Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Этот протокол описывает методику изоляции для получения мезенхимальных стромальных клеток первичных резидентные легких у крыс, посредством использования ферментативного расщепления, разделения в градиенте плотности, пластической адгезии и CD146 + магнитного отбора борта.

Abstract

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Кроме того, они, вероятно, играют определенную роль в нормальном развитии органов и были приписаны роли в болезни, особенно с фиброзной природой. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток. Метод выделения описано здесь применяется несколько характеристик МСК резидентов легких (L-МСК). После умерщвления крыс, легкие удаляют и промывают несколько раз, чтобы удалить кровь. После механической диссоциации скальпелем, легкие перевариваются в течение 2-3 ч, используя комбинацию типа коллагеназы I, нейтральной протеазы и типа ДНКазы И. obtaineд сингл клеточную суспензию затем промывали и наслаивали на градиент плотности среде (плотность 1,073 г / мл). После центрифугирования клетки из интерфазы промывают и высевают в культуральных колбах обработанных. Клетки культивировали в течение 4-7 дней в физиологическом 5% O 2, 5% СО 2 условия. Чтобы истощить фибробласты (CD146 -) и обеспечить население только L-МСК (CD146 +), позитивной селекции для CD146 + клеток осуществляется через магнитное отбора борта. Таким образом, эта процедура надежно производит население первичной L-МСК для дальнейшего изучения и манипулирования в пробирке. Из-за природы протокола, он может быть легко переведено в других экспериментальных моделях на животных.

Introduction

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК) получают все большее признание за их терапевтический потенциал в широком спектре заболеваний, в том числе заболеваний легких. Кроме того, использование костного мозга и пуповинной МСК шнур для экзогенной клеточной терапии, там также растет интерес к ремонту и регенеративный потенциал МСК резидентов тканей. Во время разработки, в том числе в легких, мезенхима является важным источником сигналов развития и резиденты МСК являются вероятным кандидатом, чтобы быть в центре этого. Кроме того, доказательства вытекает что МСК резиденты возмущается у взрослых заболеваний, в том числе рака 1,2 и фиброза 3. Основным препятствием для изучения этих МСК резидентов ткани является отсутствие четкой маркера для выделения и идентификации этих клеток 4. Стволовыми клетками антигена-1 (Sca-1) был идентифицирован у мышей в качестве маркера для различных стволовых клетках тканевой, и может быть использован для изоляции L-МСК 5, но имеет, к сожалению,нет известных ортологи у других видов 6. Исследователи сообщили различные методы изоляции для изоляции L-МСК с любой ткани легкого или жидкости. Они варьируются от клеток с возбуждением флуоресценции сортировки (FACS), основанные методы селекции CD31 - / CD45 - / CD90 + клетки 7, CD31 - / CD45 - / эпителиальных молекула клеточной адгезии (EpCAM) - / SCA-1 + клеток 8, множественная лекарственная устойчивость транспортер АТФ связывающего кассетного G (ABCG2) позитивные клетки 9 или Hoechst 33342 отток красителя 10, к пластической присоединения 11,12 и миграции из рубленого ткани 13.

Преимущества настоящего документа представлены метода несколько раз. При использовании нежный ферментативного расщепления и градиент 14 плотности, получаем все клетки диапазоне плотностей, которые включают МСК, но исключают эпителиальные или эндотелиальные клетки. Последующее пластиковые шаг соблюдение гарантирует, что только mesenchymal клетки придерживаться и остаться в культуре, устраняя лейкоциты. Но самое главное, этап выбора CD146 + позволяет устранить фибробластов, так как эти клетки не экспрессируют CD146. Экспрессия молекул клеточной адгезии CD146 положительно коррелирует с мультипотентность, и поэтому является хорошим маркером, чтобы отсеять фибробласты из популяции мезенхимальных клеток 15-19. Это является преимуществом по сравнению с использованием CD90 качестве селективного маркера, как это выражается не только в МСК, но также и в lipofibroblasts 5,20. В этом протоколе мы явно выбраны магнитное выбор шарик, как это мягче на клетках, и вся процедура может быть сделано в стерильных условиях. Другим важным преимуществом этого способа выделения, в отличие от метода выроста, является то, что сравнительно быстро, 6-10 дней, в отличие от месяца или более для метода вырост. От трех до пяти дней после первоначальной изоляции популяция мезенхимальных готов к CD146 + Селе ие; еще через три-пять дней CD146 + клетки готовы для использования в экспериментах или могут быть заморожены для дальнейшего использования. Уменьшилось время культуры улучшает качество клеток, как МСК трансдифференцироваться направлении фибробластов в длительной экс естественных культуры 19. Наконец, из-за природы протокола, можно применить этот метод к другим видам просто выбрав соответствующие антитела, или даже другие системы органов, регулируя выбор пищеварения ферментов и времени инкубации.

Подробный протокол такого способа выделения приводится ниже, и схематическое представление выделения и последующего отбора CD146 + субпопуляции обеспечивается на фиг.1А и 1В соответственно. Кроме того, данные включены для пассирования, замораживания и оттаивания эти клетки.

Объявление / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема обзор изоляции легочных клеток мезенхимальных (А) и последующей CD146 + клеточной селекции (B) = мин минут. ЭДТА = этилендиаминтетрауксусная кислота; 2-й Ab = вторичное антитело; альфа-CD146 AB = первичное антитело анти-CD146; ве клетки = CD146 негативные клетки; положительной клетки = CD146-положительные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены Animal Care комитета Университета Оттавы (протокол животное этика Ohří-1696) по. Уход за животными проводили в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

1. Выделение легких мезенхимальных стромальных клеток

  1. Подготовьте смеси ферментов в 50 мл трубки: весят 30 ед нейтральной протеазы, 2500 U коллагеназы я и 500 U ДНКазы I. Эти суммы достаточно для легких взрослой мыши или крысы щенка. Подготовьте на день изоляции и хранить при температуре 4 ° С до использования.
  2. щенки жертва крыс при 13 день по внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитала натрия (0,2 мл, 65 мг / мл). Используйте носок щепотку рефлекс установить бессознательное. Смерть животного обеспечивается вскрытия грудной клетки, как описано ниже.
  3. Санируйте кожу путем распыления животное с 70% -ным этанолом и осторожно открыть грудную клетку с помощью хирургических ножниц, начиная с диафрагмой и резки в направлении ростральной части, при этом внимательно следили, неповредить легкие. Распространение грудную клетку открытой использованием кровоостанавливающие зажимы, или в качестве альтернативы срезать грудную клетку, чтобы обеспечить доступ к грудной клетке.
  4. Обескровить животное путем удаления сердца. Чтобы удалить сердце, понять тимус и сердце с небольшими щипцами и вырезать эти прочь с хирургическими ножницами. Сразу же после этого, поглощают кровь марлей, пока не более кровь не выходит из отрезанной аорты и легочной артерии.
  5. Удалить легкие от грудной клетки следующим образом: провести трахеи с маленькими щипцами, а затем разорвать трахею с хирургическими ножницами на ростральной стороны. В то время как осторожно потянув за пакет легких из грудной клетки, отрезать любую соединительную ткань на спинной стороне вдоль грудной клетки, чтобы освободить легкие.
  6. Север легкие от аорты и пищевода разрезанием вдоль диафрагмы с хирургическими ножницами. Теперь, когда легкие полностью свободны от грудной клетки удалите оставшуюся кровь аккуратно марлей.
  7. Удалить трахеи и бронхов с сюрческие ножницы и осторожно переносить долей легких до 50 мл пробирку, содержащую холодный 35 мл 30% цитрат-фосфатном-Декстроза аденина (CPDA-1) антикоагулянт (26,30 г дигидрата тринатрийцитрата, моногидрат 3,27 г аскорбиновой кислоты, 2,22 г мононатрия дигидрофосфат, 31,80 г D-глюкозы, 0,275 г аденина в 1 л очищали H 2 O; стерильный фильтр раствор через фильтр с мембранной 0,22 мкм перед использованием) в фосфатно-солевом буфере (PBS), чтобы удалить кровь и мусора.
  8. После 5 мин полоскания в 30% CPDA-1 / PBS, передавать легкое к новому 50 мл пробирку, содержащую 35 мл стерильной фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (RT), инвертировать осторожно, чтобы удалить цитрат. Передача в пробирку, содержащую 35 мл Дульбекко PBS + Натрий-пируват + Глюкоза (DPBS ++) (RT). Каждый шаг промывки следует принимать примерно 5 мин.
    Примечание: DPBS ++ можно заказать на коммерческой основе или составляется следующим образом 21: кальция дигидрата хлорида 132,4 мг, магния гексагидрат хлорида 100 мг, хлорид калия (безводного) 200 мг, фосфат калия одноосновной (безводный) 200 мг, хлорид натрия (безводный) 8000 мг, натрия фосфат двухосновный (безводный) 1,144.5 мг, D-глюкоза 1000 мг, пирувата натрия 36 мг в 1 л очищенной H 2 O, рН 7,3. Стерильный фильтр раствор через фильтр с мембранной 0,22 мкм перед его использованием.
  9. Растворить смеси ферментов, добавив 10 мл DPBS ++ (предварительно нагревают до 37 ° С) и инвертирующий осторожно до растворения.
  10. Передача легкие к новому 50 мл пробирку и нарезать легкое на стенке трубки скальпелем до мелко измельчить. Добавьте смеси ферментов в ткани (10 мл смеси ферментов / за взрослой мыши / крысы щенка легких), закрыть трубку плотно и инкубировать при 38 ° С при осторожном перемешивании (либо в тепловом смесителе, водяной бане встряхивания или воды ванна с регулярной ручной агитации). Продолжительность зависит от типа ткани: фетальной ткани 60 мин, ювенильный / взрослого ткани 90-120 мин, фиброзное взрослых тканей 120-150 мин.
  11. Остановить пищеварение хелатирования двухвалентных катионов WIth 200 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 0,15 М, рН 7,4. Стерильный фильтр раствор с применением мембранной 0,22 мкм фильтр перед использованием).
  12. Добавить 20 мл 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) / PBS и передать всю подвеску через мкм клеточный фильтр 100 в новый 50 мл пробирку. Промыть трубки и клеточный фильтр с 10 мл 5% FBS / PBS, в результате чего общий объем до 40 мл.
  13. Центрифуга в течение 5 мин при 500 мкг в РТ.
  14. Удалить супернатант (осадок должен быть отчетливо виден), ресуспендируют в 40 мл 5% FBS / PBS и повторить шаг центрифугирования 1,13.
  15. Ресуспендируют в 4 мл 5% FBS / PBS (RT) и слой тщательно над 3 мл градиента плотности носителей (1,073 г / см 3) в 15 мл пробирку 14. Чтобы получить хороший интерфазу, важно, что наслоение суспензии отдельных клеток происходит под углом °> 45 при очень низкой скорости.
  16. Центрифуга 20 мин при 900 мкг, средние (5/10) ускорение, нет замедления, 19 ° C.
  17. Сбор клетки, присутствующие в иноммежфазных и ресуспендируют их в 10 мл стерильной PBS.
  18. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г, 21 ° С.
  19. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл подогретого завершена L-MSC культуральную среду (минимальная поддерживающая медиа Eagle, альфа модификации (αMEM), с добавлением 2 мМ L-глутамина на 500 мл αMEM, 20% об / об FBS и 1% об / об пенициллин / стрептомицин / Амфотерицин Б.
  20. Повторите шаг центрифугирования 1,18. Затем снимите с супернатант и ресуспендируют в 10 мл подогретого свежей культуральной средой.
  21. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток и пластину с высокой плотностью, так как большинство клеток на этой стадии не являются пластиковые прилипший. Точная плотность покрытия зависит от вида животного и возраста, например, в клетки легких взрослой мыши высевают 10 5 клеток / см 2, в то время как клетки из крысят легких достаточно плотным при плотности посева 1-2 х 10 4 клеток / см 2 / см 2.
  22. Культура L-МСК в увлажненной 5% O 2, 5% СО 2 атмосферы при температуре 37 ° С.
  23. Изменение среднего 24 ч после начального посева, а впоследствии каждые 3 дня после промывки один раз PBS. Клетки должны быть выращены до 80-90% слияния, который занимает 3-5 дней в среднем в зависимости от животного происхождения. Высшее слияние будет способствовать дифференциации в фибробласты.

2. Выбор CD146 + легких мезенхимальных стромальных клеток

  1. Покрытие магнитных шариков с вторичным антителом
    1. Coat магнитных шариков с биотинилированным вторичным антителом, в соотношении 10 мкг вторичного антитела / 100 мкл магнитных шариков в круглым дном стерильные 2 мл криопробирку в стерильных условиях. Используйте 10 мкл вторичного антитела за ожидаемых 0,5 х 10 6 клеток, а также использовать как минимум 100 мкл магнитных шариков и 10 мкг антитела.
      Примечание: отношениеtibodies используемые на объем шариков может отличаться у разных производителей, обратитесь за инструкциями изготовителя для бортов выбора. Для этого протокола, обратитесь к таблице 1 для шариков и антител, которые были использованы в оптимизации этого протокола.
    2. Инкубируйте во вращающемся смесителе образца в течение 30 мин при 30 об / мин (оборотов в минуту), при комнатной температуре.
    3. Ресуспендируют бусины в 1,5 мл стерильного 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) / PBS и перенос до 3 мл с круглым дном трубки (трубки проточной цитометрии). Промойте криопробирку дополнительный 1,5 мл 0,1% BSA / PBS и трансфер в 3 мл трубки.
    4. Поместите пробирку на соответствующем магнита и ждать 2 мин, пока все шарики не будут прикреплены к задней стенке трубки и раствор остается прозрачным. Удалить сток и повторить процедуру с 3 мл 0,1% BSA / PBS в два раза.
    5. Ресуспендируют бисером в 3 мл 0,1% BSA / PBS и хранить при температуре 4 ° С, в защищенном от света месте. Использовать в течение 5 дней.
  2. Маркировка CD146 + L-МСК
    1. Урожай мезенхимных клеток после промывки PBS с использованием нежный без раствора трипсина.
      Примечание: Объемы зависеть от размера культуральной колбе (0,2 мл / см 2 среднего или PBS).
      1. Удалить культуральной среды и промыть клеткам трижды стерильной PBS.
      2. Добавить соответствующий объем нежным без раствора трипсина (см Таблицу 1). Инкубировать при 37 ° С в инкубаторе до тех пор, пока клетки не были отключены, примерно 10 мин при использовании раствора в таблице 1.
      3. Инактивировать фермент добавлением L-MSC культуральной среды и центрифугирования в течение 5 мин при 500 х г в.
    2. Удалить супернатант, ресуспендирования клеток в 0,1% BSA / PBS и считать клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
      Примечание: Объем 0,1% BSA / PBS, зависит от размера культуральной колбе: стремиться к 5 или 10 мл 0,1% BSA / PBS.
    3. Повторите шаг 2.2.2 и ресуспендируют выделенный количество клеток в 3 мл 0,1% BSA / PBS (блоков ипконкретные сайты связывания и держит клетки живым). Хранить клетки на льду.
    4. Подготовьте 3 мл с круглым дном трубки с первичным антителом анти-CD146, и держать на льду.
      Примечание: Концентрация первичного антитела, которые добавляют к выделенному количеству клеток зависит от антител, который используется. Для предложенной CD146 антитела анти-крысиного таблица 1.
    5. Добавить общий объем клеток с шага 2.2.3 к трубке с первичным антителом. Закрыть плотно и инкубировать 30 мин на вращающемся смесителе образца при 15 оборотах в минуту, 4 ° С.
    6. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 500 х г, 4 ° С, Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл 0,1% BSA / PBS. Повторите шаг центрифуги.
    7. Ресуспендируют клеток в 3 мл раствора, содержащего вторичные шарики, покрытые антителом, что получали в соответствии с инструкциями в разделе 2.1 и инкубировать 30 мин на вращающемся смесителе образца при 15 оборотах в минуту, 4 ° С.
  3. Выбор CD146 + L-МСК
    1. Поместите пробирку, содержащую меченый CD146 + L-МСК на магните. Положительные клетки будет обращено к задней части трубы. Не перемещая трубку или прикосновения бисером, урожай супернатант с негативными клетками медленно со стерильным пипетки Пастера (это может быть либо собраны или отбрасываются на основе опытно-конструкторских).
    2. Извлеките трубку от магнита и клетки вновь суспендируют в 3 мл 10% BSA / PBS. Повторите процедуру выбора, описанные в шаге 2.3.1. еще четыре раза (шаги отбора Σ 5).
    3. Ресуспендируют CD146 + L-МСК в подогретого культуральной среде L-MSC и вернуться к магниту.
    4. Удалить супернатант, ресуспендируют в культуральной среде и пластины L-MSC в соответствующего размера культуры колбу (0,2 мл / см 2). Как правило, плиты клетки в тех же размерах культуры колбу, из которой клетки были сняты до борта отбора. Количество CD146 + L-МСК, и, следовательно, плотность покрытия, будетзависит от возраста, вида и штамма исходного животного. Всегда стремиться к плотности обшивки ~ 5000 клеток / см 2.
      Примечание: Шарики не будет мешать росту клеток и постепенно исчезнет, ​​как клетки размножаются.

3. морозильных ячеек

  1. Используйте следующую замерзания СМИ: 60% -ный раствор пентакрахмалов (10% пентакрахмалов в 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% диметилсульфоксид (ДМСО) 22.
    Примечание: Если не все ингредиенты доступны, раствор, содержащий 5% ДМСО, 30% FBS и 65% αMEM является хорошей альтернативой.
  2. Ресуспендируют клеток в 0,5 × 10 6 клеток / мл, аликвотных в криопробирок 1 мл каждого и заморозить O / N при температуре -80 ° С с использованием контейнера замерзания.
  3. Переезд в жидком резервуаре азота на следующий день.

4. Размораживание Клетки

  1. Оттепель флакон клеток в водяной бане C 37 ° в течение 5 мин.
  2. Ресуспендируют клеток в 10 млподогретого культуральной среды и центрифугирования в течение 5 мин при 500 х г, 21 ° С.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде 10 мл. Семенной клеток в вентилируемой культуры колпачка клеток обрабатывают колбах при 5000 клеток / см 2 в 0,2 мл / см2 СМИ (например, 15 мл для 75 см 2 колбу).
  4. Культуры клеток в 5% O 2, 5% СО 2 до 80-90% сливной для уборки и / или экспериментального использования. Чрезмерная конфлуэнтности будет индуцировать дифференцировку. При посеве на 5000 клеток / см 2, L-МСК достигнет 80-90% слияния в течение 3-4 дней культивирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Два из наиболее надежных физических характеристик МСК, плотности и пластиковой присоединения, используются в первой части этого протокола для получения мезенхимальных клеточной фракции легкого, который содержит L-МСК. Хотя градиент плотности межфазного войдут моноциты и макрофаги в дополнение к мезенхимальных клетках легких, пластик следование последующим 3-5 дней культивирования гарантирует, что только мезенхимальные клетки легких остаются. Действительно, это клеточной популяции выражает классические маркеры MSC поверхности CD73, CD90 и CD146 и отрицательна для маркеров CD34, CD45, главный комплекс гистосовместимости второго типа (MHCII) -RT1B, CD11b и CD79a, не указывая, что больше нет никаких лейкоциты присутствуют в клеточная популяция (2А). Интересно, что из CD146 + подмножества, диапазон 44.4-65.7% также CD73 + и CD90 + (данные не показаны). Кроме того, эта популяция клеток способна кколониеобразующих единица (КОЕ) Эффективность, что на ~ 30% намного выше, чем в целом сообщалось МСК костного мозга или даже других типов MSC (Фигура 2В), и дифференцирует вдоль трех классических MSC родах (фиг.2с).

фигура 2
Рисунок 2. MSC характеристики после ферментативного расщепления, разделения в градиенте плотности и пластической присоединения. (А) Экспрессия MSC-связанных поверхностных маркеров CD146, CD73 и CD90 присутствует в части населения пластик приверженцем клетки, в то время как негативные маркеров лейкоцитов CD11b, CD79a , были практически не выражены CD34, CD45 и MHCII-RT1B. (Б) колониеобразующих единиц анализа путем ограничения разбавления анализ (5 клеток / см 2) показали, что ~ 30% пластиковых адгезивных клеток имели клонального потенциала, указывающего МСК. (C) Пластиковый приверженцем CEзаполняет были способны остеогенной производства матрицы (красного цвета), содержит большее количество мелких липидных везикул (красный), когда индуцированных адипогенной дифференциации среды по сравнению с не-дифференцированных управления и образованных хондрогенный как сферы, содержащих хондроцитов (красный). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Все данные были получены с клетками проход 1-3. NM = минус маркеры; КОЕ = колониеобразующих единиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Тем не менее, главный нюанс в том, что эта популяция вероятно содержит оба L-МСК и различных подтипов легочных фибробластов, Л-МСК дифференцированы потомство 23. Так мультипотентность положительно коррелирует с экспрессией CD146, и фибробласты не должно быть никакой экспрессии этого маркера, позитивной селекции из CD146 + субпопуляционного Ostensibly привело к клеточной популяции, которая высоко обогащенного L-МСК. Это наглядно демонстрируется более высокий процент популяции клеток выражая MSC связаны поверхностные маркеры (рис 3а), значительно выше колониеобразующих потенциал ~ 80% (3В) и более сильную реакцию дифференциация в частности хондрогенной линии (3С) по сравнению с общим мезенхимальной населения, которая получается перед выбором CD146. Следует отметить, что эти L-МСК форма только очень немногие истинные адипоциты, но показать гораздо больше в форме веретена клетки, которые наполнены маленькими липидных везикул. Они могут отражать lipofibroblast происхождение, что имеет решающее значение как для развития легких и альвеолярного поддержки клеток типа II. После выбора CD146, более адипоцитов подобных клеток, наполненных крупных липидных везикул можно наблюдать (фиг.3С) по сравнению с ранее отбора CD146, пока большинство клеток по-прежнему являются lipofibroblasts-подобный сезаполняет содержащие небольшие липидные пузырьки.

Рисунок 3
Рисунок 3. MSC характеристики после дополнительного CD146 + магнитного отбора борта. После положительного отбора CD146 + субпопуляции, эти клетки показали более высокую экспрессию MSC-связанных поверхностных маркеров, CD73 в частности (а), значительно более высокую эффективность КОЕ после единственной клетки металлизированный (B), и более сильную реакцию дифференциация по особо хондрогенной линии и, в меньшей степени в адипогенной линии (с). Данные представлены в виде среднего ± SEM. Все данные были получены с проходными 3 клеток. NM = минус маркеры; КОЕ = колониеобразующих единиц. Пожалуйста, нажмите здесь тО просмотра увеличенной версии этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выделение и культура первичной L-МСК дает возможность лучше понять их функции и их взаимодействие с другими клеточных популяций на клеточном уровне, и их роль в развитии легких, здоровья и болезни. Это особенно важно, поскольку отсутствие конкретного одного маркера этих клеток делает практически невозможным, чтобы изучить эти клетки на месте. Как и во всех популяциях первичных клеточных, следует иметь в виду, что эти клетки имеют больше шансов изменить свой ​​характер, чем дольше они хранятся в культуре 19 (обзор 24). Чтобы сохранить L-МСК в состоянии, которое как можно ближе к их естественном состоянии, очень важно, что они культивируют в 5% O 2, 5% СО 2, в увлажненном инкубаторе при 37 ° C. В физиологии дыхания общепризнано, что на основе закон парциальных давлений, парциальное давление кислорода в окружающем воздухе (21% O 2) составляет 160 мм рт.ст., и падает до ~ 101 мм рт.ст. альвеолярного воздушного пространства 25-27. В зрелом легких альвеолярный-артериальной РаО2 градиент ~ 3-4 мм рт.ст., но это может быть значительно увеличилась в больном или незрелых легких, где альвеолярно-артериальный расстояние увеличивается 25,28. Внутри тела, мезенхимальных ниша обычно подвергается концентрации кислорода 2-8% 29,30. Лишь немногие документы фактически измерили PO 2 в легких, но в одном исследовании измеряется это в легких 20 пациентов, находя широкий выбор в нормальных легких PO 2 от 23 до 656 мм рт.ст., при этом средний 42,8 мм рт.ст. 27,31. В соответствии с законом Дальтона, увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% O 2 имеет PO 2 в ~ 36 мм рт.ст., который попадает совершенно в пределах измеряемой в нормальной ткани легкого и очень близко к медиане. Кроме того, условия культивирования с низким содержанием кислорода способствуют сохранению популяций предшественников в культуре 29. Взятые вместе, это яТрудно точно сказать, что концентрация кислорода L-МСК подвергаются на месте на разных стадиях при нормальном постнатальном развитии или заболевания, но похоже, что 5-10% O 2, скорее всего, наиболее точным с физиологической точки зрения 27,31. На основании информации, приведенной выше, мы выбрали для поддержания 5% O 2 в наших условиях культивирования, и мы обнаружили, что, когда эти условия поддерживают в пробирке, то Л-МСК будет расти быстрее, отображать меньше стрессовых волокон и имеют меньшую вероятность из спонтанной дифференцировки или старения. Дополнительные факторы, которые будут препятствовать спонтанной дифференцировке или другие отклонения является использование нежный без трипсина диссоциации средство для пассирования, пересева L-МСК, когда они достигают 80-90% слияния (плотные условия будут способствовать дифференциации фибробластов), и чтобы количество проходов с низким (<Р4). В исследовании, проведенном Гофмана и его коллеги, трипсин было показано оказывать неблагоприятное воздействие на функцию L-МСК ифенотип, в то время как трипсина свободной диссоциации агентов может сохранить этот 13.

Чтобы оптимизировать выход в процессе изоляции, важно фарш легкие, как тонко, как это возможно, имея в виду, что ткань не должна дать высохнуть. В ходе ферментативного расщепления, важно, что трубки перемешивают часто, если не с помощью устройства с подогревом встряхивания, как кусочки ткани будут оседать и не получит оптимальное воздействие ферментов. Другим важным шагом является градиент разделение плотность: если расслоение не делается очень медленно или под углом <45 °, то это приведет к перемешиванию двух жидкостей вместо наслаивать, вызывая потерю всей клеточной популяции. Более того, плотность в градиенте плотности среды очень сильно зависит от температуры окружающей среды. Любой другой температуре, чем 19 ° C (или RT), приведет к неоптимальной или вообще без градиенте плотности разделения.

Представляет интерес для Future пользователи этого протокола является то, что мы успешно изолированы жизнеспособной L-МСК из легких, которые были собраны до 24 ч перед выделением, при условии, что легкие непосредственно хранится в холодном СМИ L-MSC после сбора урожая, и выдерживают при 4 ° С. Это позволяет более гибко планирования эксперимента, или даже доставки легких между различными лабораториями. Выход составляет обычно аналогична свежесобранных легких, и клетки растут одинаково хорошо.

Другая модификация, которая будет возможно, заключается в использовании FACS вместо магнитной селекции борта, хотя этот способ подвергает клетки большей нагрузке, как эта процедура занимает больше времени и, как клетки подвергаются воздействию высоких давлений и скоростей, и таит в себе риск загрязнения если не сделано в стерильных условиях. Магнитные шарики, используемые здесь не мешают росту клеток, и исчезают в течение нескольких дней культивирования. Предпочтение FACS или магнитного сортировки борта может также зависеть от имеющихся возможностейконечному пользователю. Кроме того, можно было бы модифицировать этот протокол, чтобы изолировать резидентные МСК из других тканей. В этом случае было бы важно, чтобы адаптировать ферменты в интересующего органа, а состав матрицы изменяется между органами.

Важным ограничением только с использованием градиента плотности и последующее пластиковую присоединению получения мезенхимных клеток, является то, что в результате популяция содержит обе L-МСК и фибробластов. Выбор для CD146 + клеток сильно средства этой оговорки, но, несмотря на CD146 + процедуры отбора и осторожных условиях культивирования, характер L-МСК и последствия экстракорпорального клеточной культуре делают невозможным, чтобы избежать какой-то степени дифференциации в фибробласты. МСК в целом, как сообщается, содержат иерархию мультипотентность, в котором клетки далее вниз иерархия медленно теряют мультилинейной потенциал пока они не станут смертельно дифференцированные фибробласты <SUP> 23. По всей вероятности это также происходит в нише L-MSC 4, и, кажется, должны быть отражены в культурной CD146 + населения как уже один проход после отбора CD146 + примерно 40% клеток потеряли выражение CD146. Кроме того, в этой группе населения есть только 80% CD73 и 40% выражение CD90. Отчасти это можно объяснить иерархии MSC из мультипотентность. Можно было бы, что CD146 + пройти асимметричный пролиферацию, приводя к обеим CD146 позитивных МСК и отрицательных, более дифференцированных, дочерними клетками. Резиденты МСК легкого также может быть разумно ожидать, чтобы иметь несколько иной фенотип и функцию из МСК костного мозга, на котором основывается определение CD73 и CD90 экспрессии. Международное общество клеточной терапии признал, что не все МСК выразить классические маркеры MSC, в том числе CD73 и CD90, и что выражение поверхностный маркер не самый лучший способ определить МСК 32. электроннойxceptionally высокой КОЕ эффективность ~ 70% населения CD146 + L-MSC поддерживает эту идею. Поскольку CD146 + население работает лучше по отношению к характеристикам MSC чем неотсортированной мезенхимальных населения, авторы не далее охарактеризовал CD146 - население. Мы стремились, чтобы обогатить нашу мезенхимальных население МСК и истощать их фибробластов, но мы не утверждаем, что это единственно верный население L-MSC. L-МСК, вероятно очень неоднородна, как по происхождению, фенотипа и функции.

Хотя CD146 широко признан в качестве маркера мультипотентность в МСК и перицитами 16,17,33,34, очень мало известно о населении CD146 + MSC в естественных условиях. CD146 представляет собой молекулу клеточной адгезии, что является важным для ангиогенеза и функции эндотелиальных клеток, и выражается в эндотелиальных клетках, гладких мышечных клеток, перицитов, МСК и Т-лимфоцитов 15,16,35,36. В последние годыДоказательств, выяснилось, что МСК населяют периваскулярное нишу во многих органах, а CD146 + клеток совместно пятно на MSC-маркеров CD73 и CD105 37. Действительно, культивируемые перицитов и МСК имеют очень похожие профиль экспрессии генов 38, укрепление мнение, что МСК получены из перицитами 4,39. Хотя мы не проводили иммуногистохимическое анализ, чтобы определить местоположение нашего населения CD146 + L-MSC, то весьма вероятно, что они также будут расположены в периваскулярной месте. Будущие исследования будут необходимы, чтобы проверить, если это действительно так. Вполне возможно, что это подмножество нашей клеточной популяции являются перицитов, хотя следует отметить, что все клетки выглядят фенотипически очень похожи после отбора CD146 +.

Мезенхимальных стромальных клеток как известно, трудно определить из-за отсутствия единого всеохватывающего маркера. Различные исследования сообщают различные методы для выделенияиз L-МСК, и убедительно показали, что эти клеточные популяции, похожи друг на друга по отношению к экспрессии маркеров MSC. Основываясь на характеристике CD146 + L-MSC, как представлено здесь, то CD146 + L-MSC население очень похож на ранее сообщалось популяций L-MSC, как достигнутые выроста или различными формами FACS с использованием стволовых клеток, связанные поверхностные маркеры, такие как Sca -1, ABCG2 и CD90. По сравнению с вырост L-МСК 13, CD146 + L-МСК-видимому, имеют большую способность порождать колоний из одиночных клеток, указывая, что наш метод дает более обогащенного население мультипотентны L-MSC. Это преимущество также верно, когда по сравнению со способами, которые изолируют L-МСК на основе CD90 7 или тромбоцитарный фактор роста рецептора альфа (PDGFRα) 40,41, так как обе поверхностные маркеры также выбрать для более терминально дифференцированных lipofibroblasts и альвеолярных / структурных фибробластов и может поэтому только разумно бе идентифицированы как стромальных клеток 20,42. В противоположность этому, как SCA-1 и ABCG2 хорошо документированы маркеры, которые коррелируют с стволовости и MSC выражения 9,43-46. ABCG2 + L-МСК, однако, имеют более эндотелия природу, поскольку они являются 99% положительный результат на CD31 46, тогда как метод сообщили здесь выбирает против эндотелиальных клеток через градиент Ficoll и пластической присоединения. Основным преимуществом нашего метода по сравнению с SCA-1 на основе протокола изоляции McQualter и коллегами 5,8 является то, что оно широко применимо к другим, чем у мышей видов, в которых не могут быть использованы Sca-1.

Хотя это очень сложно, вероятно, близко от невозможно, чтобы получить "чистый" население L-МСК из конца разработке или взрослого легкого и поддерживать его в недифференцированном состоянии, протокол, представленные здесь обеспечивает быстрый, последовательный и надежный метод получения клеточной популяции сильно обогащены мультипотентными самообновляющихся разрешении легкихIDENT МСК. Используя этот метод позволит более определенный изучение роли L-МСК в самых разнообразных моделей заболеваний и их роли в развивающемся легком.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Биологии стволовых клеток выпуск 108 мезенхимальных стромальных клеток тканей житель стволовых / прогениторных клеток легких крыса регенеративная медицина выбор магнитного шарика
Выделение CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident легких мезенхимальных стромальных клеток крысы легких
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter