Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CD146 İzolasyonu Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

Abstract

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. Ayrıca, büyük olasılıkla normal organ gelişiminde rol var ve hastalık rolleri, bir fibrotik doğa ile özellikle atfedilmiştir. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Burada anlatılan izolasyon tekniği akciğer ikamet MSC (L-MKH) birden özelliklerini uygular. sıçanların kurban üzerine, akciğerler çıkarıldı ve kan kaldırmak için birden çok kez durulanır. neşter mekanik ayrışma ardından, akciğerler kollajenaz tip I, nötr proteaz ve DNaz tip I obtaine bir karışımını kullanarak 2-3 saat sindirilirD tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yıkandı ve yoğunluk gradyan ortamı (yoğunluk 1.073 g / ml) üzerine yayıldı. Santrifüj işleminden sonra, interfaz gelen hücreler yıkanır ve kültürü ile işlenmiş balonlarına kaplanmıştır. Hücreler, fizyolojik,% 5 O2 4-7 gün% 5 CO2 şartları için kültürlenir. Fibroblastlar (CD146 -) tüketmek ve CD146 + hücreleri yalnızca L-MSC'ler (CD146 +), pozitif seçim popülasyonu sağlamak için manyetik boncuk seçim yoluyla gerçekleştirilir. Özet olarak, bu prosedür, güvenli başka in vitro çalışma ve işleme için primer L-MSC nüfusu üretir. Çünkü protokol doğası, kolayca diğer deneysel hayvan modellerinde tercüme edilebilir.

Introduction

Mezenkimal stromal hücreler (MKH) giderek akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere, hastalıkların geniş bir yelpazede terapötik potansiyeli için tanınır. kemik iliği ve eksojen hücre tedavisinde göbek kordonu MKH kullanımı yanında, aynı zamanda yerleşik doku MKH tamir ilgi ve rejeneratif potansiyeli artmaktadır. gelişimi sırasında, akciğer olmak üzere, mezenşimin gelişimsel ipuçları önemli bir kaynak olduğunu ve yerleşik MKH bu merkezinde olması olası bir aday vardır. Ayrıca, kanıtlar ikamet MKH kanser 1,2 ve fibrozis 3 de dahil olmak üzere, yetişkin hastalıkları altüst ortaya çıkmaktadır. Bu yerleşik doku MKH çalışmanın ana engel bu hücrelerin 4 izolasyonu ve tanımlanması için net bir belirteç olmaması. Kök hücre antijenini-1 (Sca-1) doku kök hücrelerin bir çeşitliliği için bir markör olarak farelerde tespit edilmiştir, ve L-MSC 5 izole edilmesi için de kullanılabilir, ancak ne yazık varBaşka bir tür 6 ortologlarını da bilinir. Araştırmacılar akciğer dokusu ya da sıvı ya da L-MSC izolasyonu için farklı yalıtım çeşitli yöntemler bildirilmiştir. / CD45 - / - CD90 + hücreleri 7, CD31 - / CD45 - / epitelyal hücre yapışma molekülü (EpCAM) - Bu, CD31 seçilmesi (FACS) göre yöntem flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması değişir / Sca-1 + hücreleri 8, çok ilaca dirençli taşıyıcı kıyılmış dokusu 13 takım plastik bağlılık 11,12 ve göç ATP bağlayıcı kaset G (ABCG2) pozitif hücreler 9 veya Hoechst 33.342 boya efflux 10.

Burada sunulan yöntemin avantajı pek çok kat bulunmaktadır. Yumuşak enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanı 14 kullanılarak, tek bir MKH'lerin arasında, ancak epitelial veya endotelial hücreleri hariç yoğunluğu aralığının tüm hücreleri elde edilir. sonraki plastik bağlılık adım sadece mesench sağlarymal hücreleri lökosit ortadan kaldırarak, yapışır ve kültür kalmak. Bu hücreler CD146 ifade yok gibi en önemlisi, ancak CD146 + seçim aşaması, fibroblast ortadan kaldırılması için izin verir. Hücre yapışma molekülü CD146 ekspresyonu pozitif multipotency ile ilişkilidir ve bir mezenkimal hücre popülasyonu 15-19 den fibroblastlar ayıklamak için iyi bir belirteç etmektir. Sadece MSC değil, aynı zamanda lipofibroblasts 5,20 ifade edilmediği gibi bu, bir seçme markeri olarak CD90 ile bir avantajdır. o hücreler üzerinde nazik olduğu gibi bu protokolde açıkça, bir manyetik boncuk seçimi seçmiş ve tüm prosedür steril şartlarda yapılabilir. sonucudur yönteme karşı, bu izolasyon yönteminin bir başka önemli avantajı, sonucudur yöntemi için bir ay ya da daha fazla karşı bu 6-10 gün, nispeten hızlı olmasıdır. Üç beş gün ilk izolasyondan sonra mezenkimal nüfus CD146 + sele hazır ction; Başka bir üç ila beş gün sonra CD146 + hücreleri deneyler için kullanılmaya hazır ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. MKH uzun ex vivo kültür 19 fibroblastlar doğru transdifferentiate olarak kültür azalmış zaman hücrelerinin kalitesini artırır. Son olarak, çünkü protokol doğası, sindirim enzimleri ve inkübasyon süresi seçilerek ayarlanması ile diğer organ sistemleri sadece uygun antikorlar seçerek veya hatta diğer türler için bu yöntemi uygulamak mümkündür.

Bu izolasyon yönteminin ayrıntılı bir protokol aşağıda verilmiştir ve izolasyon ve CD146 + alt populasyonun sonraki seçimi genel şematik bir görünümüdür, sırasıyla Şekil 1 A ve 1 B 'de verilmektedir. Ayrıca, ayrıntıları bu hücrelerin dondurulması ve çözülmesi, geçiş için dahil edilmiştir.

reklam / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
. Pulmoner mezenkimal hücreler (A) ve daha sonraki CD146 + hücre seçimi (B) min = dakika izolasyonu Şekil 1. Şematik genel bakış; EDTA = Etilendiamintetraasetik asit; 2. Ab = ikincil antikor; a-CD146 antikor = birincil anti-CD146 antikor; -ve hücreleri = CD146 negatif hücrelerin; + hücreler = CD146 pozitif hücreler ettik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm işlemler Ottawa Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (hayvan etik protokol Ohri-1696) tarafından onaylanmıştır. Hayvan bakımı, kurumsal prensiplere uygun olarak gerçekleştirildi.

Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 1. İzolasyon

  1. 50 ml tüp enzim karışımı hazırlayın: 30 U Nötr Proteaz tartmak, 2500 U kollajenaz I ve 500 U DNAz I. Bu miktarlar yetişkin bir fare veya sıçan yavru akciğerler için yeterli. kullanılana kadar 4 ° C 'de izolasyon ve mağaza gününde hazırlayın.
  2. pentobarbital sodyum, intra-peritonal enjeksiyon ile günde 13 Kurban yavrular (0.2 mi, 65 mg / ml). bilinç oluşturmak için ayak tutam refleks kullanın. Aşağıda tarif edilen hayvanın ölümü, göğüs açılarak sağlanır.
  3. çok dikkatli olmama,% 70 etanol ile hayvan püskürtülerek cildin dezenfekte ve dikkatle diyafram başlayan ve rostral tarafa doğru kesim, cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi açmakakciğerlere zarar. Toraks erişim sağlamak için göğüs kafesi kesip alternatif hemostatik kelepçeler kullanarak açık göğüs kafesi yayıldı, ya da.
  4. kalbi kaldırarak hayvan asıl bulbus olfaktoryusları alındı. kalbi kaldırmak için, küçük forseps ile timus ve kalp kavramak ve cerrahi makas ile bu kesip. artık kan kopmuş aort ve pulmoner arter çıkana kadar hemen ardından, bir gazlı bez ile kan emer.
  5. aşağıdaki gibi toraks akciğerlere kaldırın: küçük forseps ile trakea tutun, daha sonra rostral tarafında cerrahi makas ile trakea sever. yavaşça toraks dışına akciğer paketini çekerken, akciğerler serbest göğüs kafesi boyunca sırt tarafında herhangi bir bağ dokusu kesip.
  6. cerrahi makas ile diyafram boyunca keserek aorta ve yemek borusu akciğerlere Sever. Şimdi akciğerler tamamen toraks arınmış bir gazlı bez ile hafifçe kalan kan kaldırın.
  7. sur ile trakea ve bronşlar kaldırjik makas ve dikkatli bir şekilde soğuk 35 mi% 30 sitrat-fosfat-Dekstroz Adenin (CPDA-1) pıhtı önleyici ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp akciğer lobları transferi (26.30 g trisodyum sitrat dihidrat, 3.27 g askorbik asit monohidrat, 2.22 g monosodyum dihidrojen fosfat, 31.80 g D-glikoz, 1 L 0.275 g adenin H2O arıtıldı; steril filtre kan ve ortadan kaldırmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kullanımdan önce 0.22 um membran filtre) kullanılarak çözelti.
  8. % 30 CPDA-1 / PBS içinde 5 dakika çalkalandıktan sonra, 35 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) (RT) içeren yeni bir 50 ml'lik tüpe akciğer transfer sitrat çıkarmak için hafifçe ters. içeren bir tüpe aktarın 35 mi Dulbecco PBS + Sodyum pirüvat + Glukoz (DPBS ++) (RT). Her durulama adımı yaklaşık 5 dakika sürer.
    Not: Kalsiyum klorür dihidrat 132.4 mg, magnezyum klorür heksahidrat 100 mg, potasyum klorür (susuz), 200 m: DPBS ++ ticari sipariş veya kadar yapılabilir 21 şug potasyum fosfat monobazik (susuz) 200 mg sodyum klorür (susuz) 8000 mg sodyum fosfat dibazik (susuz) 1,144.5 mg, D-glikoz, 1000 mg sodyum piruvat ve 36 mg 1 L arı H2O, pH 7.3. Steril filtre kullanmadan önce, bir 0.22 mikron membran filtresi kullanılarak çözelti.
  9. (37 ° C önceden ısıtılmış) ++ 10 mi DPBS ekleme ve çözünene kadar hafifçe baş aşağı çevirerek enzim karışımı içinde çözülür.
  10. Yeni 50 ml tüp akciğerlere aktarın ve ince kıyılmış kadar neşter kullanılarak tüp duvara akciğer doğrayın. dokuya (10 mi, yetişkin fare / sıçan yavru akciğer başına enzim karışımı /) enzim karışımı ekleyin tüpü sıkıca kapatın ve (yumuşak çalkalama ile 38 ° C'de inkübe ya ısı karıştırıcı, çalkalanan bir su banyosu ya da su içinde düzenli manuel ajitasyon ile banyo). Fetal doku 60 dakika, çocuk / erişkin doku 90-120 dakika, fibrotik yetişkin doku 120-150 dk: süre doku tipine bağlıdır.
  11. iki değerli katyonlar w şelat sindirim durduruni 200 Etilendiamintetraasetik asit ul (EDTA, 0.15 M, pH 7.4 ile yıkanır. Steril filtre kullanılmadan önce 0.22 um membran filtre kullanılarak çözeltisi).
  12. 20 mi% 5 fetal sığır serumu (FBS) / PBS ilave edin ve yeni bir 50 mL tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden Bütün süspansiyon geçmektedir. 40 ml kadar olan toplam hacim getiren 10 mi,% 5 FBS / PBS ile boru ve hücre süzgecinden yıkayın.
  13. 500 xg, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj.
  14. 40 ml% 5 FBS / PBS tekrar süspansiyon, (pelet açıkça görülebilir olmalı) Süpernatantı ve santrifüj adımı 1.13 tekrarlayın.
  15. 4 mi,% 5 FBS içinde yeniden süspanse / PBS (RT) ve dikkatli bir şekilde fazla 3 mi yoğunluk gradyan maddesi tabakası (1.073 g / cm3), 15 ml'lik bir tüpe 14. İyi bir interfaz elde etmek için, tek bir hücre süspansiyonu katman, çok düşük bir hızda> 45 ° 'lik açıyla meydana çok önemlidir.
  16. 900 xg'de Santrifüj 20 dakika, orta (5/10) hızlanma, hiçbir yavaşlama, 19 ° C.
  17. in mevcut hücreleri toplayınterphase ve steril 10 ml PBS bunları tekrar süspansiyon.
  18. 500 xg'de 5 dakika, 21 ° C santrifüj.
  19. 500 mi αMEM,% 20 hacim / hacim FBS başına 2 mmol L-glutamin ile takviye edilmiş Süpernatantı ve 10 ml hücre pelletini önceden ısıtılmış tamamlanmış L-MSC kültür ortamı (minimum temel ortam Kartal, alfa modifikasyonu (αMEM), ve% 1 hacim / hacim Penisilin / streptomisin / Amfoterisin B
  20. Tekrar santrifüj adımı 1.18. Daha sonra, önceden ısıtılmış taze kültür ortamı, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  21. Bu aşamada hücreler çoğu plastik yapışık değildir, çünkü yüksek bir yoğunlukta bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ve plaka kullanarak hücreleri sayın. Sıçan yavru akciğer hücreleri 1-2 önce tohum ekme yoğunluğu yeterince yoğun iken tam kaplama yoğunluğu X, örneğin, bir yetişkin fare akciğer hücreleri 10 5 hücre / cm2'de tohumlanmıştır hayvanın türüne ve yaşına bağlıdır 10 4 hücre / cm2 / cm 2 kullanın.
  22. Kültürü L-erişkin nemlendirilmiş bir% 5 O2,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de.
  23. PBS ile bir kez durulama sonra ortam ilk ekimden 24 saat sonra, ve daha sonra, her 3 günde bir değiştirin. Hücreler kökenli hayvan bağlı olarak ortalama 3-5 gün sürer% 80-90 izdiham kadar kültürlü olmalıdır. Yüksek izdiham fibroblastlar içine farklılaşmasını teşvik edecektir.

CD146 + Akciğer Mezenkimal Stromal Hücrelerin 2. Seçim

  1. Ikincil antikor ile manyetik boncuk kaplanması
    1. Steril koşullarda cryovial Coat yuvarlak tabanlı 10 ug ikincil antikor / 100 ul manyetik boncuk oranında biyotinlenmiş sekonder antikor ile, manyetik boncuklar, 2 ml'lik steril. Beklenen 0.5 x 10 6 hücre başına 10 ul ikincil antikoru kullanarak, ve 100 ul manyetik boncukları ve 10 ug antikor, en az kullanın.
      Not: oranıüreticileri arasında farklılık gösterebilir boncuk hacmi başına kullanılan antikorlarının verilmesinin, seçim boncuk için üreticinin talimatlarına başvurun. Bu protokol, bu protokolün optimizasyonu kullanılan boncuk ve antikor masaya 1 bakınız.
    2. Oda sıcaklığında / 30 dakika (RPM), 30 dakika için bir döner Örnek karıştırıcı içinde inkübe edin.
    3. 1.5 ml steril% 0.1 sığır serum albümini (BSA) boncuk tekrar / PBS ve 3 ml transfer yuvarlak tabanlı tüp (tüp akış sitometrisi). Ek bir 1.5 mi% 0.1 BSA / PBS ile dondurarak saklamaya uygun vialler durulayın ve 3 ml tüp aktarın.
    4. Uygun bir mıknatıs tüp yerleştirin ve tüm boncuk tüpün arka duvara bağlı ve çözelti berrak kalır kadar 2 dakika bekleyin. 3 ml% 0,1 BSA / PBS ile iki kez akış ve tekrar yıkama çıkarın.
    5. ışıktan korumalı 4 ° C 'de 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde boncuklar ve mağaza, yeniden süspanse edin. 5 gün içinde kullanın.
  2. CD146 + L-mezenkimal Etiketleme
    1. yumuşak olmayan bir tripsin çözeltisi kullanılarak PBS ile durulandıktan sonra mezenşimal hücrelerin hasat.
      Not: Cilt kültür şişesi büyüklüğüne (0.2 ml / cm2, orta ya da PBS) bağlıdır.
      1. kültür ortamı çıkarın ve steril PBS ile hücreler üç kez yıkayın.
      2. Yumuşak olmayan tripsin çözeltinin uygun hacmi ekleyin (Tablo 1 e bakınız). Hücreler müstakil kadar Tablo 1 'de çözeltisi kullanıldığında, yaklaşık kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 10 dakika kuluçkalayın.
      3. 500 x g'de 5 dakika boyunca, L-MSC kültür ortamı, ve santrifüj ekleyerek enzimi.
    2. % 0.1 BSA / PBS içinde, tekrar süspansiyon hücreleri Süpernatantı ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
      Not:% 0.1 BSA hacmi / PBS kültür şişesi büyüklüğüne bağlıdır: 5 ya da 10 mi% 0.1 BSA / PBS için amaçlanmıştır.
    3. Adımı yineleyin 2.2.2 ve 3 ml% 0,1 BSA / PBS (bloklar un hücrelerin özel miktarda tekrar süspansiyonBelirli bağlanma yerleri ve) hücrenin hayatta kalabilmesi için. hücreleri buz üzerinde tutun.
    4. birincil anti-CD146 antikoru ile alt tüp yuvarlak bir 3 ml hazırlayın, ve buz üzerinde tutmak.
      Not: hücrelerin özel bir miktarda ilave edilir ki ilk antikor konsantrasyonu kullanılır antikor bağlıdır. Önerilen anti-sıçan CD146 antikoru için bakınız Tablo 1.
    5. primer antikor ile tüp aşama 2.2.3 hücrelerin toplam hacim. Sıkıca kapatmak ve 15 rpm, 4 ° C'de dönen bir örnek mikserde 30 dakika kuluçkalayın.
    6. 500 xg, 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje hücreleri, 3 mi% 0.1 BSA / PBS içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. Tekrarlayın santrifüj adımı.
    7. Bölüm 2.1'de talimatlara göre hazırlandı ve 15 rpm, 4 ° C'de dönen bir örnek mikserde 30 dakika inkübe edildi ikincil antikor kaplı boncuklar içeren 3 ml çözelti içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. CD146 + L-mezenkimal seçme
    1. Mıknatıs üzerinde etiketli CD146 + L-MKH'lerin içeren tüp yerleştirin. pozitif hücrelerin tüpün arkasına çizilecektir. tüp hareketli veya boncuklar dokunmadan yavaşça steril bir Pasteur pipeti (bu toplanır ve deneysel tasarım göre atılabilir olarak) negatif hücreleri ile süpernatant hasat edilir.
    2. mıknatıstan tüpü çıkarın ve 3 ml% 10 BSA / PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Adım 2.3.1 açıklanan seçim prosedürü tekrarlayın. dört kez daha (Σ 5 Seçim aşama).
    3. Önceden ısıtılmış L-MSC kültür ortamında CD146 + L-mezenkimal yeniden süspanse edin ve mıknatıs geri döner.
    4. Uygun büyüklükte bir kültür şişesi (0.2 ml / cm2) 'de, L-MSC kültür ortamı ve plakadaki supernatant, tekrar süspansiyon çıkarın. Genel bir kural olarak, aynı boyutta bir kültür şişesi içinde plaka hücreleri olan hücreler Boncuk seçiminden önce kaldırılmıştır. CD146 + L-MKH sayısı ve bu nedenle kaplama yoğunluğu, olacakKaynak hayvanın yaşı, türler ve suşuna bağlıdır. Her zaman ~ 5,000 hücre / cm2 bir kaplama yoğunluğu hedefliyoruz.
      Not: boncuk hücre büyümesini rahatsız etmeyecek ve hücreler çoğalmaya olarak yavaş yavaş kaybolacaktır.

3. Dondurucu Hücreler

  1. Aşağıdaki dondurma ortamı kullanın:% 20 FBS,% 12.5 (% 0.9 NaCI içinde% 10 pentastarch)% 60 pentastarch çözeltisi CPDA-1,% 2.5 NaCI (% 0.9),% 5 dimetil sülfoksit (DMSO) 22.
    Not: tüm malzemeyi varsa,% 5 DMSO,% 30 FBS ve% 65 αMEM içeren bir çözüm iyi bir alternatiftir.
  2. 1 ml her bir cryovials 0.5 x 10 6 hücre / mL, kısım yeniden süspanse hücre bir donma kap kullanılarak -80 ° C 'de O / N dondurma.
  3. Sonraki gün, bir sıvı azot depolama tankı transfer.

4. Çözülme Hücreler

  1. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içinde hücreleri bir şişe çözülme.
  2. 10 ml içinde süspanse edin hücreleriönceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile 500 x g'de 5 dakika, 21 ° C'de santrifüjlenir.
  3. Süpernatantı ve 10 ml kültür ortamı içinde hücre pelletini. Havalandırmalı kap hücre kültürü içinde tohum hücreleri, 0.2 ml / cm2 ortam 5000 hücre / cm2'de şişeler muamele (örneğin, 75 cm 2 şişeye 15 mL) eklenmiştir.
  4. % 5 Kültür hücreleri O2,% 5 hasat ve / veya deneysel kullanım için% 80-90 konfluent kadar CO2. Aşırı confluency farklılaşmasını neden olacaktır. 5.000 hücre / cm 2 ekim yaparken, L-MKH kültürü 3-4 gün içinde% 80-90 confluency ulaşacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MKH, yoğunluk ve plastik bağlılığın en güvenilir fiziksel özelliklerinin İki, L-MKH'lerin içeren akciğer mezenkimal hücre fraksiyonu elde etmek için bu protokolün ilk bölümünde kullanılmaktadır. yoğunluk gradyan interfaz akciğer mezenkimal hücrelerin yanı sıra monosit ve makrofajlar dahil olsa da, plastik yapışma kültür 3-5 gün sadece akciğer mezenkimal hücreler kalmasını sağlar izledi. Nitekim bu hücre popülasyonu klasik MSC yüzey belirteçleri CD73, CD90 ve CD146 ifade ve artık herhangi bir lökositler mevcut olduğunu belirten belirteçler CD34, CD45, MHC kompleksi tip II (MHC II) -RT1B, CD11b ve CD79a için negatiftir hücre popülasyonu (Şekil 2A). Ilgi CD146 + alt-grup üzerinden, 44,4-65,7% bir aralık, aynı zamanda CD73 + ve CD90 + (veriler gösterilmemiştir) olmasıdır. Ayrıca, bu hücre popülasyonu, bir edebilenkoloni oluşturan birim (CFU) verimi o% 30, genel olarak kemik iliği MSC hatta diğer MSC türleri (Şekil 2B) için bildirilen çok daha yüksektir, ve üç klasik MSC soy (Şekil 2C) boyunca ayıran ~ En.

şekil 2
Enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma ve plastik yapışma sonrasında Şekil 2. MSC özellikleri. MSC ile ilişkili yüzey belirteçleri (A) ifade CD146, CD73 ve CD90, plastik yapışık hücre nüfusunun parçası içinde mevcut olan negatif lökosit belirteçleri CD11b, CD79a, oysa CD34, CD45 ve MHC II-RT1B neredeyse ifade edilmemiştir. (B) Koloni seyreltme deneyi (5 hücre / cm2) sınırlandırarak birimi deneyi oluşturan plastik yapışan hücrelerin% 30 MSC göstergesi olan bir klonal kapasitesi vardı ~ olduğunu göstermiştir. (C) Plastik yapışık cerf osteojenik matris üretimi (kırmızı) yeteneğine sahip olan, olmayan farklılaşmış kontrollere göre adipogenic farklılaşma ortamı ile uyarılan ve kondrosit (kırmızı) içeren küreler gibi kondrojenik oluşan küçük lipid veziküller (kırmızı) daha yüksek bir sayıda içeriyordu. Veriler, ortalama ± standart ortalama hatası (SEM) olarak gösterilmektedir. Tüm veriler kanalı 1-3 hücreleri ile üretilmiştir. NM = negatif belirteçler; CFU = koloni oluşturan üniteler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bununla birlikte, temel uyarı bu nüfus olasılıkla L-MSC'ler ve akciğer fibroblast tipi ayırt hem L-MSC'ler döl 23 farklılaşmış içermesidir. Multipotency pozitif CD146 ekspresyonu ile ilişkilidir ve fibroblastların bu markörün hiçbir ifade, CD146 + alt popülasyonu O pozitif seçim olmalıdır yanastensibly yüksek L-MSC içinde zenginleştirilmiş olan bir hücre popülasyonu ile sonuçlanmıştır. Bu açık bir şekilde, MSC ilişkili yüzey belirteçleri (Şekil 3A) eksprese eden bir hücre popülasyonu daha yüksek bir yüzdesi ile gösterilir, ~% 80 bir önemli ölçüde daha yüksek koloni oluşturucu potansiyeli (Şekil 3B) ve özellikle de kondrojenik soy daha güçlü bir farklılaşma yanıtı (Şekil 3C) CD146 seçimden önce elde edilen toplam mezenkimal popülasyona göre. notun bu L-MKH formu sadece çok az gerçek adipositler, ama küçük lipid veziküller ile doldurulur daha birçok iğ şekilli hücreler gösteriyor olmasıdır. Bunlar akciğer gelişimi ve alveol tip II hücre desteği hem de çok önemlidir lipofibroblast soyunu yansıtıyor olabilir. CD146 Seçimden sonra, büyük lipid veziküller ile dolu hücreleri gibi daha adiposit CD146 seçiminden önce karşılaştırıldığında (Şekil 3C) görülebilir, ancak hücrelerin çoğunluğu hala lipofibroblasts gibi ce vardırküçük lipid kabarcıklar içeren rf.

Şekil 3,
Ek CD146 + manyetik boncuk seçimi Şekil 3. MSC özellikleri. CD146 + alt populasyonun pozitif seçilmesinden sonra, bu hücreler, özellikle (A) 'da MSC ile ilişkili yüzey belirteçleri daha yüksek bir ekspresyonu, CD73, tek bir hücre sonra önemli ölçüde daha yüksek verimlilik göstermiş; CFU kaplama (B) ve adipojenik soy (C), özellikle kondrojenik soy ve daha az bir ölçüde daha güçlü bir farklılaşma yanıt. Veri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. Tüm veriler kanalı 3 hücreleri ile üretilmiştir. NM = negatif belirteçler; Birimleri oluşturan CFU = koloni. T tıklayınızo bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntüleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birincil L-MKH izolasyonu ve kültürü daha iyi işlev ve hücresel düzeyde diğer hücre popülasyonlarının ile olan etkileşimlerini ve akciğer gelişimi, sağlık ve hastalık rollerini anlamak için bir fırsat sunuyor. Bu, belirli bir hücre tek işaretleyici olmaması neredeyse imkansız yerinde bu hücrelerin çalışma yapar, bu özellikle önemlidir. Tüm ilköğretim hücre popülasyonlarının olduğu gibi, kimse bu hücreler (24 gözden) kültür 19 tutulur artık onların karakteri değiştirmek için daha muhtemel olduğunu akılda tutmak gerekir. Doğal halde mümkün olduğu kadar yakın olan bir durumda L-mezenkimal tutmak için, bunların 37 ° C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 O2,% 5 CO2 içinde kültürlenir çok önemlidir. Solunum fizyolojisi genellikle Dalton'un kısmi basınçlar yasasına dayanarak, ortam havasındaki (% 21 O 2) kısmi oksijen basıncı ~ 10 160 mmHg ve düşer kabul edilmektedirAlveoler hava sahasında 25-27 1 mmHg. Olgun akciğer alveolar-arteriyel PaO2 gradyan ~ 3-4 mmHg, ancak bu alveol-arteriyel mesafe 25,28 artan bir hastalıklı veya olgunlaşmamış akciğer önemli ölçüde artış olabilir. Vücudun içinde, mezenkimal niş normalde% 2-8 29,30 bir oksijen konsantrasyonuna maruz kalmaktadır. Sadece birkaç kağıtlar aslında akciğerlerde PO 2 ölçtük, ancak bir çalışma 42.8 mmHg 27,31 medyan ile 23 656 mmHg PO 2, normal akciğerde bir dizi bulma, 20 hastanın akciğerlerinde bu ölçtü. Dalton yasasına göre, 37 ° C sıcaklık ve% 5 O 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör normal akciğer dokusunda ölçülen aralığında mükemmel düşer ve medyan çok yakın ~ 36 mmHg po 2 sahiptir. Buna ek olarak, düşük oksijen kültür koşulları kültür 29 progenitör popülasyonlarının korunmasını sağlamak. Birlikte ele alındığında, bu iOksijen konsantrasyonu L-MKH, normal doğum sonrası gelişim ya da hastalık sırasında farklı aşamalarında yerinde maruz tam olarak ne söylemek zor, ancak% 5-10 O 2 fizyolojik perspektiften 27,31 den büyük olasılıkla en doğru olduğu görülmektedir. Yukarıda belirtilen bilgilere dayanarak, bizim kültür koşullarında% 5 O 2 korumak için seçti ve biz bu koşulların in vitro muhafaza edildiğinde, L-MKH, daha hızlı büyüdüğünü, daha az stres lifleri görüntüler ve daha küçük bir olasılık olacağı bulundu spontan farklılaşma ya da yaşlanma. spontan farklılaşma ya da diğer anormallikleri önleyecektir ek faktörler, geçiş için hafif bir sigara tripsin ayrışma ajanı kullanılarak onlar% 80-90 confluency (yoğun şartlar fibroblast farklılaşmasını teşvik edecektir) ulaştığında L-MKH'lerin pasaj ve düşük geçiş numarasını tutarak olduğunu (<P4). Hoffmann ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, tripsin L-MKH fonksiyonu üzerinde olumsuz etkileri olduğu gösterilmiştir vetripsin ücretsiz ayrışma ajanlar ise fenotip, bu 13 korumak olabilir.

yalıtım işlemi sırasında verimi optimize etmek için, doku kurumasına izin verilmemelidir akılda tutarak, hem ince mümkün akciğerlere kıyma önemlidir. enzimatik sindirim sırasında, tüpler doku parçaları tortu gibi sık sık, ısıtmalı sallayarak cihazı kullanılarak değilse çalkalanır ve enzimler optimum pozlama almazsınız önemlidir. Başka bir önemli adım yoğunluk gradyan ayrılık: katman çok yavaş ya da bir açı <45 ° yapılır değilse, tüm hücre popülasyonunun kaybına neden yerine tabakaların iki sıvının karıştırılması yol açacaktır. Ayrıca, yoğunluk gradyanlı ortamın yoğunluğu çevre sıcaklığına çok bağlıdır. 19 ° C (ya da RT) daha başka bir sıcaklık optimal veya yoğunluk gradyan ayırma ile sonuçlanacaktır.

f ilgiBu protokolün uture kullanıcıları başarıyla, izolasyon önce 24 saat kadar hasat edildi akciğerlerden canlı L-MKH'lerin izole akciğerler doğrudan hasat sırasında soğuk L-MSC medya saklanır şartıyla, ve 4 muhafaza olmasıdır ° C. Bu daha esnek deneysel planlama, ya da farklı laboratuvarlar arasındaki akciğerlerin bile sevkiyata izin verir. Verim taze hasat akciğerin bu genel olarak benzerdir ve hücreler eşit olarak büyür.

mümkün olacaktır Diğer bir değişiklik, prosedür hücrelerinin yüksek basınç ve hız maruz daha fazla bir zaman alır ve bu yöntem, daha fazla strese hücre tabi halde yerine manyetik boncuk seçimi FACS kullanmaktır ve kirlenme riski taşımaktadır eğer steril koşullar altında yapılır değil. Burada kullanılan manyetik boncuk hücre büyümesi müdahale ve kültür birkaç gün içinde yok yok. FACS veya manyetik boncuk sıralama için bir tercih de mevcut olanakların bağlı olabilirson kullanıcıya. Buna ek olarak, diğer dokulardan yerleşik MKH'lerin izole etmek için bu protokolü değiştirmek mümkün olacaktır. Bu durumda matris kompozisyon organları arasında değişir, ilgi organına enzimleri terzi önemli olacaktır.

Sadece mezenkimal hücreler elde etmek için yoğunluk gradiyenti ve sonraki plastik bağlılığı kullanarak önemli bir kısıtlılığı, ortaya çıkan nüfus L-MKH'lerin ve fibroblast hem içermesidir. CD146 + hücreleri için güçlü ilaçlar bu uyarı seçilmesi fakat CD146 + seçim prosedürü ve dikkatli kültürleme koşulları, L-MSC doğasına ve in vitro hücre kültürü etkilerine rağmen imkansız fibroblastlara farklılaşma bir dereceye engellenmesini mümkün kılmaktadırlar. Genel olarak MKH onlar terminal farklılaşmış fibroblastlar oluncaya kadar hücreleri daha da aşağı hiyerarşi yavaş yavaş multilinaj potansiyelini kaybettiği multipotency bir hiyerarşi içeren rapor edilmiştir <sup> 23. Büyük olasılıkla bu da L-MSC niş 4 oluşur ve CD146 ifadesini kaybetmiş CD146 + seçimden sonra zaten bir geçiş hücrelerinin yaklaşık% 40 olarak kültürlü CD146 + nüfus yansıtılması gibi görünüyor. Ayrıca, bu popülasyonda sadece% 80 CD73 ve% 40 CD90 ifadesi vardır. bölümünde, bu multipotency MSC hiyerarşisi tarafından açıklanabilir. CD146 + CD146 pozitif MSC ve negatif, daha farklılaşmış, yavru hücrelere hem sebebiyet veren, asimetrik çoğalması tabi mümkün olacaktır. Akciğerin Resident MKH da makul CD73 ve CD90 ifade tanımı dayandığı kemik iliği MKH gelen biraz farklı bir fenotip ve işlevini olması beklenebilir. Hücre Tedavisi Uluslararası Toplum tüm MKH CD73 ve CD90 gibi klasik MSC belirteçleri, ifade olduğunu kabul etmiştir ve bu yüzey işaretleyici ifade MKH 32 tanımlamak için en iyi yol değildir. eCD146 + L-MSC nüfusunun% 70 ~ arasında xceptionally yüksek CFU verim bu destekler. CD146 + nüfus sıralanmamış mezenkimal nüfusa oranla MSC özellikler açısından daha iyi performans için, yazarlar daha CD146 karakterize değil - nüfusu. Biz MKH ile mezenkimal nüfusu zenginleştirmek ve fibroblast onları tüketmek için gayret, ama biz bu tek gerçek L-MSC nüfus olduğunu iddia etmiyorum. L-MKH kökenli, fenotip ve fonksiyon hem de muhtemelen çok heterojendir.

CD146 yaygın MKH ve perisitlere 16,17,33,34 yılında multipotency bir göstergesi olarak kabul edilmesine rağmen, çok az in vivo CD146 + MSC nüfusu hakkında bilinmektedir. CD146 anjiyojenez ve endoteliyal hücre fonksiyonu için önemli olan bir hücre adezyon molekülüdür, ve endotel hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, MSC ve T-lenfositleri 15,16,35,36 olarak ifade edilir. Son yıllardaMKH birden organlarda perivasküler niş yaşamak olduğunu kanıtlar ortaya çıkmıştır MSC-belirteçler CD73 ve CD105 37 için CD146 + hücreleri eş-leke olarak. Gerçekten de, kültürlenmiş perisitler ve erişkin MSC'ler perisitlerin 4,39 türetilir görünümü güçlendirilmesi, çok benzer bir gen tanımlama profili 38 sahiptir. Biz immünohistokimyasal bizim CD146 + L-MSC nüfusun konumunu belirlemek için analiz yapmamış olsa da, onlar da perivasküler konumda olacağını çok muhtemeldir. Gelecekteki çalışmalar bunun gerçekten de böyle olup olmadığını doğrulamak için gerekli olacaktır. Tüm hücreler fenotipik CD146 + seçimden sonra çok benzer olduğuna işaret edilmelidir rağmen, bizim hücre popülasyonunun bir alt kümesi perisitler olmaları mümkündür.

Mezenkimal stromal hücreler nedeniyle tek her şeyi kapsayan marker eksikliği tespit herkesin bildiği gibi zor. Çeşitli çalışmalar izolasyonu için farklı yöntemler bildirilmiştirL-MSC nin ve ikna edici Bu hücreler MSC markör ifadesi bakımından birbirine benzer olduğunu göstermiştir. Burada sunulan CD146 + L-MSC popülasyon büyümesinin veya FACS çeşitli biçimleri, Sca olarak kök hücre ilişkili yüzey belirteçleri ile elde edildiği gibi, daha önce rapor L-MSC popülasyonlarının çok benzer, CD146 + L-MSC karakterizasyonu göre -1, ABCG2 ve CD90. L-mezenkimal 13 dışa büyümesinin ile karşılaştırıldığında, CD146 + L-erişkin eden bir yöntem, daha zengin bir multipotent L-MSC popülasyonu verir gösteren tek hücre kolonileri yol vermek için daha büyük bir yeteneğe sahip gibi görünmektedir. CD90 7 veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü a (PDGFRα) 40,41 dayalı L-MKH'lerin izole yöntemlerine göre her iki yüzey belirteçleri de daha terminal farklılaşmış lipofibroblasts ve alveol / yapısal fibroblast ve için seçerken, bu avantaj, aynı zamanda doğrudur can bu nedenle sadece makul be stromal hücreleri 20,42 olarak belirlenmiştir. Bunun aksine, her iki Sca-1 ve ABCG2 de stemness ve MSC ifade 9,43-46 ile ilişkili işaretleri belgelenmiştir. Burada bildirilen yöntem Ficoll degrade ve plastik bağlılık yoluyla endotel hücrelere karşı seçer oysa onlar, CD31 46 için% 99 pozitif olarak ABCG2 + L-erişkin ancak daha endotel doğası var. McQualter ve arkadaşları 5,8 arasında Sca-1 göre yalıtım protokolüne göre eden yöntemin en önemli avantajı, Sca-1 kullanılamaz olan farelere göre diğer türler, yaygın olarak uygulanabilir olmasıdır.

imkansız muhtemelen hemen hemen, çok zor olmasına rağmen, geç gelişen veya yetişkin akciğer L-MKH bir "saf" nüfus elde etmek ve farklılaşmamış bir devlet onu korumak için, burada sunulan protokol bir hızlı, tutarlı ve güvenilir bir yöntem sağlar bir hücre popülasyonu elde derece multipotent kendini sürekli yenileyen akciğer res zenginleştirilmiştanım MKH. Bu yöntemi kullanarak, geniş bir hastalık modellerinin çeşitliliği ve gelişmekte olan akciğer rollerinden L-MKH rolünün daha tanımlı bir çalışma sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  2. Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5, 9514-9529 (2014).
  3. Marriott, S., et al. ABCG2pos lung mesenchymal stem cells are a novel pericyte subpopulation that contributes to fibrotic remodeling. Am J Physiol Cell Physiol. 307, 684-698 (2014).
  4. Collins, J. J., Thebaud, B. Lung mesenchymal stromal cells in development and disease: to serve and protect. Antioxid Redox Signal. 21, 1849-1862 (2014).
  5. McQualter, J. L., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27, 623-633 (2009).
  6. Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: stem cell antigen-1: expression, function, and enigma. Stem Cells. 25, 1339-1347 (2007).
  7. Gottschling, S., et al. Mesenchymal stem cells in non-small cell lung cancer--different from others? Insights from comparative molecular and functional analyses. Lung Cancer. 80, 19-29 (2013).
  8. Bertoncello, I., McQualter, J. Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 2, Unit 2G 1 (2011).
  9. Jun, D., et al. The pathology of bleomycin-induced fibrosis is associated with loss of resident lung mesenchymal stem cells that regulate effector T-cell proliferation. Stem Cells. 29, 725-735 (2011).
  10. Majka, S. M., et al. Identification of novel resident pulmonary stem cells: form and function of the lung side population. Stem Cells. 23, 1073-1081 (2005).
  11. Hennrick, K. T., et al. Lung cells from neonates show a mesenchymal stem cell phenotype. Am J Respir Crit Care Med. 175, 1158-1164 (2007).
  12. Salama, M., et al. Endothelin-1 governs proliferation and migration of bronchoalveolar lavage-derived lung mesenchymal stem cells in bronchiolitis obliterans syndrome. Transplantation. 92, 155-162 (2011).
  13. Hoffman, A. M., et al. Lung-derived mesenchymal stromal cell post-transplantation survival, persistence, paracrine expression, and repair of elastase-injured lung. Stem Cells Dev. 20, 1779-1792 (2011).
  14. Grisendi, G., et al. GMP-manufactured density gradient media for optimized mesenchymal stromal/stem cell isolation and expansion. Cytotherapy. 12, 466-477 (2010).
  15. Bardin, N., et al. S-Endo 1, a pan-endothelial monoclonal antibody recognizing a novel human endothelial antigen. Tissue antigens. 48, 531-539 (1996).
  16. Covas, D. T., et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol. 36, 642-654 (2008).
  17. Russell, K. C., et al. In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment. Stem Cells. 28, 788-798 (2010).
  18. Sorrentino, A., et al. Isolation and characterization of CD146+ multipotent mesenchymal stromal cells. Exp Hematol. 36, 1035-1046 (2008).
  19. Halfon, S., Abramov, N., Grinblat, B., Ginis, I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev. 20, 53-66 (2011).
  20. McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
  21. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of experimental medicine. 99, 167-182 (1954).
  22. Hayakawa, J., et al. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) and pentastarch improves cryopreservation of cord blood cells over 10% DMSO. Transfusion. 50, 2158-2166 (2010).
  23. Sarugaser, R., Hanoun, L., Keating, A., Stanford, W. L., Davies, J. E. Human mesenchymal stem cells self-renew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 4, 6498 (2009).
  24. Prockop, D. J. Repair of tissues by adult stem/progenitor cells (MSCs): controversies, myths, and changing paradigms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 939-946 (2009).
  25. Respiratory Physiology. UCL. , Available from: https://www.ucl.ac.uk/anesthesia/people/RespPhysiolLong.pdf (2015).
  26. Boron, W. F., Boulpaep, E. L. Medical Physiology. 2nd edn. , Saunders Elsevier. (2009).
  27. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15, 1239-1253 (2011).
  28. Heller, H., Brandt, S., Schuster, K. D. Determination of alveolar-capillary O2 partial pressure gradient by using 15NO. Nitric oxide : biology and chemistry / official journal of the Nitric Oxide Society. 12, 127-128 (2005).
  29. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi, T., Quinones-Hinojosa, A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche. Cell stem cell. 7, 150-161 (2010).
  30. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 285-296 (2008).
  31. Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12, 1507-1514 (2006).
  32. Krampera, M., et al. Immunological characterization of multipotent mesenchymal stromal cells-The International Society for Cellular Therapy (ISCT) working proposal. Cytotherapy. , (2013).
  33. Corselli, M., et al. Identification of perivascular mesenchymal stromal/stem cells by flow cytometry. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83, 714-720 (2013).
  34. Russell, K. C., et al. Cell-Surface Expression of Neuron-Glial Antigen 2 (NG2)and Melanoma Cell Adhesion Molecule (CD146) in Heterogeneous Cultures of Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue engineering. Part A. , (2013).
  35. Lv, F. J., Tuan, R. S., Cheung, K. M., Leung, V. Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1408-1419 (2014).
  36. Dagur, P. K., et al. Secretion of interleukin-17 by CD8+ T cells expressing CD146 (MCAM). Clinical immunology. 152, 36-47 (2014).
  37. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).
  38. da Silva Meirelles, L., et al. Cultured human adipose tissue pericytes and mesenchymal stromal cells display a very similar gene expression profile. Stem Cells Dev. , (2015).
  39. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes. Cell stem cell. 3, 229-230 (2008).
  40. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. J Clin Invest. 123, 3025-3036 (2013).
  41. McGowan, S. E., McCoy, D. M. Regulation of fibroblast lipid storage and myofibroblast phenotypes during alveolar septation in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307, 618-631 (2014).
  42. Chen, L., Acciani, T., Le Cras, T., Lutzko, C., Perl, A. K. Dynamic regulation of platelet-derived growth factor receptor alpha expression in alveolar fibroblasts during realveolarization. Am J Respir Cell Mol Biol. 47, 517-527 (2012).
  43. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7, 1028-1034 (2001).
  44. Bonyadi, M., et al. Mesenchymal progenitor self-renewal deficiency leads to age-dependent osteoporosis in Sca-1/Ly-6A null mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5840-5845 (2003).
  45. Ito, C. Y., Li, C. Y., Bernstein, A., Dick, J. E., Stanford, W. L. Hematopoietic stem cell and progenitor defects in Sca-1/Ly-6A-null mice. Blood. 101, 517-523 (2003).
  46. Chow, K., et al. Dysfunctional resident lung mesenchymal stem cells contribute to pulmonary microvascular remodeling. Pulmonary circulation. 3, 31-49 (2013).

Tags

Hücre Biyolojisi Sayı 108 Kök Mezenkimal stromal hücreler doku ikamet kök / öncül hücreler akciğer sıçan rejeneratif tıp manyetik boncuk seçimi
CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, J. J. P., Möbius, M.… More

Collins, J. J. P., Möbius, M. A., Thébaud, B. Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs. J. Vis. Exp. (112), e53782, doi:10.3791/53782 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter