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Biology

Isolamento di CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di isolamento per ottenere cellule mesenchimali stromali residenti polmonare primaria da ratti, attraverso l'uso di digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità, aderenza plastica e CD146 + selezione perlina magnetica.

Abstract

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Inoltre, essi hanno probabilmente un ruolo nello sviluppo normale dell'organo, e sono stati attribuiti ruoli nella malattia, in particolare quelli di natura fibrotica. L'ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l'isolamento e l'identificazione di queste cellule. La tecnica di isolamento qui descritta si applica molteplici caratteristiche di MSC residenti del polmone (L-MSC). Al sacrificio dei ratti, polmoni vengono rimossi e risciacquati più volte per rimuovere il sangue. Dopo la dissociazione meccanica bisturi, i polmoni sono digeriti per 2-3 ore utilizzando un mix di tipo collagenasi I, proteasi neutra e il tipo di DNasi I. Il richiederlod singola sospensione cellulare viene successivamente lavato e stratificato su gradiente di densità media (densità 1,073 g / ml). Dopo centrifugazione, le cellule dal interfase vengono lavati e piastrate in fiasche di coltura trattato. Le cellule sono coltivate per 4-7 giorni in fisiologico 5% O 2, 5% di CO 2 condizioni. Per esaurire fibroblasti (CD146 -) e di garantire una popolazione di soli L-MSC (CD146 +), selezione positiva per le cellule CD146 + avviene attraverso la selezione perla magnetica. In sintesi, questa procedura produce affidabile una popolazione di primaria L-MSC per ulteriori studi e la manipolazione in vitro. A causa della natura del protocollo, può facilmente essere tradotto ad altri modelli animali sperimentali.

Introduction

Mesenchimali cellule stromali (MSC) sono sempre più riconosciuti per il loro potenziale terapeutico in una vasta gamma di malattie, comprese le malattie polmonari. Oltre l'uso di midollo osseo e cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale per la terapia cellulare esogena, vi è anche un crescente interesse per la riparazione e la potenziale rigenerativo delle cellule staminali mesenchimali del tessuto residenti. Durante lo sviluppo, anche nel polmone, mesenchima è una fonte importante di spunti di sviluppo, e MSC residenti sono un probabile candidato per essere al centro di questo. Inoltre, la prova sta emergendo che le MSC residenti siano disturbati in malattie degli adulti, tra cui il cancro 1,2 e fibrosi 3. L'ostacolo principale per lo studio di queste MSC tissutali residenti è la mancanza di un chiaro indicatore per l'isolamento e l'identificazione di queste cellule 4. Stem cell antigen-1 (Sca-1) è stato identificato nei topi come marker per una varietà di cellule staminali dei tessuti, e può essere utilizzato per l'isolamento di L-MSC 5, ma ha purtroppoNon si conoscono ortologhi in altre specie 6. I ricercatori hanno riportato una varietà di metodi di isolamento per l'isolamento di L-MSC sia da tessuto polmonare o fluido. Questi variano da cellule attivate a fluorescenza (FACS) metodi basati selezione per CD31 - / CD45 - / CD90 + cellule 7, CD31 - / CD45 - / epiteliale molecola di adesione delle cellule (EpCAM) - Sca-1 + cellule 8 /, multidrug resistance trasportatore ATP cassette legame G (ABCG2) cellule positive 9 o colorante Hoechst 33342 efflusso 10, per l'aderenza plastica 11,12 e la migrazione fuori del tessuto tritato 13.

I vantaggi del metodo qui presentato sono diverse volte. Usando una digestione enzimatica dolce e gradiente di densità 14, si ottengono tutte le celle della gamma di densità che includono MSC ma escludono cellule epiteliali o endoteliali. La successiva fase di adesione in plastica garantisce che solo il mesenchcellule ymal aderiscono e rimanere nella cultura, eliminando leucociti. Più importante, tuttavia, la fase di selezione CD146 + permette l'eliminazione dei fibroblasti, come queste cellule non esprimono CD146. L'espressione della molecola di adesione delle cellule CD146 è correlata positivamente con multipotenza, ed è quindi un buon indicatore per eliminare i fibroblasti da una popolazione di cellule mesenchimali 15-19. Questo è un vantaggio rispetto all'utilizzo CD90 come marcatore di selezione, in quanto non solo è espresso in MSC ma anche in lipofibroblasts 5,20. In questo protocollo abbiamo scelto esplicitamente una selezione perlina magnetica, in quanto è più delicato sulle cellule, e l'intero procedimento può essere realizzata in condizioni sterili. Un altro importante vantaggio di questo metodo di isolamento rispetto al metodo conseguenza, è che è relativamente veloce, 6-10 giorni al contrario di un mese o più per il metodo di conseguenza. Da tre a cinque giorni dopo l'isolamento iniziale popolazione mesenchimale è pronto per CD146 + sele ction; dopo altri tre a cinque giorni le cellule CD146 + sono pronti per essere utilizzati negli esperimenti o possono essere congelati per un uso successivo. Il tempo di diminuzione della cultura migliora la qualità delle cellule come MSC transdifferenziare verso fibroblasti in prolungata coltura ex vivo 19. Infine, a causa della natura del protocollo, è possibile applicare questo metodo ad altre specie semplicemente scegliendo anticorpi appropriati, o anche ad altri sistemi organici regolando la scelta di enzimi digestivi e tempo di incubazione.

Un protocollo dettagliato di questo metodo di isolamento è dato seguito, e una visione schematica del isolamento e la successiva selezione della sottopopolazione CD146 + è fornito in Figura 1A e 1B rispettivamente. Inoltre, i dettagli sono inclusi per passaging, congelamento e scongelamento queste cellule.

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Figura 1. Schema di isolamento di cellule polmonari mesenchimali (A) e la successiva CD146 + selezione cella (B) min = minuti.; EDTA = etilendiamminotetraacetico; 2 ° Ab = anticorpo secondario; alfa-CD146 Ab = primaria anticorpo anti-CD146; ve le cellule CD146 = cellule negative; + ve cellule positive cellule CD146 =. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Animal Care dell'Università di Ottawa (animale protocollo etica í-1696). Cura degli animali è stata effettuata in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Isolamento di cellule polmonari mesenchimali stromali

  1. Preparare la miscela di enzimi in un tubo da 50 ml: pesare 30 U proteasi neutra, 2.500 U Collagenasi I e 500 U DNAsi I. Tali importi sono sufficienti per i polmoni di un topo adulto o dei ratti. Preparare il giorno di isolamento e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  2. cuccioli di ratto a Sacrifice giorno 13 di un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilizzare il pizzico riflesso di punta per stabilire incoscienza. La morte dell'animale è assicurata con l'apertura del torace, come indicato di seguito.
  3. Sterilizzare la pelle spruzzando l'animale con il 70% di etanolo e aprire con cautela la gabbia toracica con le forbici chirurgiche, a partire il diaframma e il taglio verso il lato rostrale, facendo molta attenzione a nondanneggiare i polmoni. Stendere la cassa toracica aperta con fascette emostatici, o in alternativa, tagliare via la gabbia toracica per consentire l'accesso al torace.
  4. Exsanguinate l'animale rimuovendo cuore. Per rimuovere il cuore, cogliere il timo e il cuore con le piccole pinze e tagliare questi via con le forbici chirurgiche. Subito dopo, assorbire il sangue con una garza fino non più sangue esce l'aorta e l'arteria polmonare recisa.
  5. Rimuovere i polmoni dal torace come segue: tenere la trachea con piccole pinze, poi recidere la trachea con le forbici chirurgiche sul lato rostrale. Tirando delicatamente il pacchetto polmone fuori del torace, tagliare qualsiasi tessuto connettivo sul lato dorsale lungo la gabbia toracica per liberare i polmoni.
  6. Sever polmoni dal aorta e dell'esofago tagliando lungo la membrana con le forbici chirurgiche. Ora che i polmoni sono completamente liberi dal torace rimuovere il sangue residuo delicatamente con una garza.
  7. Rimuovere la trachea e bronchi con surforbici gici e trasferire con attenzione i lobi polmonari ad un tubo da 50 ml contenente freddo da 35 ml 30% di citrato-fosfato-destrosio Adenina (CPDA-1) anticoagulante (26,30 g citrato trisodico diidrato, 3,27 g di acido ascorbico monoidrato, 2,22 g monosodico fosfato monobasico, 31.80 g D-glucosio, 0,275 g adenina in 1 L purificato H 2 O; filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell'uso) in tampone fosfato (PBS) per rimuovere il sangue e detriti.
  8. Dopo 5 min risciacquo nel 30% CPDA-1 / PBS, trasferire il polmone in un tubo da 50 ml contenente 35 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS) (RT), capovolgere delicatamente per rimuovere citrato. Trasferimento in una provetta contenente 35 ml di Dulbecco PBS + sodio-glucosio piruvato + (DPBS ++) (RT). Ogni fase di risciacquo dovrebbe durare circa 5 min.
    Nota: DPBS ++ può essere ordinato in commercio o così composto 21: cloruro di calcio diidrato 132,4 mg, magnesio cloruro esaidrato 100 mg, cloruro di potassio (anidro) 200 mg, potassio fosfato monobasico (anidro) 200 mg, cloruro di sodio (anidro) 8,000 mg, sodio fosfato bibasico (anidro) 1,144.5 mg, D-glucosio 1000 mg, piruvato di sodio 36 mg in 1 L H 2 O purificato, pH 7.3. filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell'uso.
  9. Sciogliere il mix dell'enzima aggiungendo 10 ml DPBS ++ (preriscaldata a 37 ° C) e invertendo delicatamente fino a completa dissoluzione.
  10. Trasferire i polmoni in un tubo da 50 ml e tagliare il polmone sulla parete del tubo utilizzando un bisturi fino finemente macinate. Aggiungere la miscela enzimatica al tessuto (10 ml enzima miscela / per topo adulto / dei ratti polmone), chiudere la provetta e incubare a 38 ° C con agitazione (sia in un miscelatore termico, un bagno d'acqua o acqua bagno con regolare agitazione manuale). La durata dipende dal tipo di tessuto: il tessuto fetale 60 min, giovane / adulto tessuto 90-120 min, fibrotica tessuti adulti 120-150 min.
  11. Arrestare il digestione chelanti cationi bivalenti with 200 microlitri di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 0,15 M, pH 7.4. Filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron membrana prima dell'uso).
  12. Aggiungere siero bovino 20 ml 5% fetale (FBS) / PBS e passare l'intera sospensione attraverso 100 micron colino cella in un nuovo tubo 50 ml. Lavare il tubo e la cella filtro con 10 ml 5% FBS / PBS, portando il volume totale di 40 ml.
  13. Centrifugare per 5 minuti a 500 xg, RT.
  14. Rimuovere il surnatante (pellet deve essere chiaramente visibile), risospendere in 40 ml 5% FBS / PBS e ripetere la centrifugazione passo 1.13.
  15. Risospendere in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) e lo strato accuratamente in 3 ml supporti gradiente di densità (1.073 g / cm 3) in una provetta da 15 ml 14. Per ottenere una buona interfase, è fondamentale che la stratificazione della sospensione singola cella avviene con un angolo °> 45 a velocità molto bassa.
  16. Centrifugare 20 min a 900 xg, medio (5/10) accelerazione, senza decelerazione, 19 ° C.
  17. Raccogliere le cellule presenti nella interphase e risospendere in 10 ml di PBS sterile.
  18. Centrifugare per 5 minuti a 500 xg, 21 ° C.
  19. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di pre-riscaldato medio completato cultura L-MSC (minimo supporto essenziale Aquila, modifica alfa (αMEM), integrato con 2 mmol L-glutammina per 500 ml αMEM, 20% vol / vol FBS e 1% vol / vol penicillina / streptomicina / amfotericina B.
  20. Ripetere la fase di centrifugazione 1.18. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere in 10 ml di pre-riscaldato terreno fresco.
  21. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore automatico di cellule e piatto ad alta densità, poiché la maggior parte delle cellule in questa fase non sono aderenti plastica. L'esatta densità di placcatura dipende dalla specie animale e all'età, ad esempio, le cellule di un polmone di topo adulto sono seminate a 10 5 cellule / cm 2, mentre le cellule da un polmone ratti non sono sufficientemente densa ad una densità di semina di 1-2 x 10 4 cellule / cm 2 2.
  22. Culture L-MSC in un umidificata 5% O 2, 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C.
  23. Cambiare media 24 ore dopo la semina iniziale, e successivamente ogni 3 giorni dopo il risciacquo una volta con PBS. Le cellule devono essere coltivate fino 80-90% di confluenza, che richiede 3-5 giorni in media seconda all'animale di origine. Superiore confluenza promuoverà differenziazione in fibroblasti.

2. selezione di celle CD146 + Lung mesenchimali stromali

  1. Rivestimento di biglie magnetiche con anticorpo secondario
    1. Coat le perline magnetici con anticorpo secondario biotinilato, in un rapporto di 10 mcg perline anticorpo secondario / 100 ml magnetico in un fondo rotondo sterile 2 ml esageratamente in condizioni sterili. Utilizzare 10 microlitri anticorpo secondario per attesi cellule di 0,5 x 10 6, e utilizzare un minimo di 100 l perline magnetici e 10 mg di anticorpi.
      Nota: Il rapporto ditibodies utilizzati per volume di perline possono differire tra i produttori, si prega di consultare le istruzioni del produttore per le perline di scelta. Per questo protocollo, si prega di fare riferimento alla tabella 1 per le perline e gli anticorpi che sono stati utilizzati per l'ottimizzazione di questo protocollo.
    2. Incubare in un mixer campione rotante per 30 minuti a 30 giri / min (rpm), a temperatura ambiente.
    3. Risospendere le sfere in 1,5 ml di sterile 0,1% albumina sierica bovina (BSA) / PBS e trasferimento in un 3 ml tubo tondo di fondo (citometria a flusso tubo). Lavare il esageratamente con un ulteriore 1,5 ml 0,1% BSA / PBS e trasferire al tubo 3 ml.
    4. Posizionare il tubo su un magnete appropriato e attendere 2 min finché tutti perle sono attaccati alla parete posteriore del tubo e la soluzione rimane chiaro. Rimuovere il deflusso e ripetere lavaggio con 3 ml 0,1% BSA / PBS due volte.
    5. Risospendere le sfere in 3 ml 0,1% BSA / PBS e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce. Utilizzare entro 5 giorni.
  2. Etichettatura CD146 + L-MSC
    1. Raccogliere le cellule mesenchimali dopo il risciacquo con PBS usando una soluzione delicata non-tripsina.
      Nota: Volumi dipendono dalle dimensioni del pallone di coltura (0,2 ml / cm 2 media o PBS).
      1. Togliere terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con PBS sterile.
      2. Aggiungere il volume appropriato di soluzione delicata non tripsina (vedi Tabella 1). Incubare a 37 ° C in incubatore finché le cellule hanno rimosso, circa 10 min quando si utilizza la soluzione in Tabella 1.
      3. Inattivare l'enzima aggiungendo mezzo di coltura L-MSC, e centrifugare per 5 min a 500 x g.
    2. Rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS e contare le cellule con un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
      Nota: Il volume di 0,1% BSA / PBS dipende dalle dimensioni del pallone di coltura: puntare 5 o 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Ripetere il passaggio 2.2.2 e risospendere la quantità dedicato di cellule in 3 ml 0,1% BSA / PBS (blocchi delle Nazioni Unitesiti di legame specifici e mantiene vivo le cellule). Mantenere le cellule in ghiaccio.
    4. Preparare una 3 ml rotonde tubo inferiore con l'anticorpo anti-CD146 primaria, e tenere in ghiaccio.
      Nota: La concentrazione di anticorpo primario che viene aggiunta alla quantità dedicato di cellule dipende l'anticorpo utilizzato. Per un anticorpo anti-CD146 ratto suggerito vedi Tabella 1.
    5. Aggiungere il volume totale di cellule dal punto 2.2.3 al tubo con l'anticorpo primario. Chiudere e incubare 30 min su un mixer campione rotante a 15 rpm, 4 ° C.
    6. celle di centrifugazione per 5 min a 500 xg, 4 ° C, Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. passo centrifuga di ripetizione.
    7. Risospendere le cellule nella soluzione 3 ml contenente perle legate agli anticorpi secondari che è stato preparato in base alle istruzioni riportate nella sezione 2.1 e incubare 30 minuti su un mixer campione rotante a 15 rpm, 4 ° C.
  3. Selezione CD146 + L-MSC
    1. Collocare la provetta contenente il etichettato CD146 + L-MSC sul magnete. Le cellule positive saranno attratti parte posteriore del tubo. Senza spostare il tubo o toccare le perline, raccogliere il surnatante con le cellule negative lentamente con una pipetta Pasteur sterile (questi possono essere sia raccolti o scartati basato sul disegno sperimentale).
    2. Rimuovere la provetta dal magnete e risospendere le cellule in 3 ml 10% BSA / PBS. Ripetere la procedura di selezione descritto al punto 2.3.1. altre quattro volte (passi Σ 5 di selezione).
    3. Risospendere il CD146 + L-MSC in terreno di coltura pre-riscaldato L-MSC e ritornare al magnete.
    4. Rimuovere il surnatante, risospendere in terreno di coltura L-MSC e piatto in un pallone di coltura di dimensioni adeguate (0,2 ml / cm 2). Come regola empirica, cellule piastra dello stesso pallone di coltura dimensioni da cui le cellule sono state sollevate prima bead-selezione. Il numero di CD146 + L-MSC, e quindi la densità di placcatura, saràdipenderà dall'età, specie e ceppo dell'animale sorgente. Sempre puntare per una densità di placcatura di ~ 5.000 cellule / cm 2.
      Nota: Le perle non disturbare la crescita cellulare e gradualmente scomparire come le cellule proliferano.

3. Cellule di congelamento

  1. Utilizzare i seguenti supporti di congelamento: soluzione pentastarch 60% (10% nel pentastarch 0,9% NaCl), il 20% FBS, il 12,5% CPDA-1, 2,5% di NaCl (0,9%), 5% dimetilsolfossido (DMSO) 22.
    Nota: Se non tutti gli ingredienti sono disponibili, una soluzione contenente 5% DMSO, 30% FBS e 65% αMEM è una buona alternativa.
  2. Risospendere le cellule a 0.5 x 10 6 cellule / ml, aliquote in cryovials di 1 ml ciascuna e congelare O / N a -80 ° C usando un contenitore di congelamento.
  3. Trasferire in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido il giorno successivo.

4. Cellule scongelamento

  1. Scongelare una fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 5 min.
  2. Risospendere le cellule in 10 mlterreno di coltura pre-riscaldato e centrifugare per 5 minuti a 500 xg, 21 ° C.
  3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura 10 ml. Cellule seme in una coltura cellulare tappo ventilato trattati palloni a 5.000 cellule / cm 2 a 0,2 ml / media cm2 (ad esempio, 15 ml per un pallone da 75 centimetri 2).
  4. Cellule di coltura in 5% O 2, 5% di CO 2 fino a 80-90% confluenti per la raccolta e / o di uso sperimentale. Over-confluenza sarà indurre la differenziazione. Quando semina a 5.000 cellule / cm 2, L-MSC raggiungerà 80-90% di confluenza entro 3-4 giorni di coltura.

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Representative Results

Due delle caratteristiche fisiche più affidabili di MSC, densità e aderenza plastica, sono utilizzati nella prima parte di questo protocollo per ottenere la frazione di cellule mesenchimali del polmone che contiene L-MSC. Sebbene l'interfase gradiente di densità comprenderà monociti e macrofagi, oltre alle cellule mesenchimali del polmone, l'aderenza plastica seguita da 3-5 giorni di coltura garantisce che solo le cellule mesenchimali del polmone rimangono. In effetti questa popolazione di cellule esprime i classici marcatori di superficie CD73 MSC, CD90 e CD146 ed è negativo per i marcatori CD34, CD45, maggiore di istocompatibilità tipo complesso II (MHCII) -RT1B, CD11b e CD79a, il che indica che non ci sono più leucociti presenti nel la popolazione di cellule (Figura 2A). Di interesse è che fuori del sottoinsieme CD146 +, una gamma di 44,4-65,7% è anche CD73 + e CD90 + (dati non mostrati). Inoltre, questa popolazione cellulare è capace di unaunità formanti colonia (CFU) efficienza che al ~ 30% è molto superiore generalmente riportati per MSC midollo osseo o anche altri tipi MSC (Figura 2B), e differenzia lungo le tre linee MSC classici (Figura 2C).

figura 2
Figura 2. Caratteristiche MSC dopo digestione enzimatica, la separazione gradiente di densità e l'adesione di plastica. (A) L'espressione di marcatori di superficie MSC correlate CD146, CD73 e CD90 è presente in una parte della popolazione di plastica di cellule aderenti, mentre gli indicatori di leucociti negativi CD11b, CD79a , CD34, CD45 e MHCII-RT1B erano praticamente non espressi. (B) Colony formando dosaggio unità limitando saggio di diluizione (5 cellule / cm 2) ha indicato che circa il 30% delle cellule aderenti plastica aveva una capacità clonale, indicative delle MSC. Ce aderente (C) di plasticaLLS erano in grado di produzione di matrice osteogenica (rosso), conteneva un numero maggiore di piccole vescicole lipidiche (rosso) quando indotta con mezzo di differenziazione adipogenico rispetto ai controlli non differenziati e formata condrogenico come sfere contenenti condrociti (rosso). I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Tutti i dati sono stati generati con il passaggio di 1-3 cellule. NM = marcatori negativi; CFU = unità formanti colonie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tuttavia, l'avvertimento principale è che questa popolazione probabilmente contiene entrambe L-MSC e diversi sottotipi di fibroblasti polmonari, la L-MSC progenie 23 differenziati. Dal momento che multipotenza è positivamente correlata con l'espressione CD146, e fibroblasti dovrebbe avere alcuna espressione di questo marcatore, selezione positiva del CD146 + sottopopolazione ostensibly portato ad una popolazione di cellule che è altamente arricchito in L-MSC. Questo è chiaramente dimostrato da una maggiore percentuale della popolazione di cellule che esprimono MSC associato marcatori di superficie (Figura 3A), un notevolmente superiore formare colonie potenziale di ~ 80% (Figura 3B) e una risposta differenziazione forte in particolare lineage condrogenico (Figura 3C) rispetto alla popolazione totale mesenchimali che si ottiene prima selezione CD146. Da notare è che questi forma L-MSC solo pochi veri adipociti, ma mostrano molte più cellule fusiformi che sono pieni di piccole vescicole lipidiche. Questi potrebbero riflettere il lignaggio lipofibroblast che è di fondamentale importanza sia per lo sviluppo del polmone e supporto di cellule di tipo II alveolare. Dopo la selezione CD146, più adipociti come le cellule piene di grandi vescicole lipidiche si può osservare (Figura 3C) rispetto a prima selezione CD146, ma la maggior parte delle cellule sono ancora il ce lipofibroblasts-likeLLS contenenti piccole vescicole lipidiche.

Figura 3
Figura 3. Caratteristiche MSC dopo ulteriori CD146 + selezione perlina magnetica. Dopo selezione positiva della sottopopolazione CD146 +, queste cellule hanno mostrato una maggiore espressione dei marcatori di superficie MSC-correlati, CD73 in particolare (A), un tempo considerevolmente maggiore efficienza CFU dopo singola cella placcatura (B), e una risposta differenziazione forte per particolarmente lineage condrogenico e in misura minore lineage adipogenico (C). I dati sono presentati come media ± SEM. Tutti i dati sono stati generati con il passaggio 3 celle. NM = marcatori negativi; CFU = unità formanti colonie. Cliccate qui to vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'isolamento e la coltura di primaria L-MSC offre l'opportunità di comprendere meglio la loro funzione e la loro interazione con le altre popolazioni cellulari a livello cellulare, e il loro ruolo nello sviluppo del polmone, della salute e della malattia. Ciò è particolarmente importante in quanto la mancanza di uno specifico singolo marcatore di queste cellule rende quasi impossibile studiare queste cellule in situ. Come per tutte le popolazioni cellulari primarie, si dovrebbe tenere a mente che queste cellule sono più propensi a cambiare il loro carattere più a lungo vengono tenuti in coltura 19 (rivisto nel 24). Per mantenere L-MSC in uno stato che è il più vicino possibile al loro stato naturale, è molto importante che essi sono coltivate in 5% O 2, 5% di CO 2, in un incubatore umidificato a 37 ° C. In fisiologia respiratoria è generalmente accettato che in base a legge di Dalton delle pressioni parziali, la pressione parziale di ossigeno dell'aria ambiente (21% O 2) è di 160 mmHg, e scende a 10 ~1 mmHg nello spazio aereo alveolare 25-27. In un polmone matura la PaO2 gradiente alveolo-arterioso è ~ 3-4 mmHg, ma questo può essere aumentato in modo significativo in un polmone malato o immaturo in cui la distanza alveolo-arteriosa è aumentata 25,28. All'interno del corpo, la nicchia mesenchimali è normalmente esposto a una concentrazione di ossigeno del 2-8% 29,30. Solo pochi lavori hanno effettivamente misurato il PO 2 nei polmoni, ma uno studio ha misurato questo nei polmoni di 20 pazienti, trovando un intervallo nel polmone normale PO 2 da 23 a 656 mmHg, con una media di 42,8 mmHg 27,31. Secondo la legge di Dalton, un incubatore umidificato con una temperatura di 37 ° C e 5% O 2 ha un pO 2 di ~ 36 mmHg, che rientra perfettamente nella gamma misurata nel tessuto polmonare normale ed è molto vicino alla mediana. Inoltre, condizioni di coltura a basso ossigeno promuovere il mantenimento delle popolazioni progenitrici nella cultura 29. Presi insieme, idifficile dire esattamente che cosa concentrazione di ossigeno L-MSC sono esposti a in situ in diverse fasi durante il normale sviluppo post-natale o la malattia, ma sembra che il 5-10% di O 2 è probabilmente il più preciso dal punto di vista fisiologico 27,31. Sulla base delle informazioni sopra citato, abbiamo scelto di mantenere il 5% O 2 nei nostri condizioni di coltura, e abbiamo scoperto che quando queste condizioni sono mantenute in vitro, la L-MSC crescerà più velocemente, visualizzare un minor numero di fibre di stress, e hanno una probabilità più piccolo di differenziazione spontanea o senescenza. Ulteriori fattori che impediscono la differenziazione spontanea o altre anomalie è quello di utilizzare un agente di dissociazione non-tripsina delicato per passaging, passaging L-MSC quando raggiungono 80-90% di confluenza (condizioni dense saranno promuovere la differenziazione dei fibroblasti), e mantenendo il numero di passaggio basso (<P4). In uno studio condotto da Hoffmann e colleghi, tripsina ha dimostrato di avere effetti nocivi sulla funzione L-MSC efenotipo, mentre gli agenti di dissociazione libero-tripsina potrebbe preservare questo 13.

Per ottimizzare la resa durante il processo di isolamento, è importante sminuzzare i polmoni modo più preciso possibile, tenendo presente che il tessuto non deve essere lasciata asciugare. Durante la digestione enzimatica, è importante che i tubi sono agitati frequentemente se non si utilizza un dispositivo scuotitore riscaldata, come i pezzi di tessuto saranno sedimentare e non avranno esposizione ottimale agli enzimi. Un altro passo importante è la separazione gradiente di densità: se la stratificazione non avviene molto lentamente o con un angolo <45 °, porterà alla miscelazione dei due liquidi invece di stratificazione, provocando la perdita di tutta la popolazione cellulare. Inoltre, la densità del mezzo gradiente di densità dipende molto dalla temperatura circostante. Qualsiasi altra temperatura a 19 ° C (o RT), comporterà densità separazione gradiente subottimale o no.

Di interesse per Fgli utenti uture di questo protocollo è che abbiamo isolato con successo praticabile L-MSC dai polmoni che sono stati raccolti fino a 24 ore prima di isolamento, a condizione che i polmoni sono memorizzati direttamente nel freddo dei media L-MSC sulla raccolta e mantenuto a 4 ° C. Questo permette la pianificazione sperimentale più flessibile, o addirittura spedizione dei polmoni tra diversi laboratori. La resa è generalmente simile a quella dei polmoni appena raccolte, e le cellule crescono altrettanto bene.

Un'altra modifica che sarebbe possibile è utilizzare FACS invece di selezione branello magnetico, anche se questo metodo sottopone le cellule a più stress come la procedura richiede più tempo e come cellule sono sottoposte a pressioni e velocità, e racchiude il rischio di contaminazione se non fatto in condizioni sterili. Le sfere magnetiche usati qui non interferiscono con la crescita delle cellule, e scompaiono nel giro di pochi giorni di coltura. Una preferenza per FACS o magnetico ordinamento tallone può anche dipendere dalle strutture disponibiliper l'utente finale. Inoltre, sarebbe possibile modificare questo protocollo per isolare MSC residenti da altri tessuti. In questo caso sarebbe importante per adattare gli enzimi per l'organo di interesse, come la composizione della matrice varia tra organi.

Un importante limitazione utilizzando solo il gradiente di densità e la successiva adesione plastica per ottenere cellule mesenchimali, è che la popolazione risultante contiene sia L-MSC e fibroblasti. Selezione di cellule CD146 + fortemente rimedi questo avvertimento, ma nonostante il condizioni di coltura attenta procedura di selezione CD146 + e la natura della L-MSC e gli effetti di coltura cellulare in vitro rendere impossibile evitare un certo grado di differenziazione in fibroblasti. MSC, in generale, sono stati segnalati per contenere una gerarchia di multipotenza, in cui le cellule più in basso nella gerarchia perdono lentamente il loro potenziale multilineare fino a diventare fibroblasti terminalmente differenziate <sup> 23. Con ogni probabilità ciò si verifica anche nella nicchia L-MSC 4, e sembra essere riflesso nel CD146 + colta popolazione già un passaggio dopo la selezione CD146 + circa il 40% delle cellule hanno perso espressione CD146. Inoltre, in questa popolazione vi è solo l'80% e il 40% CD73 espressione CD90. In parte, questo potrebbe essere spiegato dalla gerarchia MSC di multipotenza. Sarebbe possibile che CD146 + subiscono proliferazione asimmetrica, dando origine a due MSC positivi CD146 e, più differenziate, cellule figlie negative. MSC residente del polmone potrebbe anche essere ragionevolmente dovrebbe avere un po 'diverso fenotipo e la funzione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, su cui si basava la definizione di CD73 e CD90 espressione. La Società Internazionale per la terapia cellulare ha riconosciuto che non tutti MSC esprimono i marcatori MSC classici, tra cui CD73 e CD90, e che l'espressione marcatore di superficie non è il modo migliore per definire MSC 32. l'exceptionally alta efficienza CFU del ~ 70% della popolazione CD146 + L-MSC supporta questa. Poiché il CD146 + popolazione si comporta meglio rispetto alle caratteristiche MSC rispetto alla popolazione mesenchimali indifferenziati, gli autori non hanno ulteriormente caratterizzato la CD146 - popolazione. Abbiamo cercato di arricchire la nostra popolazione mesenchimali con MSC e li riducono di fibroblasti, ma noi non pretendiamo che questo è l'unico vero popolazione di L-MSC. L-MSC sono probabilmente molto eterogenea, sia di origine, fenotipo e funzione.

Anche se CD146 è ampiamente riconosciuta come un marker di multipotenza in MSC e periciti 16,17,33,34, molto poco si sa circa la popolazione CD146 + MSC in vivo. CD146 è una molecola di adesione delle cellule che è importante per l'angiogenesi e la funzione delle cellule endoteliali, ed è espresso in cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, periciti, MSC e T-linfociti 15,16,35,36. In anni recenti, La prova è emerso che le MSC abitano la nicchia perivascolare in più organi, come le cellule CD146 + co-macchia per MSC-marker CD73 e CD105 37. Infatti, periciti coltivati ​​e MSC hanno un simile profilo di espressione genica 38, rafforzando l'idea che cellule staminali mesenchimali sono derivati ​​da periciti 4,39. Anche se non abbiamo effettuato immunoistochimica analisi per determinare la posizione della nostra popolazione CD146 + L-MSC, è molto probabile che avrebbero anche essere situati in una posizione perivascolare. Saranno necessari ulteriori studi per verificare se questo è davvero il caso. E 'possibile che un sottoinsieme di una popolazione cellulare sono periciti, anche se va sottolineato che tutte le cellule appaiono fenotipicamente molto simile dopo selezione CD146 +.

cellule stromali mesenchimali sono notoriamente difficili da identificare a causa della mancanza di un singolo marcatore onnicomprensivo. Diversi studi hanno riportato diversi metodi per l'isolamentodi L-MSC, e hanno convincente dimostrato che queste popolazioni cellulari sono simili tra loro per quanto riguarda l'espressione marcatore MSC. Sulla base della caratterizzazione del CD146 + L-MSC come presentato qui, la popolazione CD146 + L-MSC è molto simile precedentemente riportati popolazioni L-MSC come raggiunti dalla escrescenza o varie forme di FACS utilizzando marcatori di superficie cellulare staminali associate come Sca -1, ABCG2 e CD90. Rispetto al escrescenza L-MSC 13, CD146 + L-MSC sembrano avere una maggiore capacità di dare origine a colonie di cellule singole, ad indicare che il nostro metodo produce una più ricca della popolazione multipotenti L-MSC. Questo vantaggio è anche vero rispetto ai metodi che isolano L-MSC basate su CD90 7 o α del recettore del fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGFRα) 40,41, in quanto entrambi i marcatori di superficie selezionare anche più lipofibroblasts terminalmente differenziate e alveolari fibroblasti / strutturali e possono dunque solo ragionevolmente be identificato come cellule stromali 20,42. Al contrario, sia Sca-1 e ABCG2 sono ben documentati marcatori che correlano con staminalità e MSC espressione 9,43-46. ABCG2 + L-MSC tuttavia hanno una natura più endoteliale come sono positivi 99% per CD31 46, mentre il metodo riportato qui seleziona contro le cellule endoteliali attraverso il gradiente Ficoll e l'adesione di plastica. Il vantaggio principale del nostro metodo rispetto al protocollo di isolamento Sca-1 basato su McQualter e colleghi 5,8 è che è ampiamente applicabile a specie diverse da topi, nei quali Sca-1 non può essere utilizzato.

Anche se è molto difficile, probabilmente quasi impossibile, per ottenere una popolazione "puro" di L-MSC da un ritardo di sviluppo o adulto polmone e mantenerla in uno stato indifferenziato, il protocollo qui presentata fornisce un metodo rapido, coerente e affidabile di l'ottenimento di una popolazione di cellule altamente arricchito in res polmonari auto-rinnovamento multipotentiMSC ident. Usando questo metodo consente di studio più definito del ruolo della L-MSC in un'ampia varietà di modelli di malattia e il loro ruolo nel polmone sviluppo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

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Biologia delle cellule staminali Numero 108 mesenchimali cellule stromali cellule del tessuto residente staminali / progenitrici polmone ratto la medicina rigenerativa la selezione perla magnetica
Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni
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Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

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