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Biology

Isolement de CD146 Published: June 17, 2016 doi: 10.3791/53782
Automatic Translation
1,2, 1,3,4, 1,2,5
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

Summary

Ce protocole décrit une technique d'isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l'utilisation d'une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l'adhérence plastique et CD146 + sélection de billes magnétiques.

Abstract

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l'utilisation de l'os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. En outre, ils ont probablement un rôle dans le développement normal des organes, et elles ont été attribué un rôle dans les maladies, en particulier ceux qui ont une nature fibreuse. Le principal obstacle pour l'étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l'absence d'un marqueur clair pour l'isolement et l'identification de ces cellules. La technique d'isolement décrites ici applique plusieurs caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses de résidents du poumon (L-MSC). Sur le sacrifice des rats, les poumons sont retirés et rincés plusieurs fois pour enlever le sang. Suite à la dissociation mécanique de scalpel, les poumons sont digérés pendant 2 à 3 heures en utilisant un mélange de collagénase de type I, de type protéase neutre et de la DNase I. Le obtained suspension cellulaire unique est ensuite lavée et posés sur milieu à gradient de densité (densité 1,073 g / ml). Après centrifugation, les cellules de l'interphase sont lavées et étalées dans des flacons de culture traitée. Les cellules sont cultivées pendant 4-7 jours dans physiologique 5% O 2, 5% CO 2 conditions. Pour épuiser fibroblastes (CD146 -) et d'assurer une population de seulement L-MSC (CD146 +), la sélection positive pour CD146 + cellules est effectuée par la sélection des billes magnétiques. En résumé, cette procédure produit fiable une population de primaire L-MSC pour complément d'étude in vitro et la manipulation. En raison de la nature du protocole, il peut facilement être converti en d'autres modèles animaux expérimentaux.

Introduction

cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de plus en plus reconnus pour leur potentiel thérapeutique dans un large éventail de maladies, y compris les maladies pulmonaires. Outre l'utilisation de l'os MSC de cordon ombilical pour la thérapie cellulaire exogène osseuse et, il est également un intérêt croissant pour la réparation et le potentiel de régénération des cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents. Au cours du développement, y compris dans le poumon, le mésenchyme est une source importante d'indices de développement, et MSC résidents sont un candidat susceptible d'être au centre de cette. De plus, la preuve est en train d'émerger que les CSM résidents sont perturbés dans les maladies adultes, y compris le cancer et la fibrose 1,2 3. Le principal obstacle pour l'étude de ces cellules souches mésenchymateuses du tissu résidents est l'absence d'un marqueur clair pour l'isolement et l'identification de ces cellules 4. Cellules souches antigène-1 (Sca-1) a été identifié chez la souris en tant que marqueur pour une variété de cellules souches de tissu, et peut être utilisée pour l'isolement de cellules souches mésenchymateuses L-5, mais il a malheureusementpas connu orthologues chez d'autres espèces 6. Les chercheurs ont fait état d'une variété de différentes méthodes d'isolement pour l'isolement de la L-MSC soit de tissu pulmonaire ou fluide. Celles-ci varient de cellules activées par fluorescence (FACS) méthodes basées sur la sélection de CD31 - / CD45 - / CD90 + des cellules 7, CD31 - / CD45 - / épithéliale molécule d'adhésion cellulaire (EpCAM) - / Sca-1 + Cellules 8, multirésistance transporteur ATP binding cassette G (ABCG2) cellules positives 9 ou colorant Hoechst 33342 efflux 10, à l'adhésion et la migration en plastique 11,12 sur tissu haché 13.

Les avantages du procédé de ce document sont présentés plusieurs fois. En utilisant une digestion enzymatique doux et gradient de densité 14, on obtient toutes les cellules de la plage de densité qui incluent MSC, mais excluent les cellules épithéliales ou endothéliales. L'étape suivante en plastique d'adhérence assure que seul le mesenchcellules ymal adhérer et de rester dans la culture, ce qui élimine les leucocytes. Mais plus important encore, l'étape de sélection CD146 + permet l'élimination des fibroblastes, car ces cellules n'expriment CD146. Expression de la molécule d'adhésion des cellules CD146 est positivement corrélée avec multipotence, et est donc un bon marqueur pour éliminer les fibroblastes à partir d'une population de cellules mésenchymateuses 15-19. Ceci est un avantage par rapport à l'aide de CD90 en tant que marqueur de sélection, tel qu'il est exprimé non seulement dans le MSC, mais aussi dans lipofibroblasts 5,20. Dans ce protocole, nous avons explicitement choisi une sélection de billes magnétiques, car il est plus doux sur les cellules, et l'ensemble de la procédure peut se faire dans des conditions stériles. Un autre avantage important de ce procédé d'isolement, par opposition à la méthode de l'excroissance, est qu'il est relativement rapide, 6-10 jours par opposition à un mois ou plus pour le procédé de l'excroissance. Trois à cinq jours après l'isolement initial la population mésenchymateuses est prêt pour CD146 + sele ction; après trois à cinq jours, les cellules CD146 + sont prêts à être utilisés pour des expériences ou peuvent être congelés pour une utilisation ultérieure. Diminution du temps de culture améliore la qualité des cellules comme les fibroblastes MSC vers transdifférencier prolongée dans la culture 19 ex vivo. Enfin, en raison de la nature du protocole, il est possible d'appliquer ce procédé à d'autres espèces en choisissant simplement anticorps appropriés, ou même à d'autres systèmes d'organes en réglant le choix des enzymes de digestion et le temps d'incubation.

Un protocole détaillé de ce procédé d'isolement est donnée ci-dessous, et une vue d'ensemble schématique de l'isolement et de la sélection ultérieure de la sous-population CD146 + est fourni à la figure 1A et 1B, respectivement. En outre, les détails sont inclus pour des passages, la congélation et la décongélation de ces cellules.

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Figure 1. Vue d'ensemble schématique de l'isolement des cellules pulmonaires mésenchymateuses (A) et CD146 + subséquente sélection de cellule (B) min = minutes. EDTA = acide éthylène diamine; 2 e Ab = anticorps secondaire; a-CD146 Ab = anticorps anti-CD146 primaire; ve = cellules CD146 négatives des cellules; + ve cellules positives cellules = CD146. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux de l'Université d'Ottawa (protocole d'éthique animale IRHO-1696). soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles.

1. Isolement des cellules mésenchymateuses du poumon stromales

  1. Préparer le mélange d'enzymes dans un tube de 50 ml: peser 30 U protéase neutre, 2500 U collagénase I et 500 U DNAse I. Ces montants suffisent pour les poumons d'une souris adulte ou chiot de rat. Préparer le jour de l'isolement et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  2. chiots sacrifice de rat à 13 jours par une injection intra-péritonéale de pentobarbital sodique (0,2 ml, 65 mg / ml). Utilisez le pincement de l'orteil réflexe d'établir une perte de conscience. La mort de l'animal est assurée par l'ouverture de la poitrine, comme il est indiqué ci-dessous.
  3. Désinfectez la peau par pulvérisation de l'animal avec 70% d'éthanol et ouvrir avec précaution la cage thoracique à l'aide des ciseaux chirurgicaux, à partir de la membrane et la coupe vers le côté rostral, étant très attention à ne pasendommager les poumons. Étaler la cage thoracique ouverte à l'aide des pinces hémostatiques, ou encore couper la cage thoracique pour fournir un accès au niveau du thorax.
  4. Exsangue l'animal en retirant le cœur. Pour retirer le coeur, saisir le thymus et le cœur avec de petites pinces et couper ceux-ci avec des ciseaux chirurgicaux. Immédiatement après, absorber le sang avec une gaze jusqu'à ce que plus de sang qui sort de l'aorte et l'artère pulmonaire coupée.
  5. Retirez les poumons du thorax comme suit: maintenir la trachée avec une petite pince, puis couper la trachée avec des ciseaux chirurgicaux sur le côté rostral. Tout en tirant doucement l'ensemble du poumon sur le thorax, avec arrachement tout tissu conjonctif sur la face dorsale le long de la cage thoracique afin de libérer les poumons.
  6. Rompre les poumons de l'aorte et de l'oesophage en coupant le long de la membrane avec des ciseaux chirurgicaux. Maintenant que les poumons sont complètement libres du thorax enlever tout sang restant doucement avec une gaze.
  7. Retirez la trachée et des bronches avec surciseaux giques et transférer soigneusement les lobes pulmonaires dans un tube de 50 ml contenant froid 35 ml de 30% de citrate-phosphate-dextrose adenine (CPDA-1) anticoagulant (26,30 g de citrate trisodique dihydraté, de l'acide ascorbique 3,27 g monohydraté, 2,22 g de phosphate monosodique de dihydrogène, 31,80 g de D-glucose, 0,275 g d'adénine à 1 l H 2 O purifié, filtre la solution stérile en utilisant un filtre de 0,22 um avant utilisation de membrane) dans un tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer le sang et les débris.
  8. Après un rinçage de 5 minutes dans 30% CPDA-1 / PBS, transférer le poumon à un nouveau tube de 50 ml contenant 35 ml de phosphate stérile de solution saline tamponnée (PBS) (RT), inverser doucement pour enlever le citrate. Transférer dans un tube contenant 35 ml de PBS + Sodium pyruvate de Dulbecco + glucose (DPBS ++) (RT). Chaque étape de rinçage devrait prendre environ 5 min.
    Remarque: DPBS ++ peut être commandé dans le commerce ou constitué comme suit 21: chlorure de calcium dihydraté 132,4 mg, du chlorure de magnésium hexahydraté 100 mg, du chlorure de potassium (anhydre) 200 mg, le phosphate de potassium monobasique (anhydre) 200 mg de chlorure de sodium (anhydre) 8000 mg, de phosphate de sodium dibasique (anhydre) 1,144.5 mg, D-glucose 1000 mg, de pyruvate de sodium 36 mg dans 1 L H purifié 2 O, à pH 7,3. filtrer de manière stérile la solution en utilisant un filtre à membrane de 0,22 pm avant utilisation.
  9. Dissoudre le mélange enzymatique en ajoutant 10 ml de DPBS ++ (préchauffée à 37 ° C) et retournant doucement jusqu'à dissolution.
  10. Transférer les poumons à un nouveau tube de 50 ml et hachez le poumon sur la paroi du tube à l'aide d'un scalpel jusqu'à ce que finement haché. Ajouter le mélange de l'enzyme aux tissus (10 ml de mélange enzyme / par souris adulte / rat chiot poumon), fermer hermétiquement le tube et incuber à 38 ° C sous agitation douce (soit dans un mélangeur thermique, un bain d'eau agité, ou une eau salle de bain avec une agitation manuelle régulière). La durée dépend du type de tissu: tissu foetal 60 min, juvénile / adulte tissu de 90 à 120 min, un tissu adulte fibrotique 120-150 min.
  11. Arrêter la digestion par chélation des cations bivalents wième 200 ul d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. filtrant stérile la solution en utilisant un filtre à membrane de 0,22 pm avant utilisation).
  12. Ajouter sérum bovin 20 ml 5% fœtal (FBS) / PBS et passer la totalité de la suspension à 100 um filtre cellulaire dans un nouveau tube de 50 ml. Rincer le tube et le tamis cellulaire avec 10 ml de 5% de FBS / PBS, ce qui porte le volume total à 40 ml.
  13. Centrifuger pendant 5 min à 500 g, RT.
  14. Eliminer le surnageant (culot doit être clairement visible), remettre en suspension dans 40 ml 5% de FBS / PBS et répéter centrifugation étape 1.13.
  15. Remettre en suspension dans 4 ml de 5% de FBS / PBS (RT) et la couche soigneusement sur ​​3 ml de milieu de gradient de densité (1,073 g / cm 3) dans un tube de 15 ml 14. Pour obtenir une bonne interphase, il est crucial que la superposition de la suspension cellulaire unique est à un angle> 45 ° à très basse vitesse.
  16. Centrifugeuse 20 min à 900 xg, moyenne (5/10) accélération, aucune décélération, 19 ° C.
  17. Recueillir les cellules présentes dans l'enterphase et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS stérile.
  18. Centrifugeuse pendant 5 min à 500 g, 21 ° C.
  19. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml pré réchauffé milieu complété de culture L-MSC (médias essentiel minimum d'Eagle, la modification alpha (aMEM), additionné de 2 mmol L-glutamine par 500 ml aMEM, 20% vol / vol FBS et 1% en volume / volume de pénicilline / streptomycine / amphotéricine B.
  20. étape de centrifugation Répétez 1.18. Par la suite, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de milieu préchauffé culture frais.
  21. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé et la plaque à une densité élevée, puisque la majorité des cellules à ce stade ne sont pas adhérentes plastique. La densité de placage exacte dépend de l'espèce animale et l'âge, par exemple, les cellules d'un poumon de souris adulte sont ensemencées à 10 5 cellules / cm 2, alors que les cellules de poumon de raton sont suffisamment dense à une densité de semis de 1-2 x 10 4 cellules / cm 2 2.
  22. Culture L-MSC dans une humidifié à 5% O 2, 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° C.
  23. Changer le milieu 24 heures après l'ensemencement initial, et ensuite tous les 3 jours après le rinçage une fois avec PBS. Les cellules doivent être mises en culture jusqu'à confluence de 80 à 90%, ce qui prend en moyenne 3-5 jours en fonction de l'animal d'origine. confluent supérieur va favoriser la différenciation dans les fibroblastes.

2. Sélection des cellules CD146 + Lung mésenchymateuses stromales

  1. Revêtement de billes magnétiques avec anticorps secondaire
    1. Enrober les billes magnétiques avec un anticorps secondaire biotinylé, selon un rapport de 10 pg d'anticorps secondaire / 100 ul de perles magnétiques dans un fond rond stérile 2 ml cryovial dans des conditions stériles. En utilisant un anticorps secondaire de 10 ul par attendues 0,5 x 10 6 cellules, et en utilisant un minimum de 100 ul de billes magnétiques et 10 pg d'anticorps.
      Remarque: Le rapport d'unetibodies utilisés par volume de perles peuvent différer entre les fabricants, s'il vous plaît consulter les instructions du fabricant pour les perles de choix. Pour ce protocole, s'il vous plaît se référer au tableau 1 pour les perles et les anticorps qui ont été utilisés dans l'optimisation de ce protocole.
    2. Incuber dans un mélangeur rotatif d'échantillon pendant 30 minutes à 30 tours / min (rpm) à température ambiante.
    3. Remettre en suspension les billes dans 1,5 ml stérile 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) / PBS et transférer dans un tube de 3 ml ronde inférieure (cytométrie en flux tube). Rincer le tube cryogénique avec un supplément de 1,5 ml 0,1% de BSA / PBS et transférer sur le tube de 3 ml.
    4. Placer le tube sur un aimant approprié et attendre 2 min jusqu'à ce que tous les cordons sont fixés à la paroi arrière du tube et la solution reste limpide. Retirer le ruissellement et répétez lavage avec 3 ml de 0,1% BSA / PBS deux fois.
    5. Remettre en suspension les perles dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS et conserver à 4 ° C, à l'abri de la lumière. Utiliser dans les 5 jours.
  2. Etiquetage CD146 + L-MSC
    1. Récolter les cellules mésenchymateuses après rinçage avec du PBS en utilisant une solution de trypsine non-doux.
      Remarque: Les volumes dépendent de la taille de flacon de culture (0,2 ml / cm 2 ou milieu PBS).
      1. Éliminer le milieu de culture et rincer les cellules trois fois avec du PBS stérile.
      2. Ajouter le volume approprié de solution non-trypsine douce (voir tableau 1). Incuber à 37 ° C dans l'incubateur jusqu'à ce que les cellules sont détachés, soit environ 10 min pour l'utilisation de la solution dans le tableau 1.
      3. Inactiver l'enzyme par addition de milieu de culture L-MSC, et centrifuger pendant 5 min à 500 x g.
    2. Retirer le surnageant, remettre les cellules dans 0,1% de BSA / PBS et on compte les cellules avec un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
      Remarque: Le volume de 0,1% de BSA / PBS dépend de la taille du flacon de culture: viser 5 ou 10 ml de 0,1% de BSA / PBS.
    3. Répétez l'étape 2.2.2 et remettre le montant dédié de cellules dans 3 ml de 0,1% BSA / PBS (blocs de l'ONUsites de liaison spécifiques et maintient les cellules vivantes). Gardez les cellules sur de la glace.
    4. Préparer un 3 ml rondes tube inférieur avec l'anticorps anti-CD146 primaire, et garder sur la glace.
      Remarque: La concentration de l'anticorps primaire, qui est ajouté au montant dédié de cellules dépend de l'anticorps utilisé. Pour un anticorps CD146 anti-rat suggéré voir le tableau 1.
    5. Ajouter le volume total de cellules provenant de l'étape 2.2.3 au tube avec l'anticorps primaire. Fermer hermétiquement et incuber 30 min sur un mélangeur d'échantillon tournant à 15 tours par minute, 4 ° C.
    6. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension culot cellulaire dans 3 ml de 0,1% de BSA / PBS. étape de centrifugeuse répétition.
    7. Remettre en suspension les cellules dans la solution 3 ml contenant des billes recouvertes d'anticorps secondaires qui a été préparé selon les instructions de la section 2.1 et incuber 30 min sur un mélangeur d'échantillon tournant à 15 tours par minute, 4 ° C.
  3. Sélection CD146 + L-MSC
    1. Placer le tube contenant le CD146 + L-MSC marqué sur l'aimant. Les cellules positives seront tirés à l'arrière du tube. Sans bouger le tube ou en touchant les billes, la récolte du surnageant des cellules négatives lentement avec une pipette Pasteur stérile (ceux-ci peuvent être soit recueillis ou rejetées sur la base de la conception expérimentale).
    2. Retirer le tube de l'aimant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml 3% de BSA / PBS. Répétez la procédure de sélection décrite à l'étape 2.3.1. quatre fois (étapes Σ 5 de sélection).
    3. Reprendre le CD146 + L-MSC en milieu préchauffé culture L-MSC et revenir à l'aimant.
    4. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans L-MSC milieu de culture et la plaque dans un flacon de culture de taille appropriée (0,2 ml / cm 2). En règle générale, les cellules de la plaque dans le même flacon de culture de taille à partir de laquelle les cellules ont été soulevés avant le bourrelet sélection. Le nombre de CD146 + L-MSC, et donc la densité de placage, seradépendre de l'âge, espèce et souche de l'animal d'origine. Toujours viser une densité de placage de ~ 5000 cellules / cm 2.
      Remarque: Les perles des perturbations de la croissance cellulaire et disparaîtront progressivement que les cellules prolifèrent.

3. Les cellules de congélation

  1. Utiliser le support gel suivante: une solution de pentastarch à 60% (10% pentastarch à 0,9% de NaCl), 20% de FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% de NaCl (0,9%), 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) 22.
    Remarque: Si tous les ingrédients sont disponibles, une solution contenant 5% de DMSO, 30% de FBS et 65% aMEM est une bonne alternative.
  2. Resuspendre les cellules à 0,5 x 10 6 cellules / ml, l'aliquote en cryotubes de 1 ml chacun et gèlent O / N à -80 ° C en utilisant un récipient de congélation.
  3. Transférer dans un réservoir de stockage de liquide de l'azote, le lendemain.

4. Les cellules de décongélation

  1. Décongeler un flacon de cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min.
  2. Resuspendre les cellules dans 10 mlmilieu de culture préchauffé et centrifuger pendant 5 min à 500 g, 21 ° C.
  3. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de culture. Cellules de semences dans une culture de cellules de bouchon à évent traités flacons à 5.000 cellules / cm 2 à 0,2 ml / media cm2 (par exemple, 15 ml pour 2 flacon de 75 cm).
  4. Culture des cellules dans 5% de O 2, 5% de CO2 jusqu'à ce que 80-90% de confluence pour la récolte et / ou l'utilisation expérimentale. Over-confluence va induire la différenciation. Lorsque les semis, à 5000 cellules / cm 2, L-MSC atteindra 80-90% de confluence dans les 3-4 jours de culture.

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Representative Results

Deux des caractéristiques physiques les plus fiables de MSC, la densité et l'adhésion en plastique, sont utilisés dans la première partie de ce protocole pour obtenir la fraction de cellules mésenchymateuses du poumon qui contient L-MSC. Bien que l'interphase à gradient de densité comprend des monocytes et des macrophages, en plus des cellules mésenchymateuses du poumon, l'adhérence plastique suivie par 3-5 jours de culture garantit que seules les cellules mésenchymateuses du poumon demeurent. En effet, cette population de cellules exprime les classiques marqueurs de surface MSC CD73, CD90 et CD146 et est négatif pour les marqueurs CD34, CD45, complexe majeur d'histocompatibilité type complexe II (MHCII) -RT1B, CD11b et CD79a, indiquant qu'il n'y a plus aucun leucocytes présents dans la population de cellules (figure 2A). Il est intéressant de savoir que le sous-ensemble de CD146 +, une gamme de 44,4 à 65,7% est également CD73 + et CD90 + (données non présentées). De plus, cette population cellulaire est capable d'uneunités formant colonie (CFU) Efficacité qu'au ~ 30% est beaucoup plus élevée que celle généralement rapportée sur le MSC de moelle osseuse ou encore d'autres types de MSC (figure 2B), et différencie le long des trois lignées de MSC classiques (figure 2C).

Figure 2
Figure 2. Les caractéristiques de MSC après la digestion enzymatique, la séparation par gradient de densité et adhérence en matières plastiques. (A) L'expression de marqueurs de surface MSC liées CD146, CD73 et CD90 est présent dans une partie de la population plastique cellulaire adhérente, tandis que les marqueurs de leucocytes négatifs CD11b, CD79a , CD34, CD45 et MHCII-RT1B ont été pratiquement pas exprimés. (B) de formation de colonies dosage unitaire en limitant dosage de dilution (5 cellules / cm 2) a indiqué que ~ 30% de cellules adhérentes en plastique a une capacité de clones, ce qui indique des cellules souches mésenchymateuses. (C) en plastique CE adhérentells étaient capables de production de matrice ostéogénique (rouge), contenait un plus grand nombre de petites vésicules lipidiques (en rouge) lors de l'induction avec le milieu de la différenciation adipocytaire par rapport aux témoins non-différenciées et formé chondrogénique comme des sphères contenant des chondrocytes (rouge). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Toutes les données ont été générées avec le passage 1-3 cellules. NM = marqueurs négatifs; UFC = unités formant des colonies. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cependant, la principale mise en garde est que cette population contient probablement les deux L-MSC et les différents sous-types de fibroblastes de poumon, la L-MSC descendance 23 différenciées. Depuis multipotence est positivement corrélée avec l'expression CD146, et les fibroblastes ne devrait avoir aucune expression de ce marqueur, la sélection positive de la CD146 + sous-population ostensibly donné lieu à une population de cellules qui est fortement enrichie en L-MSC. Ceci est clairement démontré par un pourcentage plus élevé de la population de cellules exprimant des marqueurs de surface MSC associé (figure 3A), une formation de colonies potentiel considérablement plus élevé de ~ 80% (figure 3B) et une réponse de différenciation plus forte en particulier la lignée chondrogène (figure 3C) par rapport à la population mésenchymateuses total obtenu avant la sélection CD146. Il est à noter que ceux-ci sous forme L-MSC que très peu de véritables adipocytes, mais montrent beaucoup plus de cellules en forme de broche qui sont remplis de petites vésicules lipidiques. Celles-ci pourraient refléter la lignée lipofibroblast qui est crucial à la fois pour le développement des poumons et alvéolaires de type II support de cellules. Après sélection CD146, plus adipocytes comme des cellules remplies de grandes vésicules lipidiques peut être observé (figure 3C) par rapport à avant la sélection CD146, mais la majorité des cellules sont toujours les CE lipofibroblasts-likells contenant de petits vésicules lipidiques.

Figure 3
Figure 3. Caractéristiques de MSC après + sélection supplémentaire de billes magnétiques CD146. Après sélection positive de la sous-population CD146 +, ces cellules ont montré une plus grande expression de marqueurs de surface MSC-liés, CD73 en particulier (A), un rendement nettement plus élevé UFC après une seule cellule placage (B), et une réponse de différenciation particulièrement forte pour la lignée chondrogène et dans une moindre mesure dans la lignée adipogène (C). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Toutes les données ont été générées avec passage 3 cellules. NM = marqueurs négatifs; UFC = unités formant des colonies. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'isolement et la culture de la primaire L-MSC présente une occasion de mieux comprendre leur fonction et de leur interaction avec d'autres populations de cellules à un niveau cellulaire, et leur rôle dans le développement des poumons, de la santé et de la maladie. Ceci est particulièrement important que l'absence d'un marqueur unique spécifique de ces cellules, il est presque impossible d'étudier ces cellules in situ. Comme pour toutes les populations de cellules primaires, il faut garder à l'esprit que ces cellules sont plus susceptibles de modifier leur caractère plus ils sont maintenus en culture 19 (revue dans 24). Pour garder L-MSC dans un état ​​qui est aussi proche que possible de leur état ​​naturel, il est très important qu'ils soient cultivées dans 5% O 2, 5% de CO 2, dans un 37 ° C incubateur humidifié. En physiologie respiratoire, il est généralement admis que la base de la loi de Dalton, de pressions partielles, la pression partielle d'oxygène de l'air ambiant (21% de O 2) est de 160 mmHg, et tombe à ~ 101 mmHg dans l'espace aérien alvéolaire 25-27. Dans un poumon maturité la PaO2 gradient alvéolo-artériel est ~ 3-4 mmHg, mais cela peut être augmenté de façon significative dans un poumon malade ou immature où la distance alvéolaire-artériel est augmentée 25,28. A l'intérieur du corps, la niche mésenchymateuses est normalement exposé à une concentration en oxygène de 8.2% 29,30. Seuls quelques articles ont effectivement mesuré la PO 2 dans les poumons, mais une étude a mesuré ce dans les poumons de 20 patients, la recherche d'une plage dans le poumon normale PO 2 de 23 à 656 mmHg, avec une médiane de 42,8 mmHg 27,31. Selon la loi de Dalton, un incubateur humidifié à une température comprise entre 37 ° C et 5% de O 2 a une pO 2 de ~ 36 mm Hg, ce qui se situe tout à fait dans la plage de mesure dans le tissu pulmonaire normal et est très proche de la valeur médiane. En outre, les conditions de culture bas d'oxygène favorisent le maintien de populations de cellules progénitrices dans la culture 29. Pris dans leur ensemble, il iest difficile de dire exactement ce que la concentration en oxygène L-MSC sont exposés à in situ à différents stades au cours du développement ou de la maladie postnatale normale, mais il semble que 5-10% de O 2 est probablement la plus précise du point de vue physiologique 27,31. Sur la base de l'information citée ci-dessus, nous avons choisi de maintenir à 5% O 2 dans nos conditions de culture, et nous avons constaté que lorsque ces conditions sont maintenues in vitro, la L-MSC va croître plus vite, afficher moins de fibres de stress, et ont une probabilité plus petite de différenciation spontanée ou la sénescence. Des facteurs supplémentaires qui empêchent la différenciation spontanées ou d'autres anomalies consiste à utiliser un agent de dissociation non-trypsine doux pour repiquage, repiquage L-MSC lorsqu'ils atteignent 80-90% de confluence (conditions denses vont favoriser la différenciation des fibroblastes), et en gardant le nombre de passages à faible (<P4). Dans une étude réalisée par Hoffmann et ses collègues, la trypsine a été montré pour avoir des effets néfastes sur la fonction L-MSC etphénotype, alors que les agents de dissociation sans trypsine pourrait préserver cette 13.

Pour optimiser le rendement au cours du processus d'isolement, il est important de hacher les poumons aussi finement que possible, tout en gardant à l'esprit que le tissu ne doit pas être autorisé à sécher. Au cours de la digestion enzymatique, il est important que les tubes sont agités souvent sinon au moyen d'un dispositif d'agitation chauffé, comme les morceaux de tissu se sédimenter et ne seront pas obtenir une exposition optimale aux enzymes. Une autre étape cruciale est la séparation par gradient de densité: si la superposition ne se fait très lentement ou à un angle <45 °, cela conduira à un mélange des deux liquides au lieu de stratification, ce qui provoque la perte de la totalité de la population de cellules. Par ailleurs, la densité du milieu de gradient de densité est très dépendante de la température ambiante. Toute autre température de 19 ° C (ou RT), se traduira par séparation par gradient de densité optimale ou pas.

D'intérêt à futilisateurs AVENIR de ce protocole est que nous avons réussi à isoler viable L-MSC à partir de poumons qui ont été récoltés jusqu'à 24 heures avant l'isolement, à condition que les poumons sont directement stockées dans les médias froid L-MSC moment de la récolte, et maintenu à 4 ° C. Cela permet une planification expérimentale plus souple, ou même l'expédition des poumons entre les différents laboratoires. Le rendement est généralement similaire à celle de poumons fraîchement récoltées, et les cellules se développer aussi bien.

Une autre modification qui serait possible, est d'utiliser FACS à la place de la sélection des billes magnétiques, même si cette méthode soumet les cellules à plus de stress que la procédure prend plus de temps et que les cellules sont soumises à des pressions et des vitesses élevées, et recèle le risque de contamination sinon faite dans des conditions stériles. Les billes magnétiques utilisées ici ne pas interférer avec la croissance des cellules, et disparaissent en quelques jours de culture. Une préférence pour FACS ou bille magnétique tri peut aussi dépendre des moyens disponiblespour l'utilisateur final. En outre, il serait possible de modifier ce protocole pour isoler MSC résidents d'autres tissus. Dans ce cas, il serait important d'adapter les enzymes à l'organe d'intérêt, comme la composition de matrice varie entre les organes.

Une limitation importante de l'utilisation que le gradient de densité et l'adhésion ultérieure de plastique pour obtenir des cellules mésenchymateuses, est que la population résultante contient des cellules souches mésenchymateuses en L et les fibroblastes. Sélection pour CD146 + cellules fortement remèdes cette mise en garde, mais en dépit de la CD146 + procédure de sélection et les conditions de culture prudentes, la nature de la L-MSC et les effets de la culture in vitro de cellules dans l'impossibilité d'éviter un certain degré de différenciation dans les fibroblastes. MSC en général ont été rapportés pour contenir une hiérarchie de multipotence, dans lequel les cellules plus bas dans la hiérarchie perdent lentement leur potentiel multilignée jusqu'à ce qu'ils deviennent des fibroblastes différenciés terminale <sup> 23. Selon toute vraisemblance, cela se produit également dans la niche L-MSC 4, et semble se refléter dans le CD146 + cultivées population déjà un passage après la sélection CD146 + environ 40% des cellules ont perdu expression CD146. En outre, dans cette population, il est seulement 80% et 40% CD73 expression de CD90. En partie, cela pourrait être expliquée par la hiérarchie MSC de multipotence. Il serait possible que CD146 + subissent une prolifération asymétrique, donnant naissance à deux cellules souches mésenchymateuses et les cellules CD146 positives, négatives, plus différenciées fille. MSC résidents du poumon pourraient également être raisonnablement attendu d'avoir un phénotype peu différent et la fonction de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, sur laquelle se fonde la définition de CD73 et CD90 expression. La Société internationale de thérapie cellulaire a reconnu que tous les MSC expriment les marqueurs de MSC classiques, y compris CD73 et CD90, et que l'expression des marqueurs de surface est pas la meilleure façon de définir MSC 32. le exceptionally haute efficacité UFC de ~ 70% de la population CD146 + L-MSC supporte. Parce que le CD146 + population de meilleures performances par rapport aux caractéristiques de MSC que la population mésenchymateuses non triés, les auteurs ne sont pas caractérisé en outre le CD146 - population. Nous nous efforçons d'enrichir notre population mésenchymateuses avec MSC et de les épuiser des fibroblastes, mais nous ne prétendons pas que ce soit la seule vraie population L-MSC. L-MSC sont probablement très hétérogène, à la fois à l'origine, le phénotype et la fonction.

Bien que CD146 est largement reconnu comme un marqueur de multipotence dans MSC et péricytes 16,17,33,34, on sait très peu à propos de la population CD146 + MSC in vivo. CD146 est une molécule d'adhésion cellulaire qui est important pour l'angiogenèse et de la fonction des cellules endotheliales, et il est exprimé dans les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les pericytes, cellules souches mésenchymateuses et les T-lymphocytes 15,16,35,36. Dans les années récentes, La preuve est apparu que MSC habitent la niche périvasculaire dans plusieurs organes, comme les cellules CD146 + co-tache pour MSC-marqueurs CD73 et CD105 37. En effet, les péricytes cultivés et MSC ont un très similaire profil d'expression génique 38, le renforcement de la vue que les CSM sont dérivées de péricytes 4,39. Bien que nous ne sommes pas effectué des analyses immunohistochimique pour déterminer l'emplacement de notre population CD146 + L-MSC, il est très probable qu'ils seraient également situés dans un endroit périvasculaire. Les futures études seront nécessaires pour vérifier si tel est effectivement le cas. Il est possible qu'un sous-ensemble de notre population de cellules sont péricytes, mais il convient de souligner que toutes les cellules ressemblent phénotypiquement très similaire après la sélection CD146 +.

cellules stromales mésenchymateuses sont notoirement difficiles à identifier en raison de l'absence d'un marqueur unique qui englobe tout. Diverses études ont rapporté différentes méthodes pour l'isolementde la L-MSC, et ont montré de façon convaincante que ces populations de cellules sont similaires les uns aux autres par rapport au marqueur MSC expression. Sur la base de la caractérisation de la CD146 + L-MSC tel que présenté ici, le CD146 + L-MSC population est très similaire à précédemment rapportés populations L-MSC comme atteints par excroissance ou diverses formes de FACS en utilisant des marqueurs de surface les cellules souches associées telles que Sca -1, ABCG2 et CD90. Par rapport à l'excroissance 13 L-MSC, CD146 + L-MSC semblent avoir une plus grande capacité de donner naissance à des colonies de cellules individuelles, ce qui indique que notre méthode donne une population multipotentes L-MSC plus enrichie. Cet avantage est également vrai par rapport aux méthodes qui isolent L-MSC en fonction de CD90 7 ou α du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRa) 40,41, les deux marqueurs de surface sélectionnent également pour plus lipofibroblasts différenciées et alvéolaires / fibroblastes structurelles et peut donc que raisonnablement be identifié comme cellules stromales 20,42. En revanche, à la fois Sca-1 et ABCG2 sont bien marqueurs qui sont en corrélation avec l'expression stemness et MSC 9,43-46 documentées. ABCG2 + L-MSC ont cependant un caractère plus endothéliale car ils sont 99% positif pour CD31 46, alors que la méthode présentée ici sélectionne contre les cellules endothéliales par l'intermédiaire du gradient de Ficoll et l'adhésion en plastique. Le principal avantage de notre procédé par rapport au protocole d'isolement Sca-1 à base de 5,8 McQualter et ses collègues est qu'il est largement applicable à des espèces autres que la souris, dans lequel Sca-1 ne peut pas être utilisée.

Bien qu'il soit très difficile, probablement quasiment impossible, d'obtenir une population «pure» de la L-MSC d'un développement ou adulte poumon tard et le maintenir dans un état indifférencié, le protocole présenté ici fournit une méthode rapide, cohérente et fiable de l'obtention d'une population de cellules pluripotentes fortement enrichie en res pulmonaires auto-renouvellementMSC ident. En utilisant ce procédé va permettre une étude plus défini le rôle de la L-MSC dans une grande variété de modèles de maladies et de leur rôle dans le développement du poumon.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutral Protease Worthington Biochemical Corporation LS02104 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Collagenase I Worthington Biochemical Corporation LS004196 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 Prepare on day of isolation and store at 4 °C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl) Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland - Use 0.2 ml for rat pups between 20-30 g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose Life Technologies 14287-072 Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) GE Healthcare 17-5446-52 Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45° angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19 °C.
αMEM Sigma-Aldrich M8042 Warm in 37 °C water bath before use
200 mM L-Glutamine Life Technologies 25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062 Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads Life Technologies 11205D Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG Dako, Agilent Technologies E0464 Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express  Life Technologies 12605-028 Gentle non-trypsin alternative, use 1 ml of TrypLE express/25 cm2 surface area. After detachment, 10 ml L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 ml TrypLE
anti-rat CD146 antibody Lifespan Biosciences Inc. C35841 12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution) Bristol-Myers Squibb Canada - Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr. Frosty freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001 Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80 °C

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