Denne protokollen beskriver en isolasjons teknikk for å oppnå primær lunge hørende mesenchymal stromale celler fra rotter, ved bruk av enzymatisk fordøyelse, tetthetsgradient separasjon, plast tilslutning og CD146 + magnetiske kuler utvalg.
Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Dessuten har de sannsynligvis ha en rolle i normal organutvikling og er blitt tilskrevet roller i sykdommer, spesielt de med en fibrotisk natur. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene. Isolasjon teknikken beskrevet her gjelder flere kjennetegn ved lunge bosatt MSC (L-MSC). Etter ofring av rottene blir lunger ble fjernet og skyllet flere ganger for å fjerne blod. Etter mekanisk dissosiasjon av skalpellen, er lungene spaltet i 2-3 timer ved bruk av en blanding av kollagenase type I, nøytral protease og DNase type I. Det som ble oppnåddd enkeltcelle-suspensjon ble deretter vasket og lagt over tettshetsgradient medium (densitet 1,073 g / ml). Etter sentrifugering blir cellene fra den inter vasket og sådd ut i kultur-behandlede kolber. Celler dyrkes i 4-7 dager i fysiologisk 5% O2, 5% CO2-forhold. Å utarme fibroblaster (CD146 -) og for å sikre en befolkning på bare L-MSC (CD146 +), positiv utvelgelse for CD146 + celler utføres gjennom magnetiske kuler utvalg. Oppsummert produserer denne prosedyren pålitelig en befolkning på primær L-MSC for videre in vitro studier og manipulasjon. På grunn av naturen av protokollen, kan det lett bli oversatt til andre eksperimentelle dyremodeller.
Mesenchymale stromale celler (MSC) er i økende grad anerkjent for deres terapeutiske potensial i et bredt spekter av sykdommer, inkludert lungesykdommer. I tillegg til bruk av benmarg og navlestreng MSC for eksogene celleterapi, er det også økende interesse for reparasjon og regenerativ potensialet bosatt vev MSC. Under utviklingen, blant annet i lungene, er det mesenchyme en viktig kilde til utviklings signaler, og bosatt MSC er en sannsynlig kandidat til å være i sentrum for dette. Videre er bevis dukker opp som ilegges MSC er gjennomtrengt på voksne sykdommer, inkludert kreft 1,2 og fibrose tre. Den største hinder for studiet av disse hørende vev MSCer er mangelen på en klar markør for isolering og identifisering av disse cellene 4. Stamcelle antigen-1 (Sca-1) ble identifisert i mus som en markør for en rekke forskjellige vev stamceller, og kan anvendes for isolering av L-MSC 5, men har dessverreingen kjent ortologer i andre arter 6. Forskere har rapportert en rekke forskjellige isoleringsmetoder for isolering av L-MSC enten fra lungevev eller væske. Disse varierer fra fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) baserte metoder som selekterer for CD31 – / CD45 – / CD90 + celler 7, CD31 – / CD45 – / epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) – / Sca-1 + -celler til 8, multiresistens transporter ATP bindende kassett G (ABCG2) positive celler 9 eller Hoechst 33342 fargestoff utstrømming 10, til plast etterlevelse 11,12 og migrasjon ut av hakket vev 13.
Fordelene med den her presenterte fremgangsmåten er flere ganger. Ved hjelp av en svak enzymatisk fordøyelse og tetthetsgradient 14, får man alle cellene i tetthetsområdet som inkluderer MSC men ekskluderer epitelceller eller endotelceller. Den påfølgende plast adherenstrinn sikrer at bare den mesenchymal cellene holder seg og bo i kultur, eliminere leukocytter. Viktigst er imidlertid lar CD146 + seleksjonstrinnet for eliminering av fibroblaster, da disse celler ikke uttrykker CD146. Ekspresjon av celleadhesjonsmolekyl CD146 er positivt korrelert med multipotency, og er derfor en god markør for å luke ut fibroblaster fra en mesenchymale cellepopulasjon 15-19. Dette er en fordel i forhold til å bruke CD90 som en seleksjonsmarkør, som det ikke er bare uttrykt i MSC men også i lipofibroblasts 5,20. I denne protokoll har vi eksplisitt valgt en på magnetiske kuler valg, som det er mildere på cellene, og hele prosedyren kan utføres i sterile betingelser. En annen viktig fordel med denne isolasjonsmetoden i motsetning til den utvekst metode, er at det er forholdsvis rask, 6-10 dager i motsetning til en måned eller mer for utveksten metode. Tre til fem dager etter den første isolering av mesenchymale befolkningen er klar for CD146 + sele Dette skjer; etter ytterligere tre til fem dager CD146 + cellene er klare til å bli brukt til eksperimenter eller kan bli frosset for senere bruk. Den reduserte tiden av kultur forbedrer kvaliteten på cellene som MSC transdifferentiate mot fibroblaster i forlenget ex vivo kultur 19. Til slutt, på grunn av naturen av protokollen, er det mulig å anvende denne fremgangsmåte for andre arter ved ganske enkelt å velge egnede antistoffer, eller til og med til andre organsystemer ved å justere valg av fordøyelsesenzymer og inkubasjonstid.
En detaljert protokoll av denne isolasjonsmetoden er gitt nedenfor, og en skjematisk oversikt over isolasjon og påfølgende valg av CD146 + undergruppe er gitt i Figur 1A og 1B henholdsvis. I tillegg er detaljer inkludert for aging, frysing og tining disse cellene.
ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk oversikt over isolasjonen av pulmonale mesenchymale celler (A) og etterfølgende CD146 + valget av celler (B), min = minutter.; EDTA = Ethylenediaminetetraacetic syre; 2. Ab = sekundært antistoff; a-CD146 Ab = primære anti-CD146 antistoff; ve celler = CD146 negative celler; + ve celler = CD146-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Isolering og kultur av primær L-MSC presenterer en mulighet til å bedre forstå deres funksjon og deres samspill med andre cellepopulasjoner på cellenivå, og deres rolle i lunge utvikling, helse og sykdom. Dette er særlig viktig som mangel på en spesifikk markør enkelt av disse cellene gjør det nesten umulig å studere disse cellene in situ. Som med alle primære cellepopulasjoner, bør man huske på at disse cellene er mer sannsynlig å endre sin karakter jo lengre de blir holdt i kultur 19 …
The authors have nothing to disclose.
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |