Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Detta protokoll beskriver en isolerings teknik för att erhålla primära lung bosatta mesenkymala stromaceller från råttor, genom användning av enzymatisk nedbrytning, densitetsgradient separation, plast vidhäftning och CD146 + magnetisk pärla urval.

Abstract

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Dessutom är de sannolikt har en roll i normal organutveckling, och har tillskrivits roller i sjukdomar, särskilt de med en fibrotisk natur. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler. Isoleringen teknik som beskrivs här gäller flera egenskaper hos lung bosatta MSC (L-MSC). Vid offer råttorna, är lungorna avlägsnas och sköljs flera gånger för att tvätta bort blodet. Efter mekanisk dissociation av skalpell, är lungorna digererades under 2-3 h med användning av en blandning av kollagenas typ I, neutralt proteas och DNase typ I. obtained enkelcellsuspension tvättas därefter och skiktades över densitetsgradient-medium (densitet 1,073 g / ml). Efter centrifugering, är celler från interfas tvättades och ströks ut i odlingsbehandlade kolvar. Cellerna odlas under 4-7 dagar i fysiologisk 5% O2, 5% CO2 villkor. Att utarma fibroblaster (CD146 -) och för att säkerställa en population av endast L-MSC: er (CD146 +), positiv selektion för CD146 + -celler utförs genom magnetisk pärla val. Sammanfattningsvis, detta förfarande på ett tillförlitligt sätt ger en population av primär L-MSC för vidare in vitro-studier och manipulation. På grund av arten av protokollet, kan det lätt översättas till andra experimentella djurmodeller.

Introduction

Mesenkymala stromaceller (MSC) är i allt större utsträckning för deras terapeutiska potential i ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive lungsjukdomar. Förutom användning av benmärg och navelsträngs MSCs för exogen cellterapi, finns det också ett ökat intresse för reparation och regenerativ potential bosatta vävnads MSC. Under utveckling, bland annat i lungan, är mesenkym en viktig källa till utvecklings ledtrådar, och bosatta MSC är en trolig kandidat för att stå i centrum för detta. Dessutom är bevis fram som bosatta MSC störs hos vuxna sjukdomar, inklusive cancer 1,2 och fibros 3. Den främsta hindret för studier av dessa bosatta vävnads MSC är bristen på en tydlig markör för isolering och identifiering av dessa celler 4. Stamcellantigen-1 (Sca-1) identifierades i möss som en markör för en mängd olika vävnads stamceller, och kan användas för isolering av L-MSC 5, men har tyvärringen känd ortologer i andra arter 6. Forskare har rapporterat en mängd olika isoleringsmetoder för isolering av L-MSC från antingen lungvävnad eller vätska. Dessa varierar från fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) baserade metoder selektering för CD31 - / CD45 - / CD90 + celler 7, CD31 - / CD45 - / epitelial celladhesionsmolekyl (EpCAM) - / Sca-1 + -celler 8, multidrogresistens transportör ATP-bindande kassett G (ABCG2) positiva celler 9 eller Hoechst 33342 färgämne efflux 10, till plast vidhäftning 11,12 och migration av malet vävnad 13.

Fördelarna med den häri presenterade förfarandet är flerfaldigt. Genom att använda en mild enzymatisk spjälkning och densitetsgradient 14, erhåller man alla celler i densitetsintervallet som inkluderar MSCs men utesluter epitelceller eller endotelceller. Den efterföljande plast vidhäftning steg säkerställer att endast mesenchymal celler vidhäftar och bo i kultur, vilket eliminerar leukocyter. Viktigast dock tillåter CD146 + val steg för eliminering av fibroblaster, eftersom dessa celler inte uttrycker CD146. Expression av celladhesionsmolekylen CD146 är positivt korrelerad med multipotens, och är därför en bra markör för att sålla ut fibroblaster från en mesenkymal cellpopulation 15-19. Detta är en fördel jämfört med användning av CD90 som en selektionsmarkör, eftersom det inte är bara uttrycks i MSC: er utan också i lipofibroblasts 5,20. I detta protokoll har vi uttryckligen valt en magnetisk pärla urval, eftersom det är skonsammare på cellerna, och hela proceduren kan ske under sterila förhållanden. En annan viktig fördel med denna isoleringsförfarandet i motsats till utväxt metoden, är att det är relativt snabbt, 6-10 dagar i motsats till en månad eller mer för utväxt metoden. Tre till fem dagar efter den första isoleringen av mesenkymala befolkningen är redo för CD146 + sele ction; efter ytterligare tre till fem dagar de CD146 + cellerna är redo att användas för försöken eller kan frysas för senare användning. Den minskade tiden för kultur förbättrar kvaliteten på celler som MSCs transdifferentiera mot fibroblaster i förlängd ex vivo kultur 19. Slutligen, på grund av den typ av protokoll är det möjligt att tillämpa denna metod på andra arter genom att helt enkelt välja lämpliga antikroppar, eller till och med till andra organsystem genom att justera valet av matsmältningsenzymer och inkubationstiden.

En detaljerat protokoll av denna isolering metod ges nedan och en schematisk översikt av isolering och efterföljande selektion av CD146 + subpopulation ges i figur 1A och 1B respektive. Dessutom är uppgifter ingår för passage, frysning och upptining dessa celler.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk översikt av isolering av lung mesenkymala celler (A) och efterföljande CD146 + cellval (B) min = minuter.; EDTA = etylendiamintetraättiksyra; 2 nd Ab = sekundär antikropp; a-CD146 Ab = primär anti-CD146-antikropp; ve celler = CD146 negativa celler; + ve celler = CD146 positiva celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av Animal Care kommittén vid universitetet i Ottawa (djuretik protokoll Ohří-1696). Djurvård utfördes i enlighet med institutionens riktlinjer.

1. Isolering av Lung mesenkymala stromaceller celler

  1. Förbered enzymblandningen i en 50 ml tub: väga in 30 U neutralt proteas, 2500 U kollagenas I och 500 U DNAse I. Dessa belopp räcker för lungorna hos en vuxen mus eller råtta valp. Förbereda på dag av isolering och förvara vid 4 ° C fram till användning.
  2. Offer råttungar på dag 13 efter en intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Använd tå nypa reflex att etablera medvetslöshet. Djurets död säkerställs genom att öppna bröstkorgen, som det beskrivs nedan.
  3. Sanitize huden genom sprutning djuret med 70% etanol och öppna försiktigt bröstkorgen med hjälp av kirurgiska saxar, med början vid diafragman och skärning i riktning mot den rostrala sidan, är mycket noga med att inteför att skada lungorna. Sprid bröstkorgen öppen med hjälp av blodstillande klämmor, eller alternativt skära bort bröstkorgen för att ge tillgång till bröstkorgen.
  4. Exsanguinate djuret genom att ta bort hjärtat. För att ta bort hjärtat, ta tag i bräss och hjärta med små pincett och skär bort dessa med kirurgisk sax. Omedelbart därefter absorbera blodet med en gasväv tills ingen mer blod kommer ut ur den avskurna aorta och lungartären.
  5. Ta lungorna från bröstkorgen på följande sätt: Håll luftstrupen med små pincett, sedan avskilja luftstrupen med kirurgiska sax på rostralt sidan. Medan försiktigt dra lungan paketet ut ur bröstkorgen, skära bort för bindväv på ryggsidan längs bröstkorgen för att frigöra lungorna.
  6. Sever lungorna från aorta och matstrupen genom att skära längs membranet med kirurgisk sax. Nu att lungorna är helt fria från bröstkorgen avlägsna eventuellt kvarvarande blodet försiktigt med en gasbinda.
  7. Ta bort luftstrupen och bronkerna med surgiska sax och försiktigt överföra lungloberna till ett 50 ml rör innehållande kall 35 ml 30% citrat-fosfat-Dextros Adenin (CPDA-1) antikoagulant (26,30 g trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g askorbinsyra monohydrat, 2,22 g mononatrium-divätefosfat, 31,80 g D-glukos, 0,275 g adenin i en L renat H2O; sterilfilter om lösningen med en 0,22 ^ m membranfilter före användning) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna blod och skräp.
  8. Efter en 5 min sköljning i 30% CPDA-1 / PBS, överföra lungan i ett annat 50 ml rör innehållande 35 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (RT), invertera försiktigt för att avlägsna citrat. Överföring till ett rör innehållande 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-pyruvat + glukos (DPBS ++) (RT). Varje sköljningssteg bör ta ungefär fem minuter.
    Obs: DPBS ++ kan beställas kommersiellt eller göras enligt följande 21: kalciumkloriddihydrat 132,4 mg, magnesiumkloridhexahydrat 100 mg, kaliumklorid (vattenfri) 200 mg, monobasiskt kaliumfosfat (vattenfritt) 200 mg, natriumklorid (vattenfri) 8000 mg, dibasisk natriumfosfat (vattenfritt) 1,144.5 mg, D-glukos 1000 mg, natriumpyruvat 36 mg i 1 L renat H2O, pH 7,3. Sterilt filter lösningen med en 0,22 um membranfilter före användning.
  9. Upplösa enzymblandningen genom tillsats av 10 ml DPBS ++ (värmts upp till 37 ° C) och att försiktigt vända dem tills det är upplöst.
  10. Överföra lungorna i ett annat 50 ml rör och hacka lungan på väggen av röret med användning av en skalpell tills fint hackad. Tillsätta enzymet mixen till vävnaden (10 ml enzymblandning / per vuxen mus / råttunge lunga), förslut röret tätt och inkubera vid 38 ° C under försiktig omrörning (antingen i en termisk bländare, ett skakande vattenbad, eller en vatten bad med vanlig manuell omrörning). Varaktigheten beror på vilken typ av vävnad: fostervävnad 60 min, juvenil / vuxen vävnad 90-120 min, fibrotisk vuxen vävnad 120-150 min.
  11. Stoppa matsmältningen genom kelatbinda de bivalenta katjoner wed 200 ^ etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilfilter lösningen med en 0,22 um membranfilter före användning).
  12. Tillsätt 20 ml 5% fetalt bovint serum (FBS) / PBS och passera hela suspensionen genom 100 | im cellfilter in i ett nytt 50 ml rör. Skölj röret och cellfilter med 10 ml 5% FBS / PBS, vilket ökar det totala volymen till 40 ml.
  13. Centrifugera i 5 minuter vid 500 xg, RT.
  14. Avlägsna supernatanten (pellets ska vara klart synliga), återsuspendera i 40 ml 5% FBS / PBS och upprepa centrifugeringssteg 1,13.
  15. Resuspendera i 4 ml 5% FBS / PBS (RT) och lager försiktigt över 3 ml densitetsgradient media (1,073 g / cm 3) i ett 15 ml rör 14. För att få en bra mellanfas, är det viktigt att skiktning av enkelcellsuspension sker vid en> 45 ° vinkel vid mycket låg hastighet.
  16. Centrifugera 20 minuter vid 900 xg, medium (5/10) acceleration, ingen retardation, 19 ° C.
  17. Samla upp cellerna som är närvarande i iterphase och återsuspendera dem i 10 ml steril PBS.
  18. Centrifugera i 5 minuter vid 500 xg, 21 ° C.
  19. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml förvärmda avslutade L-MSC odlingsmedium (minimalt essentiellt medium Eagle, alfa modifiering (aMEM), kompletterat med 2 mmol L-glutamin per 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS och 1% vol / vol Penicillin / streptomycin / Amphotericin B.
  20. Upprepa centrifugeringssteg 1,18. Därefter, ta bort supernatanten och återsuspendera i 10 ml förvärmda färskt odlingsmedium.
  21. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatisk cellräknare och platta med hög densitet, eftersom majoriteten av celler i detta skede är inte plast anhängare. Den exakta plätering densiteten beror på djurarten och ålder, t ex, är cellerna hos en vuxen muslunga sådda på 10 5 celler / cm 2, medan celler från en råttunge lunga är tillräckligt tät med en såddtäthet av 1-2 x 10 4 celler / cm2 cm2.
  22. Kultur L-MSC: er i en fuktad 5% O2, 5% CO2 atmosfär vid 37 ° C.
  23. Ändra mediet 24 h efter den initiala ympningen, och därefter var 3 dagar efter sköljning en gång med PBS. Celler bör odlas tills 80-90% konfluens, som tar 3-5 dagar i genomsnitt beroende på djuret av ursprung. Högre flödet kommer att främja differentiering i fibroblaster.

2. Val av CD146 + Lung mesenkymala stromaceller celler

  1. Beläggning av magnetiska pärlor med sekundär antikropp
    1. Belägga de magnetiska pärlor med biotinylerad sekundär antikropp, vid ett förhållande av 10 | j, g sekundär antikropp / 100 | j, l magnetiska pärlor i en rundbottnad sterila 2 ml cryovial under sterila förhållanden. Använd 10 l sekundär antikropp per förväntade 0,5 x 10 6 celler, och använda ett minimum av 100 pl magnetiska pärlor och 10 mikrogram antikropp.
      Obs: Förhållandet mellan entibodies används per volym av pärlor kan variera mellan tillverkare, kontakta tillverkarens anvisningar för pärlorna av val. För detta protokoll, se tabell 1 för pärlorna och antikroppar som användes i optimeringen av detta protokoll.
    2. Inkubera i en roterande provblandare under 30 min vid 30 rotationer / minut (rpm), vid RT.
    3. Resuspendera kulorna i 1,5 ml steril 0,1% bovint serumalbumin (BSA) / PBS och överför till en 3 ml rundbottnad rör (flödescytometri rör). Skölj cryovial med ytterligare 1,5 ml 0,1% BSA / PBS och överför till 3 ml rör.
    4. Placera röret på en lämplig magnet och vänta 2 min tills alla pärlorna är fästa till den bakre väggen av röret och lösningen förblir klar. Ta avrinning och upprepa tvätt med 3 ml 0,1% BSA / PBS två gånger.
    5. Resuspendera pärlor i 3 ml 0,1% BSA / PBS och förvara vid 4 ° C, skyddat från ljus. Använd inom 5 dagar.
  2. Märkning CD146 + L-MSC
    1. Skörda mesenkymala celler efter sköljning med PBS med användning av en mild icke-trypsinlösning.
      Notera: Volymerna är beroende på storleken av odlingskolv (0,2 ml / cm 2 medium eller PBS).
      1. Ta bort odlingsmedium och skölj celler tre gånger med steril PBS.
      2. Tillsätt en lämplig mängd av mild icke-trypsin lösning (se tabell 1). Inkubera vid 37 ° C i inkubatorn tills cellerna har lossnat, ca 10 min vid användning av lösningen i tabell 1.
      3. Inaktivera enzymet genom att tillsätta L-MSC-odlingsmedium, och centrifugera under 5 min vid 500 x g.
    2. Avlägsna supernatanten, återsuspendera cellerna i 0,1% BSA / PBS och räkna cellerna med en hemocytometer eller automatisk cellräknare.
      Obs: Den volym av 0,1% BSA / PBS beror på storleken av odlingskolv: sikta på 5 eller 10 ml 0,1% BSA / PBS.
    3. Upprepa steg 2.2.2 och suspendera den särskilda mängden celler i 3 ml 0,1% BSA / PBS (block unspecifika bindningsställen och håller cellerna vid liv). Håll celler på is.
    4. Förbered en 3 ml rundbottnade rör med den primära anti-CD146-antikropp, och hålla på is.
      Obs: Koncentrationen av primär antikropp som tillsätts till den dedicerade mängden av celler beror på den antikropp som används. För en föreslagen anti-råtta CD146 antikropp se tabell 1.
    5. Lägga den totala volymen av celler från steg 2.2.3 till röret med den primära antikroppen. Sluter tätt och inkubera 30 min på en roterande provblandare vid 15 varv per minut, 4 ° C.
    6. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 500 xg, 4 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 ml 0,1% BSA / PBS. Upprepa centrifugsteget.
    7. Resuspendera cellerna i 3 ml lösning innehållande sekundära antikroppsförsedda pärlor som framställdes enligt anvisningarna i avsnitt 2.1 och inkubera 30 min på en roterande provblandare vid 15 varv per minut, 4 ° C.
  3. Välja CD146 + L-MSC
    1. Placera röret innehållande den märkta CD146 + L-MSC på magneten. De positiva celler kommer att dras till den bakre delen av röret. Utan att flytta röret eller röra pärlorna, skörda supernatanten med de negativa cellerna långsamt med en steril pasteurpipett (dessa kan antingen samlas in eller kasseras baserat på experimentell design).
    2. Ta bort röret från magneten och resuspendera cellerna i 3 ml 10% BSA / PBS. Upprepa urvalsförfarande som beskrivs i steg 2.3.1. ytterligare fyra gånger (Σ 5 urvals steg).
    3. Suspendera CD146 + L-MSC i förvärmda L-MSC odlingsmedium och återvänder till magneten.
    4. Avlägsna supernatanten, återsuspendera i L-MSC odlingsmedium och plattan i en lämpligt dimensionerad odlingskolv (0,2 ml / cm 2). Som en tumregel, platt celler i samma storlek kultur kolven från vilken cellerna lyftes före pärla-val. Antalet CD146 + L-MSC: er, och därför pläteringen densitet, kommeratt bero på ålder, art och stam av källdjuret. Strävar alltid efter en plätering densitet av ~ 5000 celler / cm2.
      Obs: Kulorna kommer inte att störa celltillväxt och kommer successivt att försvinna när cellerna föröka sig.

3. Frys celler

  1. Använda följande frysning media: 60% pentastärkelse-lösning (10% pentastärkelse i 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% dimetylsulfoxid (DMSO) 22.
    Obs: Om inte alla ingredienser finns, är en lösning innehållande 5% DMSO, 30% FBS och 65% aMEM ett bra alternativ.
  2. Återsuspendera celler vid 0,5 x 10 6 celler / ml, delprov i kryokärl om 1 ml vardera och frys O / N vid -80 ° C med användning av en frysbehållare.
  3. Överföring till en flytande kväve lagringstank nästa dag.

4. Upptinings Celler

  1. Tina en ampull med celler i ett 37 ° C vattenbad i 5 min.
  2. Resuspendera cellerna i 10 mlförvärmda odlingsmedium och centrifugera under 5 minuter vid 500 xg, 21 ° C.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml odlingsmedium. Seed celler i ett ventilerat lock cellkultur behandlade kolvar vid 5000 celler / cm2 i 0,2 ml / cm2 medier (t.ex., 15 ml för en 75 cm 2 kolv).
  4. Kulturceller i 5% O 2, 5% CO2 tills 80-90% konfluenta efter skörd och / eller experimentell användning. Över konfluens kommer att inducera differentiering. När ympning vid 5000 celler / cm 2, kommer L-MSC: er nå 80-90% konfluens inom 3-4 dagars odling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två av de mest pålitliga fysiska egenskaperna hos MSC, densitet och plast vidhäftning, används i den första delen av detta protokoll för att erhålla mesenkymala cellfraktionen i lungan som innehåller L-MSC. Även om densitetsgradient inter inkluderar monocyter och makrofager förutom lunga mesenkymala celler, plast vidhäftning följt av 3-5 dagars odling säkerställer att endast de lung mesenkymala celler kvar. I själva verket denna cellpopulation uttrycker den klassiska MSC ytmarkörer CD73, CD90 och CD146 och är negativ för markörerna CD34, CD45, större histokompatibilitetskomplex typ II (MHCII) -RT1B, CD11b och CD79a, vilket indikerar att det inte längre finns några leukocyter närvarande i cellpopulationen (figur 2A). Av intresse är att ur CD146 + delmängd, är ett område av 44,4-65,7% även CD73 + och CD90 + (data visas ej). Dessutom är denna cellpopulation kapabel att enkolonibildande enhet (CFU) effektivitet som vid ~ 30% är mycket högre än vad som allmänt rapporterats för benmärgs MSC: er eller till och med andra typer MSC (figur 2b), och differentierar längs de tre klassiska MSC härstamningar (fig 2C).

figur 2
Figur 2. MSC egenskaper efter enzymatisk spjälkning, densitetsgradient separation och plastisk vidhäftning. (A) Expression av MSC-relaterade ytmarkörer CD146, är CD73 och CD90 närvarande i en del av plast vidhäftande cellpopulationen, medan de negativa leukocyt markörer CD11b, CD79a , CD34, CD45 och MHCII-RT1B var nästan inte uttrycks. (B) kolonibildande enhet-analys genom begränsande spädningsanalys (5 celler / cm 2) indikerade att ~ 30% av plast vidhäftande celler hade en klonal kapacitet, som indikerar MSC: er. (C) Plast vidhäftande cells kunde av osteogent matrisproduktion (röd), innehöll ett större antal små lipidvesiklar (röd) när inducerade med adipogena differentieringsmedium jämfört med icke-differentierade kontroller och bildade kondrogena som sfärer som innehåller kondrocyter (röd). Data presenteras som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM). All data genererades med passage 1-3 celler. NM = negativa markörer; CFU = kolonibildande enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Dock är den viktigaste förbehållet att denna befolkning som troligen innehåller både L-MSC och olika subtyper av lungfibroblaster, L-MSC differentierade avkomma 23. Eftersom multipotens är positivt korrelerad med CD146 uttryck, och fibroblaster bör inte ha några uttryck för denna markör, positiv selektion av CD146 + subpopulationen ostensibly resulterade i en cellpopulation som är mycket anrikat i L-MSC. Detta framgår tydligt av en högre andel av cellpopulationen uttrycker MSC samband ytmarkörer (figur 3a), en betydligt högre kolonibildande potential ~ 80% (Figur 3B) och en starkare differentiering svar i synnerhet den kondrogena linjen (figur 3C) jämfört med den totala mesenkymala befolkningen som erhålls före CD146 val. Att notera är att dessa L-MSC formen endast mycket få verkliga adipocyter, men visar många fler spindelformade celler som är fyllda med små lipidvesiklar. Dessa kan återspegla den lipofibroblast härstamning som är avgörande för både lungutveckling och alveolär typ II cell stöd. Efter CD146 urval, kan observeras mer adipocyt liknande celler fyllda med stora lipidvesiklar (figur 3C) jämfört med före CD146 urval, men majoriteten av cellerna är fortfarande den lipofibroblasts liknande cells innehållande små lipidvesiklar.

Figur 3
Figur 3. MSC egenskaper efter ytterligare CD146 + magnetisk pärla val. Efter positiv selektion av CD146 + subpopulation, dessa celler uppvisade en högre uttryck av MSC-relaterade ytmarkörer, CD73 särskilt (A), en betydligt högre CFU effektivitet efter en enda cell plätering (B), och en starkare differentiering svar för särskilt den kondrogena linjen och i mindre utsträckning adipogena linjen (C). Data presenteras som medelvärde ± SEM. All data genererades med passagen 3 celler. NM = negativa markörer; CFU = kolonibildande enheter. Klicka här to se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den isolering och odling av primär L-MSC innebär en möjlighet att bättre förstå deras funktion och deras interaktion med andra cellpopulationer på cellnivå, och deras roll i lungutveckling, hälsa och sjukdom. Detta är särskilt viktigt eftersom det saknas en specifik enskild markör för dessa celler gör det nästan omöjligt att studera dessa celler in situ. Som med alla primära cellpopulationer, bör man ha i åtanke att dessa celler är mer benägna att ändra sin karaktär ju längre de hålls i kultur 19 (översikt i 24). För att hålla L-MSC i ett tillstånd som är så nära som möjligt till sitt naturliga tillstånd, är det mycket viktigt att de odlas i 5% O2, 5% CO2, i en 37 ° C fuktad inkubator. I andningsfysiologi det är allmänt accepterat att baseras på Daltons lag partialtryck, är det partiella syretrycket i luften (21% O 2) 160 mmHg, och sjunker till ~ 101 mmHg i alveolära luftrum 25-27. I en mogen lunga den alveolära-arteriella PaO två lutning är ~ 3-4 mmHg, men detta kan ökas väsentligt i en sjuk eller omogna lungor där alveolär-arteriell avstånd ökas 25,28. Inuti kroppen, är det mesenkyma nisch som normalt upprätt en syrekoncentration av 2-8% 29,30. Bara några papper har faktiskt mätt PO2 i lungorna, men en studie mätte detta i lungorna hos 20 patienter, hitta ett område i normal lunga PO2 från 23 till 656 mmHg, med en median på 42,8 mmHg 27,31. Enligt Daltons lag, en fuktad inkubator med en temperatur av 37 ° C och 5% O2 har en PO 2 ~ 36 mmHg, som faller helt inom intervallet mätt i normal lungvävnad och är mycket nära medianen. Dessutom låg syreodlingsbetingelser främjar upprätthållandet av föregångarpopulationer i kultur 29. Tagna tillsammans, det jagär svårt att säga exakt vad syrehalt L-MSC utsätts för in situ vid olika stadier under normal utveckling efter födsel eller sjukdom, men det verkar som om 5-10% O 2 är sannolikt den mest exakta ur ett fysiologiskt perspektiv 27,31. Baserat på informationen ovan citerade, valde vi att behålla 5% O 2 i vårt odlingsbetingelser, och vi fann att när dessa förhållanden upprätthålls in vitro kommer L-MSC växa snabbare, visar färre spänningsfibrer, och har en mindre sannolikhet av spontan differentiering eller åldrande. Ytterligare faktorer som kommer att förhindra spontan differentiering eller andra avvikelser är att använda en mild icke-trypsin dissociation agent för passage, passage L-MSC när de når 80-90% konfluens (täta förhållanden kommer att främja fibroblast differentiering), och hålla passagenummer låg (<P4). I en studie av Hoffmann och kollegor, var trypsin visat sig ha negativa effekter på L-MSC-funktion ochfenotyp, medan trypsin fria dissociation agenter kan bevara denna 13.

För att optimera utbytet under isoleringsprocessen, är det viktigt att mala lungorna så fint som möjligt, och samtidigt hålla i minnet att vävnaden inte bör tillåtas att torka. Under enzymatisk spjälkning, är det viktigt att rören är agiteras oftare om inte användning av en upphettad skakning anordningen, såsom vävnaden bitar sedimenterar och inte kommer att få optimal exponering för enzymerna. En annan avgörande steg är densitetsgradient separation: om skiktning inte sker mycket långsamt eller i en vinkel <45 °, kommer det att leda till blandningen av de två vätskorna i stället för skiktning, vilket orsakar förlust av hela cellpopulationen. Dessutom är densiteten hos densitetsgradienten mediet mycket beroende av den omgivande temperaturen. Någon annan temperatur än 19 ° C (eller RT), kommer att resultera i suboptimal eller ingen densitetsgradient separation.

Av intresse för fRAMTIDA användare av detta protokoll är att vi framgångsrikt har isolerat livskraftig L-MSC från lungorna som skördades upp till 24 timmar innan isolering, under förutsättning att lungorna är direkt lagras i kallt L-MSC media vid skörd, och hölls vid 4 ° C. Detta möjliggör mer flexibel försöksplanering, eller till och med transport av lungor mellan olika laboratorier. Utbytet är i allmänhet liknande den hos nyskördade lungor, och celler växer lika bra.

En annan förändring som skulle vara möjligt, är att använda FACS i stället för magnetisk pärla val, även om denna metod utsätter cellerna till mer stress proceduren tar längre tid och som celler utsätts för höga tryck och hastigheter, och hamnar risken för kontaminering om det inte görs under sterila betingelser. De magnetiska pärlorna som används här inte stör celltillväxt, och försvinner inom några dagar av kultur. En preferens för FACS eller magnetisk pärla sortering kan också bero på anläggningar som finns tillgängligatill slutanvändaren. Dessutom skulle det vara möjligt att ändra detta protokoll för att isolera bosatta MSC från andra vävnader. I detta fall skulle det vara viktigt att anpassa de enzymer till organet av intresse, som matriskompositionen varierar mellan organ.

En viktig begränsning av enbart med hjälp av densitetsgradient och efterföljande plast vidhäftning för att erhålla mesenkymala celler, är att den resulterande populationen innehåller både L-MSC och fibroblaster. Selektering för CD146 + -celler starkt botemedel detta förbehåll, men trots den CD146 + urvalsförfarandet och de noggranna odlingsbetingelserna, den typ av L-MSC och effekterna av in vitro cellkultur gör det omöjligt att undvika en viss grad av differentiering till fibroblaster. MSCs i allmänhet har rapporterats innehålla en hierarki av multipotens, i vilka celler längre ner i hierarkin förlorar långsamt sin multilineage potential tills de blir terminalt differentierade fibroblaster <sup> 23. Med all sannolikhet detta inträffar också i L-MSC nisch 4, och verkar återspeglas i den odlade CD146 + befolkningen som redan en passage efter CD146 + val ungefär 40% av cellerna har förlorat CD146 uttryck. Dessutom, i denna patientgrupp finns det bara 80% CD73 och 40% CD90 uttryck. Delvis kan detta förklaras av MSC hierarki av multipotens. Det skulle vara möjligt att CD146 + genomgå asymmetrisk spridning, vilket ger upphov till både CD146 positiva MSC och negativa, mer differentierade, dotterceller. Resident MSCs i lungan skulle också rimligen kan förväntas ha en något annorlunda fenotyp och funktion från benmärgs MSC, där definitionen av CD73 och CD90 uttryck baserades. International Society for Cellterapi har erkänt att inte alla MSC uttrycka de klassiska MSC markörer, inklusive CD73 och CD90, och denna yta markör uttryck är inte det bästa sättet att definiera MSC 32. exceptionally hög CFU effektivitet ~ 70% av CD146 + L-MSC befolkningen stöder denna. Eftersom CD146 + befolkningen presterar bättre med avseende på MSC egenskaper än den osorterade mesenkymala befolkningen, har författarna inte vidare präglat CD146 - befolkningen. Vi strävade efter att berika vår mesenkymala befolkning med MSC och tömma dem av fibroblaster, men vi gör inte anspråk på att detta är den enda sanna L-MSC befolkningen. L-MSC är sannolikt mycket heterogen, både i ursprung, fenotyp och funktion.

Även CD146 är allmänt erkänt att vara en markör för multipotens i MSC och pericyter 16,17,33,34, är mycket lite känt om CD146 + MSC befolkningen in vivo. CD146 är en celladhesionsmolekyl som är viktig för angiogenes och endotel cellfunktion, och uttrycks i endotelceller, glatta muskelceller, pericyter, MSC: er och T-lymfocyter 15,16,35,36. Under de senaste årenBevis har framkommit att MSC bebor perivaskulär nisch i flera organ, som CD146 + celler co-fläck för MSC-markörer CD73 och CD105 37. Faktum är odlade pericyter och MSC har en mycket likartad genuttryck profil 38, stärker uppfattningen att MSC kommer från pericyter 4,39. Även om vi inte har utfört immunohistokemiska analyser för att bestämma platsen för vårt CD146 + L-MSC befolkningen, är det mycket troligt att de också skulle placeras i en perivaskulär plats. Framtida studier kommer att behövas för att kontrollera om detta är fallet. Det är möjligt att en del av vår cellpopulationen är pericyter, även om det bör påpekas att alla celler ser fenotypiskt mycket lik efter CD146 + val.

Mesenkymala stromaceller är notoriskt svåra att identifiera på grund av avsaknaden av ett enda allomfattande markör. Olika studier har rapporterat olika metoder för isoleringav L-MSC, och har på ett övertygande sätt visat att dessa cellpopulationer är lika varandra med avseende på MSC markör uttryck. Baserat på karakterisering av CD146 + L-MSC som presenteras här, CD146 + L-MSC befolkningen är mycket lik tidigare rapporterade L-MSC populationer som uppnås genom utväxt eller olika former av FACS med hjälp av stamceller associerade ytmarkörer som SCA -1, ABCG2 och CD90. Vid jämförelse med utväxt L-MSC: er 13, CD146 + L-MSC: er verkar ha en större förmåga att ge upphov till kolonier från enstaka celler, vilket indikerar att vår metod ger en mer berikad multipotent L-MSC befolkningen. Denna fördel är också sant vid jämförelse med metoder som isolerar L-MSC: er baserade på CD90 7 eller blodplätthärledda tillväxtfaktorreceptor α (PDGFRα) 40,41, som båda ytmarkörer väljer också för fler terminalt differentierade lipofibroblasts och alveolära / strukturella fibroblaster och kan därför endast rimligt be identifierats som stromaceller 20,42. Däremot är både Sca-1 och ABCG2 väldokumenterade markörer som korrelerar med stemness och MSC expression 9,43-46. ABCG2 + L-MSC har dock en mer endotel natur eftersom de är 99% positiva för CD31 46, medan metoden redovisas här väljer mot endotelceller genom Ficoll-gradient och plast följsamhet. Den största fördelen med vår metod jämfört med Sca-1 baserad isolering protokoll av McQualter och kollegor 5,8 är att det är allmänt tillämpas på andra än möss arter, där SCA-1 inte kan användas.

Även om det är mycket utmanande, förmodligen nästan omöjligt, att erhålla en "ren" population av L-MSC från en sen utveckla eller en vuxen lunga och vidmakthålla det på ett odifferentierat tillstånd, protokollet presenteras här ger en snabb, konsekvent och tillförlitlig metod för erhålla en cellpopulation höganrikat i multisjälvförnyande lung resIdent MSCs. Med denna metod kommer att möjliggöra en mer definierad studie av den roll som L-MSC i en mängd olika sjukdomsmodeller och deras roll i utvecklingen av lungan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Stem Cell Biology mesenkymala stromaceller vävnad bosatt stam / progenitorceller lunga råtta regenerativ medicin val magnetisk pärla
Isolering av CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenkymala stromaceller celler från råttlungor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter