 22. Förutom att undersöka hur läkemedel kan direkt förbättra differentieringen av OPCs i renkulturer, är det ibland nödvändigt att ta hänsyn till indirekta effekter av läkemedel genom andra celltyper i en co-odlingssystem. Vid MS är infiltreringen av autoreaktiva T-effektorceller till CNS tros spela en roll vid sjukdomsutveckling 23. T-celler kan utsöndra proinflammatoriska faktorer som kan hämma differentieringen av OPCs på platser av demyelinisering. Det är därför av intresse att identifiera therapeutics som kan skydda OPCs och blockerar dessa pro-inflammatoriska faktorer från förvärra skadan. Den DIFS analysen kan vara perfekt för modellering denna aktivitet som T-celler växer i suspension och kan tvättas bort från oligodendrocyt kulturen före MBP kvantifiering. För samtidig kulturstudier med vidhäftande celler såsom neuroner, astrocyter och mikroglia, kan Olig2 normalisering användas för att samla in data från oligodendrocyter specifikt. Således kan flexibiliteten hos DIFS assay lätta en mängd olika experimentella konstruktioner.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en snabb och tillförlitlig metod för att kvantifiera oligodendrogenesis av A2B5-positiva rått OPCs in vitro. Denna isolering metod ger genomgående höga utbyten av livskraftiga OPCs som svarar på etablerade differentierings ledtrådar. Känslig analys kan utföras i flera brunnar fartyg format med en mängd olika experimentella paradigm, som sträcker sig nyttan av detta system för att maNY olika applikationer. Vidare kan DIFS analysen anpassas för high-throughput drug screening, eller kan användas för att kontrollera resultaten av låg genomströmning analyser såsom kvantitativ PCR och Western blot. Viktigt kan detta system erbjuder en enkel men effektiv medel för identifiering av OPC riktade terapier i demyeliniserande sjukdomar, såsom multipel skleros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Grant sponsor: National Institutes of Health, Licensnummer: R37 NS041435.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2 mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/ml |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 ml |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/ml |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/ml |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/ml |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/ml |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/ml |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/ml |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/ml |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/ml |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/ml |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1,000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1,000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:1,000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:1,000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor |
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
