Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד של CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 + מבחר חרוז מגנטי.

Abstract

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. יתר על כן, יש להם סיכוי תפקיד בהתפתחות איבר רגיל, יוחסו תפקידי מחלה, במיוחד אלה עם אופי fibrotic. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה. טכניקת הבידוד המתוארת כאן חלה מאפיינים מרובים של MSCs תושב ריאות (L-MSCs). עם הקרב של החולדות, ריאות יוסרו ושטף מספר פעמים כדי להסיר דם. בעקבות ניתוק מכני על ידי אזמל, הריאות מתעכלים במשך 2-3 שעות תוך שימוש בתמהיל שאני סוג collagenase, פרוטאז נייטרלי ואני סוג DNase obtaineהשעית תא בודד ד נשטפה לאחר מכן ו שכבתית מעל בינוני שיפוע צפיפות (צפיפות 1.073 גרם / מיליליטר). לאחר צנטריפוגה, תאים מן שלבי נשטפים מצופים צלוחיות תרבות שטופלה. הם תאים בתרבית עבור 4-7 ימים פיזיולוגיים 5% O 2, 5% CO 2 תנאים. כדי לרוקן פיברובלסטים (CD146 -) ולהבטיח אוכלוסייה של L-MSCs בלבד (CD146 +), סלקציה חיובית עבור תאי CD146 + מתבצע באמצעות מבחר חרוז מגנטי. לסיכום, הליך זה באופן מהימן מייצרת אוכלוסייה-MSCs L העיקרי למחקר נוסף במבחנה ומניפולציה. בגלל האופי של הפרוטוקול, זה יכול להיות מתורגם בקלות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים אחרים.

Introduction

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. במהלך הפיתוח, לרבות הריאות, mesenchyme מהווה מקור חשוב של רמזים התפתחותית, ו MSCs תושב מועמד סביר להיות במרכז זה. יתר על כן, ראיות המתעוררים MSCs התושב מוטרדים במחלות מבוגרות, כולל 1,2 הסרטן ו -3 סיסטיק. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה 4. תא גזע אנטיגן-1 (SCA-1) זוהה בעכברים כסמן עבור מגוון רחב של תאי גזע רקמות, והוא יכול לשמש עבור בידוד של L-MSCs 5, אבל יש לצערילא ידוע orthologs במינים אחרים 6. חוקר דיווחתי במגוון שיטות בידוד שונה עבור בידוד של L-MSCs משתי רקמת ריאה או נוזל. אלה משתנה מתא מופעל קרינת מיון (FACS) שיטות המבוסס בחירה עבור CD31 - / CD45 - / CD90 + תאי 7, CD31 - / CD45 - / מולקולת הידבקות תא אפיתל (EpCAM) - / SCA-1 + תאי 8, התנגדות multidrug טרנספורטר ATP מחייבת קלטת G (ABCG2) תאים חיוביים 9 או בזרימה לצבוע Hoechst 33342 10, כדי דבקות פלסטיק 11,12 והגירה מתוך רקמות טחונות 13.

היתרונות של שיטה המוצגת במסמך זה הוא פי כמה וכמה. באמצעות עיכול אנזימטי עדין שיפוע צפיפות 14, אחד מקבל את כל התאים של טווח צפיפות הכוללים MSCs אך אינם כוללים תאי אפיתל או האנדותל. הצעד הדבק הפלסטיק הבא מבטיח רק כי mesenchתאי ymal לדבוק ולהישאר בתרבות, ביטול לויקוציטים. והכי חשוב עם זאת, בשלב של בחירת CD146 + מאפשר החיסול פיברובלסטים, כמו תאים אלה אינם מבטאים CD146. ביטוי של מולקולת הידבקות תא CD146 מתואם חיובי עם multipotency, ולכן הוא סמן טוב על מנת לשרש פיברובלסטים מאוכלוסיית תא mesenchymal 15-19. זהו יתרון על פני שימוש CD90 כסמן בחירה, כפי שהוא לא מתבטא רק MSCs אלא גם lipofibroblasts 5,20. בפרוטוקול זה בחרנו במפורש מבחר חרוז מגנטי, כפי שהוא עדין על התאים, ואת ההליך כולו יכול להיעשות בתנאים סטריליים. יתרון חשוב נוסף של שיטת הבידוד הזה בניגוד לשיטת התולדה, הוא שזה מהיר יחסית, 6-10 ימיםלעומת חודש או יותר לשיטת התוצאה. שלושה עד חמישה ימים לאחר הבידוד הראשוני אוכלוסיית mesenchymal מוכנה CD146 + Sele גודל ction; לאחר שלושה עד חמישה ימים אחר התאים + CD146 מוכנים לשמש בניסויים או אפשר להקפיא לשימוש מאוחר יותר. שעת תרבות הירד משפרת את איכות התאים כמו MSCs transdifferentiate כלפי פיברובלסטים בתרבות לשעבר ממושך vivo 19. לבסוף, בשל אופיו של פרוטוקול, אפשר ליישם את השיטה כדי מינים אחרים על ידי בחירת נוגדנים מתאימים, או אפילו מערכות איברים אחרות על ידי התאמת הבחירה של אנזימים לעיכול זמן דגירה.

פרוטוקול מפורט של שיטת הבידוד הזה הוא כדלקמן, וכן סקירה סכמטית של הבידוד והבחירה הבאה של תת-האוכלוסייה + CD146 מסופקת באיור 1A ו -1 B בהתאמה. בנוסף, פרטים כלולים עבור passaging, הקפאה להפשרה תאים אלה.

המודעה / 53,782 / 53782fig1.jpg "/>
באיור 1. סקירה סכמטי של בידוד של תאים mesenchymal ריאתי (א) ו CD146 עוקבות + בחירת תא (B) מינ '= דקות.; EDTA = חומצה Ethylenediaminetetraacetic; 2 nd Ab = נוגדנים משני; אלפא-CD146 Ab = העיקרי נוגדן אנטי CD146; תאי -ve = CD146 תאים שליליים; + יש תאים = תאים חיוביים CD146. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אוטווה (פרוטוקול אתיקה חיה Ohri-1696). טיפול בחיות בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות.

1. בידוד של תאים סטרומה mesenchymal ריאות

  1. מכינים את תערובת האנזים בתוך שפופרת 50 מ"ל: לשקול 30 פרוטאז U Neutral, 2,500 U Collagenase ואני 500 U DNAse I. סכומים אלו להספיק הריאות של עכבר בוגר או גור חולדה. כן ביום של בידוד ולאחסן ב 4 ° C עד שימוש.
  2. גורי חולדה הקורבן ביום 13 על ידי הזרקה תוך הצפק של נתרן pentobarbital (0.2 מ"ל, 65 מ"ג / מ"ל). השתמש רפלקס קמצוץ הבוהן להקים הכרה. מוות של חיה מובטח על ידי פתיחת חזה, כמפורט להלן.
  3. לטהר את העור על ידי ריסוס החיה עם 70% אתנול ו בזהירות לפתוח את בית החזה באמצעות מספריים כירורגיות, החל מהשעה הסרעפת חיתוך כלפי הצד מקורי, נזהר מאוד לאלפגוע ריאות. מורחים את בית החזה פתוח באמצעות מלחציים עוצר דמום, או לחילופין לחתוך את בית החזה כדי לספק גישה החזה.
  4. ולגרום לדימום מחודש את החיה על ידי הסרת הלב. כדי להסיר את הלב, לתפוס את התימוס והלב עם מלקחיים קטנים וחותכים ממנו אלה עם מספריים כירורגיות. מייד לאחר מכן, לספוג את הדם עם תחבושת עד אין יותר דם יוצא של האאורטה הכרותה ואת עורק הריאה.
  5. הסר את הריאות מן החזה כדלקמן: להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים קטנים, ואז לנתק את קנה הנשימה עם מספרי כירורגיות בצד המקורי. תוך משיכת החבילה ריאות בעדינות מתוך בית החזה, לחתוך את כל רקמת החיבור בצד הגבי לאורך בית החזה כדי לשחרר את הריאות.
  6. לנתק את הריאות מן האאורטה והוושט ידי חיתוך לאורך הסרעפת עם מספריים כירורגיות. עכשיו כי ריאות חופשיות לחלוטין מן החזה להסיר כל דם שנותר בעדינות עם גזה.
  7. הסר את קנה הנשימה הסמפונות עם surgical מספריים ובזהירות להעביר האונות ריאות לצינור 50 מ"ל המכיל קר 35 מ"ל 30% ציטראט-פוספט דקסטרוז אדנין (CPDA-1) נוגד קרישה (מימית ציטראט Trisodium 26.30 גרם, 3.27 גרם מונוהידראט חומצה אסקורבית, 2.22 גרם פוספט dihydrogen גלוטמט, 31.80 גרם D- גלוקוז, 0.275 גרם אדנין ב 1 L מטוהרים H 2 O; סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש) ב בופר פוספט (PBS) כדי להסיר דם ופסולת.
  8. לאחר השטיפה 5 דקות ב -30% CPDA-1 / PBS, להעביר את הריאה לצינור חדש 50 מ"ל המכיל 35 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS) (RT), להפוך בעדינות כדי להסיר ציטראט. העברה אל צינור המכיל 35 מ"ל + PBS של Dulbecco נתרן-פירובט + גלוקוז (DPBS ++) (RT). כל שלב שטיפה אמור לקחת בערך 5 דקות.
    הערה: DPBS ++ ניתן להזמין מסחרית או מורכב כדלקמן 21: סידן כלוריד dihydrate 132.4 מ"ג, hexahydrate מגנזיום כלוריד 100 מ"ג, אשלגן כלורי (נטול מים) 200 מ 'g, monobasic פוספט אשלגן (נטול מים) 200 מ"ג, נתרן כלורי (נטול מים) 8,000 מ"ג, dibasic פוספט נתרן (נטול מים) 1,144.5 מ"ג, מ"ג D- גלוקוז 1000, פירובט נתרן 36 מ"ג L 1 7.3 מטוהרים H 2 O, pH. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  9. ממיסים את תמהיל האנזים על ידי הוספת 10 מ"ל DPBS ++ (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ואת היפוך בעדינות עד שהיא נמסה.
  10. מעבירים את הריאות לצינור 50 מ"ל חדש וקוצצים את הריאות על הקיר של הצינור באמצעות אזמל עד טחון דק. מוסיפים את תערובת אנזים לרקמה (10 מ"ל תערובת אנזים / לכל עכבר מבוגר / הגור עכברוש ריאות), לסגור את הצינור בחוזקה לדגור על 38 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (או במיקסר תרמית, באמבט מים רועד, או מים אמבטיה עם תסיסה ידנית קבוע). המשך תלוי בסוג של רקמות: דקות 60 רקמות עוברות, הדקה לנוער / מבוגרי רקמות 90-120, רקמה הבוגרת fibrotic 120-150 דקות.
  11. עצור את מערכת העיכול על ידי chelating קטיונים דו ערכי wה- i 200 μl ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, 0.15 M, pH 7.4. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר לפני השימוש).
  12. הוסף 20 מ"ל 5% בסרום שור עוברית (FBS) / PBS ולהעביר את ההשעיה כולו דרך מסננת 100 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ"ל. יש לשטוף את מסננת צינור ותא עם 10 מ"ל 5% FBS / PBS, מביא את הנפח הכולל עד 40 מ"ל.
  13. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 XG, RT.
  14. הסר את supernatant (גלולה צריך להיות ברור לעין), resuspend ב 40 מ"ל 5% FBS / PBS וחזור על שלב צנטריפוגה 1.13.
  15. Resuspend ב FBS 4 מ"ל 5% / PBS (RT) ואת שכבת בזהירות מעל 3 מדיה שיפוע צפיפות מ"ל (1.073 g / ס"מ 3) בצינור 15 מ"ל 14. לקבלת שלבים טובים, חשוב כי השכבות של השעית התא הבודדה מתרחשות בזווית> 45 ° במהירות מאוד נמוכה.
  16. צנטריפוגה 20 דקות ב 900 XG, בינוני (5/10) תאוצה, לא האטה, 19 ° C.
  17. אוספים את התאים המצויים בterphase resuspend אותם 10 מ"ל סטרילי PBS.
  18. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C.
  19. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל בינוני תרבות מחומם מראש הושלמה L-MSC (Eagle התקשורת חיוני מינימום, שינוי אלפא (αMEM), בתוספת 2 מילימול L-גלוטמין לכל 500 מ"ל αMEM, 20% בנפח / FBS כרך ו -1% כרך / כרך פניצילין / סטרפטומיצין / Amphotericin ב
  20. 1.18 צעד צנטריפוגה חוזר. בהמשך לכך, הסר supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל מחומם מראש בינוני תרבות טריים.
  21. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי צלחת בצפיפות גבוהה, שכן רוב התאים בשלב זה הם לא חסיד פלסטיק. צפיפות הציפוי מדויקת תלוי מזני חי הגיל, למשל, תאים של ריאות עכבר בוגרות הם זורעים ב 10 5 תאים / 2 סנטימטר, ואילו תאים מפני ריאת גור עכברוש הם צפופים מספיק בצפיפות זריעה של 1-2 x 10 4 תאים / 2 ס"מ / 2 ס"מ.
  22. L-MSCs תרבות באווירה 5% O 2, 5% CO 2 humidified על 37 מעלות צלזיוס.
  23. שנה בינונית 24 שעות לאחר הזריעה הראשונית, ולאחר מכן כל 3 ימים אחרי שטיפת פעם עם PBS. תאים צריכים להיות מתורבת עד 80-90% המפגש, אשר לוקח 3-5 ימים בממוצע תלוי החיה המוצא. מפגש גבוה יקדם בידול לתוך פיברובלסטים.

בחירת 2. של CD146 + mesenchymal ריאות סטרומה תאים

  1. ציפוי של חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני
    1. מעיל חרוזים מגנטיים עם נוגדנים משני biotinylated, ביחס של 10 מיקרוגרם חרוזים משני נוגדן / 100 μl מגנטי בתוך תחתית עגולה 2 סטרילי מ"ל cryovial בתנאים סטריליים. השתמש 10 μl נוגדנים משני לכל צפוי 0.5 x 10 6 תאים, ולהשתמש מינימום של 100 μl חרוזים מגנטיים 10 נוגדן מיקרוגרם.
      הערה: היחס שלtibodies בשימוש לכל נפח של חרוזים עשויים להיות שונים בין יצרנים, יש לבדוק את הוראות היצרן עבור החרוזים של בחירה. עבור פרוטוקול זה, עיין בטבלה 1 עבור חרוזים ונוגדנים ששימשו אופטימיזציה של פרוטוקול זה.
    2. דגירה במיקסר מדגם סיבוב במשך 30 דקות ב 30 סיבובים / min (סל"ד), ב RT.
    3. Resuspend את החרוזים 1.5 מ"ל אלבומין 0.1% סטרילי בסרום שור (BSA) / PBS ולהעביר צינור עגול 3 מ"ל התחתונה (cytometry זרימה בצינור). שוטפים את cryovial עם 0.1% BSA / PBS 1.5 מ"ל נוספים ולהעביר אל הצינור 3 מ"ל.
    4. מניחים את הצינור על מגנט המתאים ולהמתין 2 דקות עד שכל חרוזים מחוברים אל הקיר האחורי של הצינור והפתרון שרידים ברורים. הסר לשטוף נגר וחזור עם 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS פעמיים.
    5. Resuspend את החרוזים 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור. יש להשתמש תוך 5 ימים.
  2. תוויות CD146 + L-MSCs
    1. קציר תאי mesenchymal לאחר השטיפה עם PBS באמצעות פתרון שאינו טריפסין עדין.
      הערה: כרכים תלוי בגודל של בקבוק תרבות (0.2 מ"ל / ס"מ 2 בינוני או PBS).
      1. הסר בינוני תרבות לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS סטרילית.
      2. להוסיף נפח מתאים של פתרון שאינו טריפסין עדין (ראו טבלה 1). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה עד התאים יש המנותקים, כ 10 דקות בעת שימוש הפתרון בטבלה 1.
      3. להשבית את האנזים על ידי הוספת בינוני תרבות L-MSC, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 500 x.
    2. הסר supernatant, תאי resuspend ב 0.1% BSA / PBS ולספור את התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
      הערה: נפח של 0.1% BSA / PBS תלוי בגודל של בקבוק תרבות: לשאוף 5 או 10 מ"ל 0.1% BSA / PBS.
    3. חזור על שלב 2.2.2 ו resuspend הסכום הייעודי של התאים 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS (בלוקים unאתרי קישור ספציפיים שומר על התאים בחיים). שמור את התאים על הקרח.
    4. כן 3 מיליליטר עגול צינור תחתון עם הנוגדן אנטי CD146 העיקרי, ולשמור על קרח.
      הערה: ריכוז הנוגדן ראשוני זה יתווסף הסכום הייעודי של תאים תלויים הנוגדן המשמש. עבור נוגדן CD146 אנטי עכברוש הציע ר 'טבלה 1.
    5. מוסיף את הנפח הכולל של תאים משלבים 2.2.3 אל צינור עם הנוגדן הראשוני. סוגרים היטב דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל"ד, 4 ° C.
    6. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב 500 XG, 4 ° C, להסיר תא גלולה supernatant ו resuspend ב 3 מ"ל 0.1% BSA / PBS. צעד צנטריפוגה חוזר.
    7. Resuspend התאים הפתרון 3 מ"ל המכילה חרוזים משני מצופה נוגדן שהוכן על פי ההוראות בסעיף 2.1 ו דגירה 30 דקות על מיקסר מדגם מסתובב ב 15 סל"ד, 4 ° C.
  3. בחירת CD146 + L-MSCs
    1. מניחים את הצינור המכיל את שכותרתו CD146 + L-MSCs על המגנט. התאים החיוביים יצוירו לחלק אחורי של צינור. מבלי להזיז את הצינור או נגיעה החרוזה, לקצור את supernatant עם התאים שהליליים לאט עם פיפטה פסטר סטרילית (אלה יכולים להיות שנאספו או מושלכים מבוססים על עיצוב ניסיוני).
    2. הסר את הצינור מתוך המגנט resuspend התאים BSA 3 מ"ל 10% / PBS. חזור על הליך הבחירה מתואר בשלב 2.3.1. ארבע פעמים יותר (צעדי בחירת Σ 5).
    3. Resuspend את CD146 + L-MSCs במדיום תרבות מחומם מראש L-MSC ולחזור המגנט.
    4. הסר supernatant, resuspend במדיום תרבות L-MSC צלחת בתוך בקבוק תרבות בגודל מתאים (0.2 מ"ל / 2 ס"מ). ככלל אצבע, תאי צלחת בבקבוק אותה תרבות הגודל שממנו התאים הוסרו לפני בחירת חרוז. מספר CD146 + L-MSCs, ולכן צפיפות ציפוי, יהיהתלוי בגיל, מין ומתח של החיה מקור. תמיד לשאוף צפיפות ציפוי של ~ 5,000 תאים / 2 ס"מ.
      הערה: החרוזים לא יפריע גדילת התא ייעלמו בהדרגה כמו התאים להתרבות.

3. תאים מקפיאים

  1. השתמש בתקשורת ההקפאה הבאה: 60% פתרון pentastarch (pentastarch 10% ב 0.9% NaCl), 20 FBS%, 12.5% ​​CPDA-1, 2.5% NaCl (0.9%), sulfoxide דימתיל 5% (DMSO) 22.
    הערה: אם לא כל החומרים זמינים, בתמיסה המכילה DMSO 5%, 30% FBS ו 65% αMEM היא אלטרנטיבה טובה.
  2. תאים Resuspend ב 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל, aliquot ב cryovials של 1 מ"ל כל ולהקפיא O / N ב -80 ° C באמצעות מיכל הקפאה.
  3. מעבירים מיכל אחסון חנקן נוזלי למחרת.

4. תאי פשרה

  1. להפשיר בקבוקון של תאים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. תאים Resuspend ב 10 מ"לבינוני ו צנטריפוגות התרבות מחומם מראש במשך 5 דקות ב 500 XG, 21 ° C.
  3. הסר supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום תרבות 10 מ"ל. תאי זרע בתוך תרבית תאים כובע פרקו מטופלים צלוחיות ב 5000 תאים / 2 ס"מ במדיה 0.2 מ"ל / cm2 (למשל, 15 מ"ל עבור בקבוק 75 ס"מ 2).
  4. התרבות תאים ב 5% O 2, 5% CO 2 עד ומחוברות 80-90% לקציר ו / או שימוש ניסיוני. יתר confluency יהיה להשרות התמיינות. כאשר זריעה ב 5000 תאים / 2 ס"מ, L-MSCs יגיעו 80-90% confluency בתוך 3-4 ימים של תרבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שניים מן המאפיינים הפיזיים הכי אמין של MSCs, צפיפות ודבקות פלסטיק, משמשים בחלק הראשון של פרוטוקול זה כדי לקבל את החלק היחסי תא mesenchymal של הריאה המכיל L-MSCs. למרות שלבי שיפוע הצפיפות יכללו מונוציטים ומקרופגים בנוסף לתאי mesenchymal ריאות, דבקות הפלסטיק ואחריו 3-5 ימים של תרבות מבטיחה רק כי תאי mesenchymal הריאות להישאר. ואכן אוכלוסיית תאים זה מבטא את שטח MSC הקלסי הסמנים CD73, CD90 ו CD146 והוא שלילי על הסמנים CD34, CD45, הסוג מורכב histocompatibility הגדולה השני (MHCII) -RT1B, CD11b ו CD79a, המציין כי יש עוד כל לויקוציטים נוכח אוכלוסיית תאים (איור 2 א). מעניין הוא שמתוך מהשנה + CD146, מגוון% 44.4-65.7 גם CD73 + ו- CD90 + (מידע לא מוצג). יתר על כן, אוכלוסיית תא זה היא מסוגלתיחידת מושבה להרכיב (CFU) יעיל כי ב ~ 30% הם גבוה בהרבה ממה שמדווח בדרך כלל MSCs מח עצם או אפילו סוגי MSC אחרים (איור 2 ב), ומבדילה לאורך שלוש שושלות MSC הקלסיות (איור 2 ג).

איור 2
איור 2. מאפייני MSC לאחר עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות ודבקות פלסטיק. (א) ביטוי של סמני משטח הקשורות MSC CD146, CD73 ו CD90 שוהים חלק מאוכלוסייה חסיד תא הפלסטיק, ואילו סמנים לויקוציטים השליליים CD11b, CD79a , CD34, CD45 ו MHCII-RT1B היו כמעט לא באה לידי ביטוי. (ב) מושבה להרכיב assay היחידה באמצעות הגבלת assay דילול (5 תאים / 2 סנטימטר) עולה כי כ -30% של תאי חסיד פלסטיק היו בו מקומות משובטים, מעיד על MSCs. (C) ce חסיד פלסטיקLLS מסוגל ייצור מטריקס osteogenic (אדום), שהכיל מספר גבוה של שלפוחית ​​שומנים קטנה (אדום) כאשר מושרה עם בינוני בידול adipogenic בהשוואה ללא-בדיל בקרות נוצרו chondrogenic כמו כדורים המכילים chondrocytes (אדום). הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). כל הנתונים שנוצרו עם תאים מעבר 1-3. NM = סמנים שליליים; CFU = מושבה להרכיב יחידות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עם זאת, האזהרה העיקרית היא שהאוכלוסייה זו סבירה מכילה שני L-MSCs ו תת-סוגים שונים של פיברובלסטים ריאות, L-MSCs בדיל צאצאים 23. מאז multipotency מתואם חיובית עם הביטוי CD146, ו פיברובלסטים צריכה להיות לך שום ביטוי של סמן זה, סלקציה חיובית של תת-אוכלוסייה + CD146 ostensibly הביא אוכלוסייה בתא אנושית מועשרת ב L-MSCs. זו באה לידי ביטוי באופן ברור על ידי אחוז גבוה של האוכלוסייה תא המבטא סמנים משטח הקשורים MSC (איור 3 א), פוטנציאל המושבה להרכיב גבוה משמעותית של ~ 80% (איור 3 ב) ו תגובה בידול חזק במיוחד בשושלת chondrogenic (איור 3 ג) בהשוואה לאוכלוסייה mesenchymal הכוללת מתקבלת לפני בחירת CD146. מן ראוי לציין כי הוא דרך ביטוי L-MSCs אלה רק מעט מאוד adipocytes נכון, אבל להראות תאים בצורה רבים יותר כישור כי הם מלאי שלפוחית ​​שומנים קטנה. אלה יכולים לשקף את שושלת lipofibroblast כי הוא חיוני הוא לפיתוח ריאות תמיכת תא מסוג II המכתשית. לאחר בחירת CD146, יותר adipocyte כמו תאים מלאי שלפוחית ​​שומנים גדולה ניתן לצפות (איור 3 ג) לעומת לפני בחירת CD146, עדיין רוב התאים הם עדיין lipofibroblasts הדמוי ceLLS המכיל שלפוחית ​​שומנים קטנה.

איור 3
איור 3. מאפיינים MSC לאחר בחירה חרוזה מגנטי נוסף CD146 +. לאחר סלקציה חיובית של תת-האוכלוסייה + CD146, תאים אלה הראו ביטוי הגבוה של סמני משטח הקשורות MSC, CD73 בפרט (א), יעילות CFU גבוהה באופן משמעותי לאחר תא בודד ציפוי (B), ואת תגובת בידול חזקה במיוחד בשושלת chondrogenic ובמידה פחותה שושלת adipogenic (C). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. כל הנתונים שנוצרו עם 3 תאי מעבר. NM = סמנים שליליים; מושבת CFU = הקמת יחידות. אנא לחץ כאן to לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבידוד והתרבות של L-MSCs העיקרי מהווה הזדמנות כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת האינטראקציה שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרים ברמה התאית, ותפקידם בהתפתחות הריאות, בבריאות ובחולי. זה חשוב במיוחד כאשר חוסר סמן ספציפי אחד של תאים אלה עושה את זה כמעט בלתי אפשרי ריבויים באתרו. כמו בכל אוכלוסיות תאים ראשוניים, יש לזכור כי תאים אלה נוטים יותר לשנות את האופי שלהם ככל שהם נשמרים תרבות 19 (הנסקרת ב 24). כדי לשמור L-MSCs במצב כי הוא קרוב ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, זה חשוב מאוד כי הם בתרבית 5% O 2, 5% CO 2, חממה humidified 37 ° C. בפיזיולוגית נשימה מקובלת כי בהתבסס על החוק של לחצים חלקיים של דלטון, לחץ החמצן החלקי של אוויר סביבה (21% O 2) הוא 160 מ"מ כספי, ויורד ל ~ 101 מ"מ כספי במרחב אווירי המכתשית 25-27. בשנת ריאה בוגרת השיפוע 2 פאו עורקים-המכתשים הוא ~ 3-4 מ"מ כספי, אבל זה עשוי להיות עלה באופן משמעותי ריאה חולה או לא בוגרת שמרחק עורקים-המכתשים הוא גדל 25,28. בתוך הגוף, גומחת mesenchymal חשוף בדרך כלל ריכוז חמצן של 2-8% 29,30. רק כמה ניירות למעשה מדדו את PO 2 בתוך הריאות, אך מחקר אחד נמדד זה בתוך הריאות של 20 חולים, איתור טווח בריאה נורמלי PO 2 מ 23 כדי 656 מ"מ כספית, עם חציון של 42.8 מ"מ כספית 27,31. על פי החוק של דלטון, חממה humidified עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% O 2 יש PO 2 של ~ 36 מ"מ כספית, אשר נופל לגמרי בטווח נמדד רקמת הריאה נורמלי מאוד קרוב לחציון. בנוסף, תנאי תרבות נמוך חמצן לקדם את התחזוקה של אוכלוסיות אב בתרבות 29. יחדיו, זה אניקשה לדעת בדיוק מה ריכוז L-MSCs חמצן נחשף באתרו בשלבים שונה במהלך התפתחות או מחלה לאחר לידה רגילות, אך נראה כי 5-10% O 2 צפוי המדויק ביותר מנקודת המבט פיזיולוגית 27,31. בהתבסס על המידע שהובא לעיל, בחרנו לקיים 5% O 2 בתנאי תרבותנו, ומצאנו כי כאשר התנאים הללו נשמרים במבחנה, L-MSCs יגדל מהר, להציג סיבי מתח פחות, ויש סבירות קטנה יותר בידול או הזדקנות ספונטני. גורמים נוספים שימנעו התמיינות ספונטנית או מומים אחרים הוא באמצעות סוכן דיסוציאציה הלא טריפסין עדין passaging, passaging-MSCs L כאשר הם מגיעים 80-90% confluency (תנאי צפוף יקדם בידול פיברובלסטים), והשמירה על מספר המעבר הנמוך (<P4). במחקר שנערך על ידי הופמן ועמיתיו, טריפסין הוצגה להיות השפעות שליליות על תפקוד L-MSCs ופנוטיפ, ואילו סוכני דיסוציאציה חינם-טריפסין יכול לשמר 13 זה.

כדי לייעל את התשואה במהלך תהליך הבידוד, חשוב לרכך את הריאות כמו דק ככל האפשר, תוך התחשבות כי הרקמה לא צריך להיות מותר יבש. במהלך העיכול אנזימטי, חשוב כי הצינורות הם נסערו לעתים קרובות אם לא באמצעות מכשיר רועד מחומם, כמו פיסות הרקמה תהיה משקעים לא יקבלו חשיפה אופטימלית של האנזימים. עוד צעד קריטי הוא הפרדת שיפוע הצפיפות: אם השכבות לא נעשתה לאט מאוד או בזווית <45 °, זה יוביל הערבוב של שני הנוזלים במקום שכבות, שגרם להפסד של אוכלוסיית תא כולו. יתר על כן, צפיפות של מדיום שיפוע הצפיפות תלוי מאוד טמפרטורת הסביבה. בכל הטמפרטורה למעט 19 ° C (או RT), יגרום הפרדת שיפוע לא טובה או לא צפיפות.

לעניין fמשתמשי uture של פרוטוקול זה הם שיש לנו מבודדי L-MSCs קיימא בהצלחה מריאות שנמסקו עד 24 שעות לפני הבידוד, ובלבד הריאות מאוחסנות ישירות תקשורת L-MSC קר על קציר, והמשיכו ב 4 מעלות צלזיוס. זה מאפשר תכנון ניסוי גמיש יותר, או אפילו משלוח של ריאות בין מעבדות שונות. התשואה דומה כלל לזו של ריאות שנקטפו זה עתה, ותאי לגדול באותה מידה.

שינוי נוסף זה יהיה אפשרי, הוא להשתמש FACS במקום מבחר חרוז מגנטי, למרות שיטה זו מכפיפה את התאים יותר מתח כמו ההליך לוקח זמן יותר כתאים חשופים ללחצים במהירויות גבוהות, ונמלים את הסיכון לזיהום אם לא נעשה בתנאים סטריליים. החרוזים המגנטיים המשמשים כאן אינם מפריעים צמיחת תאים, ונעלמים תוך מספר ימים של תרבות. העדפת FACS או מיון חרוז מגנטי עשויה להיות תלויה גם על המתקנים זמיניםלמשתמש הקצה. בנוסף, ניתן יהיה לשנות בפרוטוקול זה כדי לבודד MSCs תושב מרקמות אחרות. במקרה זה יהיה חשוב להתאים את האנזימים לאיבר של עניין, שכן הרכב מטריקס משתנה בין איברים.

מגבלה חשובה של רק באמצעות שיפוע הצפיפות ודבקות פלסטיק הבא לקבלת תאי mesenchymal, היא שהאוכלוסייה שתתקבל מכילה שני L-MSCs ו fibroblasts. בחירה עבור CD146 + תאים בתוקף תרופות למגבלה זו, אך למרות CD146 + הליך בחירה ואת תנאי culturing זהירים, אופי L-MSCs ואת ההשפעות של תרבית תאים במבחנה לעשות את זה בלתי אפשרי להימנע מידה מסוימת של הבידול לתוך פיברובלסטים. MSCs בכלל דווחו להכיל היררכיה של multipotency, שבו תאים בהמשך ההיררכיה לאבד פוטנציאל multilineage שלהם לאט עד שהם הופכים פיברובלסטים הבדיל סופני <sup> 23. ככל הנראה זה קורה גם בנישת L-MSC 4, ונראה להשתקף CD146 + אוכלוסייה בתרבית כפי שכבר קטע אחד לאחר בחירת CD146 + בערך 40% של תאים אבדו ביטוי CD146. בנוסף, באוכלוסיה זו יש רק 80% CD73 ו -40% ביטוי CD90. בחלקו, זה יכול להיות מוסבר על ידי ההיררכיה של multipotency MSC. זה יהיה אפשרי כי CD146 + לעבור התפשטות סימטרית, והוליד שני MSCs CD146 חיובי ושליליים, מובחן יותר, לתאי בת. MSCs תושב הבריאות עשויה גם סביר שצפויים יש פנוטיפ שונה במקצת ותפקוד מ MSCs במח העצם, שבו ההגדרה של CD73 וביטוי CD90 התבסס. החברה הבינלאומית טיפול בתא זיהתה כי לא כל MSCs להביע סמני MSC הקלסיים, כולל CD73 ו CD90, וכי הביטוי סמן פני השטח הוא לא דרך טובה ביותר להגדיר 32 MSCs. הדואריעילות CFU xceptionally גבוהה של ~ 70% מכלל האוכלוסייה CD146 + L-MSC תומכת בכך. בגלל אוכלוסיית CD146 + מבצעת טובה יותר בהתייחס למאפייני MSC מאשר באוכלוסיית mesenchymal הממוינת, המחברים לא עוד שאפיינו את CD146 - האוכלוסייה. אנו שאף להעשיר האוכלוסייה mesenchymal שלנו עם MSCs ו לרוקן אותם פיברובלסטים, אבל אנחנו לא טוענים כי מדובר באוכלוסייה נכון L-MSC בלבד. L-MSCs צפוי מאוד הטרוגנית, הוא במקורם, פנוטיפ ותפקוד.

למרות CD146 הוא הודה נרחב להיות סמן של multipotency ב MSCs ו pericytes 16,17,33,34, מעט מאוד ידוע על האוכלוסייה CD146 + MSC in vivo. CD146 הוא מולקולת הידבקות תא שחשוב אנגיוגנזה ותפקוד תא האנדותל, ובא לידי הביטוי בתאי האנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, MSCs ו- T לימפוציטים מסוג 15,16,35,36. בשנים האחרונותראיות, התפתחו כי MSCs מאכלס את נישת perivascular באיברים רבים, כמו CD146 + תאי שיתוף כתם עבור CD73 MSC-סמני CD105 37. ואכן, pericytes ו MSCs בתרבית יש פרופיל ביטוי גנים דומה מאוד 38, חיזוק לדעה כי MSCs נגזרת pericytes 4,39. למרות שאנו לא ביצעו immunohistochemical מנתח כדי לקבוע את המיקום של האוכלוסייה CD146 + L-MSC שלנו, זה מאוד סביר להניח כי הם גם יהיו ממוקמים במיקום perivascular. מחקרים עתידיים יהיה צורך לבדוק אם זה אכן המקרה. יתכן כי קבוצת המשנה של אוכלוסיית התא שלנו היא pericytes, אם כי יש לציין כי כל תאים נראים phenotypically דומה מאוד לאחר בחירת CD146 +.

תאי סטרומה mesenchymal קשים לשמצת לזהות בשל חוסר סמן והמקיף יחיד. מחקרים שונים דיווחו שיטות שונות עבור בידודשל L-MSCs, הראו באופן משכנע כי אוכלוסיות תאים אלה דומים זה לזה ביחס ביטוי סמן MSC. בהתבסס על האפיון של CD146 + L-MSC כפי שהוצג כאן, אוכלוסיית CD146 + L-MSC דומה מאוד לאוכלוסיות L-MSC שדווחו בעבר כפי שהשיגו תוצאה או צורות שונות של FACS באמצעות סמני משטח הקשורים בתאי גזע כגון Sca -1, ABCG2 ו CD90. כשמשווים תולדה L-MSCs 13, CD146 + L-MSCs נראה שיש לך יכולת גדולה יותר להצמיח מושבות של תאים בודדים, המציין כי השיטה שלנו מניב מולטיפוטנטיים מועשר יותר באוכלוסייה L-MSC. יתרון זה נכון גם בהשוואה לשיטות שמבודדים L-MSCs מבוסס על CD90 7 או α הקולטן לגורם הצמיחה הנגזרות טסיות (PDGFRα) 40,41, כסמנים השטח הן גם לבחור עבור יותר lipofibroblasts הבדיל סופני המכתשית / פיברובלסטים מבניים לפיכך, אפשר רק סביר בדואר מזוהה בתאי סטרומה 20,42. לעומת זאת, הוא SCA-1 ו ABCG2 מתועד היטב סמנים מתואמים עם ביטוי stemness ו- MSC 9,43-46. ABCG2 + L-MSCs אולם יש אופי אנדותל יותר כפי שהם 99% חיובי עבור CD31 46, ואילו שיטת דיווח כאן בוחר נגד תאי אנדותל באמצעות שיפוע Ficoll ודבקות פלסטיק. היתרון העיקרי של שיטה שלנו לעומת פרוטוקול הבידוד המבוסס SCA-1 של 5,8 McQualter ועמיתיו הוא שזה נרחב החלים על מינים אחרים מאשר עכברים, שבו SCA-1 לא ניתן להשתמש.

למרות זאת הוא מאוד מאתגר, כנראה קרוב על בלתי אפשרי, להשיג האוכלוסייה "טהור" של L-MSCs מן ריאה פיתוח או מבוגר מאוחר ולתחזק אותו במצב מובחן, הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה מהירה, אמינה, אחידה ועקבית של קבלת אוכלוסיית תא מועשרת ב מיל ריאות עצמי חידוש מולטיפוטנטייםMSCs הזיהוי. באמצעות שיטה זו תאפשר מחקר מוגדר יותר של תפקיד L-MSCs במגוון רחב של דגמי מחלה ותפקידם הריאה מתפתחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

גזע ביולוגיה של התא גיליון 108 mesenchymal בתאי סטרומה רקמות תושב תאי גזע / אב ריאות חולדה רפואה רגנרטיבית מבחר חרוז מגנטי
בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter