Abstract
ויזואליזציה של אירועי איתות דינמיים בתאים חיים כבר אתגר. הרחבנו מערכת ביטוי חולף הוקמה, השלמה פלורסנט biomolecular (BiFC) assay בתאים אפידרמיס טבק, מאינטראקציה בין חלבונים בדיקות ניטור הפריסה המרחבית של הולכת אותות בתאי הצמח. בפרוטוקול זה, השתמשנו assay BiFC להראות כי האינטראקציה ואת האיתות בין יודה ארבידופסיס MAPKKK ו MAPK6 להתרחש קרום הפלזמה. כאשר בזל חלבון פיגום היה שיתוף הביע, האינטראקציה יודה-MAPK מחדש ושיתוף מקוטב מרחבית עם CFP-בזל. מערכת ביטוי טבק מהונדס זה מאפשרת בדיקה מהירה של איתות שינויי לוקליזציה ודינמית (פחות מ -4 ימים) והוא יכול להכיל מספר רב של צבעי חלבון פלואורסצנטי (לפחות שלוש). גם הצגנו שיטות מפורטות לכמת הפצת חלבון (לוקליזציה מרחבית סימטרית, או "קיטוב";) בתאי טבק. יש מערכת ביטוי טבק מתקדמת זו יש פוטנציאל להיות בשימוש נרחב לבדיקה מהירה של אירועי איתות דינמיים בתאי צמח חיים.
Introduction
חלבוני אינטראקציה בתוך מתחמי רשת טופס היררכיים מסובכים כי לשחק תפקיד מרכזי כמעט כל תהליכים ביולוגיים המתרחשים בסביבת הסלולר צפויה. עם זאת, מן התפתחות צמח לתגובות צמיחה, חל חוסר כלים נוחים שיכול לא רק במהירות אלא גם ביעילות לזהות ולנטר איתות אירועים אלה דינמיים ברמת subcellular.
מערכת ביטוי חלבון החולפת באפידרמיס עלה טבק מושכת יתרונות המאפשר הדמית חלבוני ניאון בתאים חיים. מערכת זו מספקת למחצה בתנאי vivo המאפשרים שלאחר translational שינוי חלבון ובדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון. על ידי בחינת אות YFP השלימה את השלמת פלורסנט bimolecular (BiFC) assay מודיע האפשרות של אינטראקציה בין חלבונים בתאי צמח. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל, שמרים ושתיים היברידיים (Y2H) ושיתוף-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC גם מספק אמצעי רב עוצמה של ביטוי חזותי תאים שבו אינטראקציות בין חלבונים עלולה להתרחש ברמה subcellular.
בגלל חלוקת התא סימטרית (ACD) שומרת גזע אוכלוסיית תאים תוך יצירת סוגי תאים חדשים לייצור רקמות / איברים, זה מנגנון הכרחי לקידום רב-תאיות איקריוטיים. פיתוח הפיוניות ארבידופסיס נוצל בעבר כמערכת מודל לחקר ACD בצמחים. התא המבשר, התא האם meristemoid, מהחלק סימטרי לייצר שני לתאי בת אחרים, meristemoid (עובר גזע חטיבות דמויי תאים לפני הסיום לתוך זוג התאים שומרים) ו תא קרקע השושלת הפיוניות (SLGC) (עשוי להתחלק להתמיין תא מדרכה), בהתאמה (איור 1). בשנת הפיוניות ACD, שבירת חלבון הרומן של אסימטריה בשושלת הפיוניות (בזל) מקוטבת premitotically לנהוג סימטריות חלוקות, אשר incאסימטריה גופנית lude ואסימטריה תא גורל 1. אשד MAPK המורכב של תודה MAPKKK ואת MAPKs, MPK3 ו -6 הנו מכשיר מרכזי דפוסי חלוקת הפיוניות ואימוץ גורל 2,3, 4,5.
לאחרונה, ג'אנג et al. קשר בין בזל חלבון קוטביות אל מסלול איתות Yda-MAPK ארבידופסיס הפיוניות 6 ACD. מסלול יודה-MAPK הקנונית, דרך MPK3 / 6, phosphorylates בזל ומפעיל הקיטוב שלו. פונקציות בזל פוספורילציה כמו פיגום ומגייסת יודה (Yda) ו MPK3 / 6 להקים קומפלקס חלבון ולרכז את איתות לעבר התא בקליפת 6. קיטוב של רכיבים MAPK ואת לולאת המשוב החיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK מייצג מנגנון חדשני עבור קיטוב חלבון בתאי הצמח. מקומית איתות MAPK מועשרת שאמורות להיות קשורים קשר הדוק בידול גורל תא ב הפיוניות ACD 6 (איור 1). אחד kנתוני הניסוי EY שתמכו מודל זה בא מן מבחני טבק המצביעים על חלוקה מחדש של המרחב MAPKs המושרה על ידי ביטוי של בזל 6.
באופן כללי, זה לא קל לעקוב אחר המקום שבו איתות MAPK מתרחשת משום מולקולות MAPK ולרוב מצאו מקום בתוך התא. במחקר זה, השתמשנו במערכת מפוצלת YFP לדמיין את האינטראקציה בין קינאז במעלה או במורד הזרם אלה להציע שבו ממסר איתות מתרחשת. בנוסף, אנו הרחבנו את השימוש במערכת BiFC ידי להביע שיתוף חלבון שלישי (CFP-tagged) עם זוג פיצול YFP (המרמז על אינטראקציה בין חלבונים) כדי לחזות האם וכיצד YFP השלים יכול להיות מווסת מרחבית על ידי השיתוף הביע חלבון CFP. בעשותם כך, הראינו כי שיתוף ביטוי של CFP-בזל המושרה מחדש המרחבי של אינטראקציות בין Yda ו MPK6, מן חלוקה שווה דפוסים מקוטב על קליפת התא של טבק epidermתאי al. מערכת זו ולכן יש פוטנציאל להתפתח לניטור אירועים איתות דינמי בתאי הצמח בתנאים כאשר תאים מאותגרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים (כגון שיתוף ביטוי של חלבונים אחרים, יישום כימי, התקפה הפתוגן או שינויים סביבתיים, וכו '. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית פלסמיד
- צור את המבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט כפי שתואר לעיל 1,6.
- ראשית להשתמש DNA פולימרז באיכות גבוהה עם פריימרים מתאימים כדי להגביר את רצפי הקידוד של בזל, Yda ו MPK6 ותת-לשכפל אותם וקטורי כניסה. מצא את הפרוטוקול המפורט ב -7.
- כדי ליצור את גרסאות שלילי דומיננטי של MPK6 ו Yda (DNmpk6 8 ו DNyda 4, בהתאמה), השתמש פלסמידים כניסת MPK6 ו Yda כתבנית ולהציג את מוטציות נקודתיות לפי שיטה מכוונת mutagenesis באתר 9.
- כדי לבנות את המבנים עבור מבחני חולף טבק, לנהל תקן LR (רקומבינציה attL x ATTR) תגובות (נוהל מפורט ב 7) לשלב בזל לתוך pH35CG 10, DNyda ו DNmpk6 לתוך pXNGW ו pXCGW וקטורים 11, בהתאמה.
- אשר את פלסמידים כתוצאה ידי עיכול וסדר אנזים. ברגע זהuccessful, להפוך את המבנים בינארי לתוך Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 12 ולגדל אותם על צלחות הבחירה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים.
2. הכנת פתרון Agrobacterium הסתננות
- לחסן מושבות Agrobacterium כמה שינו טרי לתוך 10 מ"ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני עם טיפול אנטיביוטי מתאים (gentamycin 25 מיקרוגרם / מ"ל, Rifamycin 25 מיקרוגרם / מ"ל, spectinomycin 100 מיקרוגרם / ml עבור pH35CG, pXNGW ו pXCGW בונה; הריכוזים אותו של gentamycin ו Rifamycin עם מיליליטר / מיקרוגרם 50 Kanamycin עבור P19 (לבטא חלבונים נגד השתקה מהונדסת) 13.
- לגדול תרבויות Agrobacterium שייקר C 28 ° במהירות של 200 סל"ד במשך כ -16 שעות ולאחר מכן למדוד את OD 600 (מוערך ל -1.5 - 1.8) (איור 2 א-ב). ספין למטה התרבויות ב 2500 XG במשך 10 דקות. Re- להשעות ו ווהsh את כדורי תא עם 10 מ"מ של 2 MgCl (הפתרון הסתננות).
- ספין למטה התרבויות שוב מחדש להשעות את הכדורים עם כמות מתאימה של הפתרון החדיר להגיע OD הסופי 600 = 0.5 (איור 2 ג-ד). לפני שחדר צמחים, לעזוב את תערובות תא בטמפרטורת החדר למשך 1 - 3 שעות. פעולה זו מסייעת לשמור על הומאוסטזיס תא.
3. צמח טבק ליף הזרקה
- השתמש צמחי טבק (ניקוטיאנה benthamiana), גדלו 4 - 5 שבועות בן בתא גידול צמחים סטנדרטי (23 ° C עם מחזורים של 16 שעות אור / 8 hr-כהה) 14 להזרקה עלה.
הערה: בשלב זה, צמחי טבק בדרך כלל יש 6 עלים (2 גדולים, 2 בינוני, ו -2 קטנים). שני העלים והבינוניים הם האופטימליים ביותר להזרקת עלה (שני הגדולים הם זקנים מדי, בעוד שני הקטנים הם לעתים קרובות מדי צעירים). - לפני יום הסתננות, להשקות את tobacצמחי שיתוף כדי להרוות את האדמה.
- ביום חדירה, טרום דגירה הצמחים בחושך במשך 1 - שעות 3. שלב זה מאפשר הפיוניות באפידרמיס לפתוח נרחב, אשר מאוד מקל על Agrobacterium כאשר חודר לתוך התאים באפידרמיס עלה.
- באמצעות קלטות צבע שכותרתו עם תאריכים, דגל העלים כדי להיות שחדר. סמן את האזורים המיועדים הסתננו עם לנוכל עבה שחור (אופציונלי; האזורים הסתננו גלויים לאחר להידבק.).
- קח כמויות שוות של מחדש ההשעיה Agrobacterium ומערבבים אותם בצלחת 100 x 15 מ"מ פטרי ידי מתערבל עדין (איור 2E). הערה: במקרה שלנו, ערבבנו 1 מ"ל של P19 עם 1 מ"ל של CFP-בזל, 1 מ"ל של DNyda-nYFP ו 1 מ"ל של DNmpk-cYFP.
- בתהליך של חדירה, למלא מזרק מחטים 3 מ"ל עם תערובת חדירת (1 - 2 מ"ל) ולדחוף לתוך הצד התחתון (abaxial) של העלה טבק (איור 2F). בעוד חדירה, זה מועילאחד להשתמש ביד לדחוף מצד שני לתמוך בצד העליון בעדינות (adaxial, מפני הכוח לדחוף).
הערה: לאחר התערובת החדירה מוזרקת בהצלחה, האזורים הנגועים יהפכו קל לזיהוי באפידרמיס. עם זאת, החדירה עלולה להיכשל בשל הזרקה קשה (ניזק לרקמות) או לדחוף מספיק (אין חדירה נוזלית). עבור כל בדיקה, אנו מציעים לפחות שתי זריקות בשני עלים עצמאיים (מצמחים שונים). - מניחים את הצמחים הנגועים בחזרה לתוך תא צמיחה. באופן כללי, ביטויי חלבון ניתנים לזיהוי לאחר החדירה הבאה 48 שעות.
4. הדמיה Confocal
- בשעה 48 חדירת שעות שלאחר, להשתמש מחורר שיחתוך דיסק עלה מאזור מוזרק (בדרך כלל 3 - 4 דיסקים / שטח יכול להיות מיוצר) (איור 2G). להשתמש בפינצטה כדי להעביר את הדיסקים עלה בעדינות לשקופית (הצד abaxial כלפי מעלה) ואת הר אותם עם טיפות מים. הימנע לחיצה מדי הרד על להחליק את המכסה כי סחט / תאים פגומים לא להראות טוב תחת מיקרוסקופ confocal (איור 2H).
- לפני הדמית confocal, לסרוק את הדגימות הרכובות על מיקרוסקופ מתחם עלית ניאון כדי לבדוק את רמות הביטוי. הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, התאים המציגים רמות ביטוי ביניים מיוצגים הטוב ביותר תחת מיקרוסקופ confocal.
- התחל עם עדשת 40X (NA 1.3) על מיקרוסקופ confocal. התאם את השקופית למיקום הרצוי כך תאי מבטאי רמות בינוניות של חלבון פלורסנט להישאר במרכז. ספקטרום עירור / פליטה עבור CFP ו YFP הם 458 ננומטר / 480 - 500 ננומטר ו 514 ננומטר / 520 - 540 ננומטר, בהתאמה.
- לחץ על הכפתור "החי" כדי לצפות בתצוגה מקדימה של תמונות ולאחר מכן להתאים עוצמת ליזר ורווח חכם עבור היחס עוצם / רעש קרינה המאוזן ביותר. כדי לשפר את איכות הדמיה, להגדיל פיקסלים סריקה ו / או מסגרת / קו ממוצע. לבסוף, להתאים את כפתור המיקוד כדי Reach המטוס החציוני מוקדים ולחץ על "לכיד" לקחת את התמונה.
הערה: CFP ותמונות YFP ניתן ללכוד ברצף או בו זמנית על ידי סימון או ביטול האפשרות של מצב סריקה "עוקב", בהתאמה. - כאשר הקרנת Z היא רצויה עבור התצוגה המעמיקה של התאים, בחר במצב הדמיה "xyz", להגדיר את עומק טווח הסריקה (10 - 15 מיקרומטר) ולאסוף את התמונות מהחלק העליון לחלק התחתון של תא המטרה . לקמפל את התמונות המתקבלות עם התוכנה ליקה על ידי לחיצה ימנית על קובץ התמונה כדי לבחור "שינוי שם" ותמונות יצוא כקבצי .tiff.
- תמונה 30 - 40 תאים לניתוח כימות.
עיבוד תמונה 5. וניתוח כימות
- השתמש בתוכנת פיג'י (http://fiji.sc/Fiji) כדי לעבד תמונות ולערוך כימות.
- שרטט את הגרפים עוצמת הקרינה.
- כדי להמחיש טוב יותר אם ביטוי CFP / YFP הואמפוזרים באופן אחיד, להשתמש פיג'י להפגין את עוצמת האות של CFP ו YFP לאורך הפריפריה התא. כדי להשיג זאת, הראשונה להשיק פיג'י ולאחר מכן בחר "קובץ" ו "פתח" כדי להתחיל את התמונה. לחץ על "קו" בתפריט הכלי ובחר "קו מקוטע" על ידי לחיצה ימנית. החלט האזור של עניין ולשרטט קו לאורך בפריפריה התא להתחקות אחר CFP או האות YFP (איור 3A-C).
הערה: פיג'י מודד את ערך עוצמת קרינה המוחלט לאורך הקווים המפולחים. - בחר את התפריט הנפתח "נתח" "פרופיל מגרש" כדי ליצור גרף עם ערכי מיקום ועצמה המייצגים את הרמות של CFP / YFP לאורך הקו המפולח. אם תרצה, לשכפל את ערכי העצמה (על ידי בחירה בתפריט "העתק") לתוך Excel או תוכנה גרפית אחרת כדי ליצור גרפים עוצמים דומים.
- כדי להמחיש טוב יותר אם ביטוי CFP / YFP הואמפוזרים באופן אחיד, להשתמש פיג'י להפגין את עוצמת האות של CFP ו YFP לאורך הפריפריה התא. כדי להשיג זאת, הראשונה להשיק פיג'י ולאחר מכן בחר "קובץ" ו "פתח" כדי להתחיל את התמונה. לחץ על "קו" בתפריט הכלי ובחר "קו מקוטע" על ידי לחיצה ימנית. החלט האזור של עניין ולשרטט קו לאורך בפריפריה התא להתחקות אחר CFP או האות YFP (איור 3A-C).
- לכמת תואר קוטביות.
- אסוף כ 20 represenתאי tative מן 3 ניסויים לשכפל להעריך את מידת הקוטביות של CFP ו YFP בתאי טבק. חשב את מידת הקוטביות מבוססת על היחס בין עוצמת קרינה הגבוהה (מוגדר H) על עוצמת הקרינה הנמוכה (מוגדר L). הערה: שיטת כימות מוסברת באיור 3.
- כדי למדוד את ערכי H ו- L, למתוח קו מקוטע לאורך האזור המעוניין בשולי התא (כמתואר לעיל), לחץ על "נתח" מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר "מדוד". כאשר "תוצאות" חלון צץ, להשתמש "Mean" ערכים לבצע כימות.
- מן התאים המציגים ביטוי אחיד יחסית של CFP ו YFP, למשל, CFP-בזל (איור 3 א) או YFP השלים מתוך שיתוף-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ב) יש לקבל את ערכי H ו- L על ידי מדידת שני אקראי שנבחרו מגזרים היקפיים עם אורך שווה. <li> מן התאים המציגים הצטברות הקוטב ברור של חלבוני ניאון, במקרה זה, את שיתוף ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ג), לאסוף את ערכי H מאזורי הפריפריה עם אותות הקרינה מועשר ואת Ls מהאזורים עם נמוכה / לא הצטברות קרינה.
- פינת היחסים כתוצאה של H / L מ -20 תאים יחד ולבדוק עבור התפלגות נורמלית. חשב את ערכי p על ידי מבחן t של סטודנט (עבור התפלגות נורמלית) או מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (KS) (לחלוקה הלא-נורמלי).
- אסוף כ 20 represenתאי tative מן 3 ניסויים לשכפל להעריך את מידת הקוטביות של CFP ו YFP בתאי טבק. חשב את מידת הקוטביות מבוססת על היחס בין עוצמת קרינה הגבוהה (מוגדר H) על עוצמת הקרינה הנמוכה (מוגדר L). הערה: שיטת כימות מוסברת באיור 3.
- שרטט את הגרפים עוצמת הקרינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי למנוע מוות של תאים המושרה על ידי איתות MAPK היפראקטיבי, הגרסאות פעיל קינאז של Yda (DNyda) ו MPK6 (DNmpk6) ששימשו assay שיתוף ביטוי בתאים טבק. לא האינטראקציה בין DNyda ו DNmpk6 נחשף על ידי BiFC ולא CFP-בזל עצמו שנוצר דפוס הפצה אחידה (איור 3A-B). עם זאת, כאשר CFP-בזל הוכנס זוג אינטראקציה DNyda-DNmpk6, הן CFP אותות YFP היו מחדש כדי באופן מקוטב מאוד (איור 3 ג). חלוקה מחדש הדבר מצביע על כך בזל אינטראקציה עם Yda ו MPK6 כדי מרחבית לארגן מחדש את מסלול איתות MAPK בתאי הצמח. מעמדו זירחון של בזל יש שפעות הפרש על מידת הקוטביות של איתות MAPK: גרסת מחקי phospho של בזל שנוצרה קוטבי מאוד חזק, בעוד גרסת phospho המחסר הראתה פעילות חלשה 6. נתונים אלו תמכו מודל העבודה שלנו של תקנה משוב חיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK ביצירת תאים קוטביים 6.
תרשים איור 1. של קומפלקס הקוטביות בזל-Yda-MPK6 במהלך חלוקת התא אסימטרית הפיוניות (ACD) ארבידופסיס. באפידרמיס עלה, linage הפיוניות יוזם מתאי protodermal, המרחיבים להפוך לתאי מבשר ACD, התאים Meristemoid אמא (MMCs). MMC עובר ACD ליצור Meristemoid אחד ואחד SLGC (תא קרקע השושלת הפיוניות), אשר עשוי לחלק ולבסוף להתמיין לתאי שומר הפיוניות ותאי מדרכה, בהתאמה. בשעת קליפת התא של תאי מבשר ACD (MMCs), בזל מגייס שני מרכיבי מסלול MAPK, את Yda MAPKKK ואת MAPK MPK6, להקים קומפלקס קוטבי ולהסדיר הפיוניות ACD.om / קבצים / ftp_upload / 53,790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תרשים איור 2. לפקודת הפרוצדורה הזרקת בטבק ליף אפידרמיס. (א) להפוך את פלסמידים מחסה CFP-בזל, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP ו P19 לתוך Agrobacterium tumefaciens GV3101 לגדל אותם על צלחות מבחר בהתאמה (מלמעלה למטה ב א). (ב) ירים מושבות מ- (A) לחסן תרבות נוזלית לצמיחת הלילה. (C) קציר תאים על ידי ספינינג למזוג supernatant. לאחר pipetting בקצרה ושטיפת הכדורים, לסובב את התאים שוב. (ד) מחדש להשעות לדלל את כדורי תא עם הפתרון הסתננות (ראה פרוטוקול) כדי להשיג את OD הסופי 600 = 0.5. (E) בעדינות מערבבת הדואר מחדש מושעה תאים בצלחת פטרי. (F) השתמש מזרק מחטים לדחוף את התערובת חדירה בצד abaxial של עלי טבק. (G) כ -48 שעות לאחר חדירה, העלים מוכנים הדמיה confocal. דיסקים עלו בלו מכילים נגועים תאים עם אגרופן חור רחבי האזור החדיר. עיגולים מקווקווים מציינים ניכרים דיסקי חופשה. (H) השתמש במים לעלות על דיסקים עלה לשקופית תקן הדמיה confocal. תרשימי התיבה באזור המוצלל לתאר את החלבונים המוזרקים עליי טבק עבור assay קיטוב. בגדלי חלבון אינם בקנה מידה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. תצוגה וכימות של גיבוש קוטביות. (AC) תמונות Confocal להראות CFP ו בתפרחת YFP בתאי אפידרמיס טבק. ציאן מציין את הביטוי של CFP. צהוב מציין את הביטוי של YFP. (א) התבטאות יתר של CFP-בזל לבד. (ב) Co-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP. הביטוי YFP הוא השלים כאשר שני חלבונים אינטראקציה. (C) Co-ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP. חלוקה לא שווה (קוטביות) ניכרת הן CFP ו YFP. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (AC). (DF) מבחינה גרפית זוממים את עוצמת הקרינה CFP / YFP לאורך קווים מקווקווים (מגנטה) ב (AC). משולש מגנט לסמן את נקודת ההתחלה וסיום של האזורים המשמשים והתוויית אינטנסיבית. Quantifications של מידת הקוטביות בתאי טבק מוצג מתחת. הערכים של עוצמת בתפרחת (H עבור גבוהה L עבור נמוכה) נמדדים שנאספו על ידי פיג'י מאזורי לייחס עם דה אדוםלשפוך שורות (AC). עבור כל דגימה, הערכים מ -20 תאים בממוצע עבור מבחן מובהק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כללי גלישה ו שינויים אפשריים של מערכת הביטוי החולפת טבק התמר אות: התבטאות יתר של חלבון פלואורסצנטי (FP) -tagged חלבונים באפידרמיס הטבק שמש בהצלחה לבדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון subcellular בתאי צמח. עם זאת, לומד הפצת איתות דינמית של מורכבות חלבון planta הוא נושא מאתגר בשל הקשרי subcellular מסובכים, אינטראקציה בין חלבונים חולפים ואירועים הולכים אותות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו נצלנו את מערכת BiFC לבחון אירועי איתות MAPK. על ידי שיתוף להביע Yda-nYFP ו MPK6-cYFP, אות YFP התאושש ציינה כי הפעלת ממסר איתות MAPK עלולה להתרחש בכל קרום הפלזמה.
זה יהיה אידיאלי לשתף-Express fluorescently מתויג Yda ו MPK6 ארבידופסיס ולבחון את האיתות MAPK דינמי in vivo. עם זאת, GEnerating צמחי מהונדס הוא גוזל זמן, במיוחד כאשר אחד או יותר בונה היא רצויה. ביטוי חולף חלבון בתאי טבק יכול להיות מבחן ראשוני ומהיר על מנת לתת הביטוי vivo ב ארבידופסיס או צמחים אחרים. היתרון השני שמערכת הביטוי החולפת הטבק מציעה, אבל לא יכולה בקלות להיות מושגת על ידי יצירת צמחים מהונדסים, הוא כי עד חלבוני היתוך 4 או 5 יכולים להיות שותף הביעו בו זמניים נבדקו על ידי מיקרוסקופיה confocal כאשר השילוב הוא בר השגה.
שימוש בתאי האפידרמיס טבק לחקור איתות MAPK בתאי צמח ניתן ליישם בהמשך מסלולי איתות אחרים ובתנאים סביבתיים שונים. לדוגמה, היה האינטראקציה של Yda-MAPK לשנות עוצמת או מיקומו כאשר התא להביע מטופל עם H 2 O המקומית 2 יישום (גירוי איתות MAPK)? יכולים להיות מתוכננים במהירות ובצעו מבחנים אלו לשם דיון המפרטשאלות ific. חברי מרובים קיימים בכל רובד של קלטות MAPK (3 - 4 שורות בכלל), אבל איך הספציפיות איתות מושגת בצמחים או מערכות אחרות אינו ידוע ברובם. על ידי ביצוע שילובים שונים של MAPKKKs עם MAPKKs, או MAPKKs עם MAPKs, מערכת ביטוי הטבק החולפת מאפשרת ניתוח יחסית בקנה מידה הגדולה של אינטראקציה בין חלבונים רק לא, אלא גם את הארגון המרחבי של זרימת האיתות בתאי צמח.
Co-ביטוי אישית BiFC Assay לחקירות קיטוב חלבון: אחת ארוכת שנים השאלה הבסיסית בביולוגיה של התא היא איך מסלולי איתות אוניברסלי, למשל, MAPKs, להשיג הספציפיות שלהם בשלב התפתחותי מסוים או בתנאים סביבתיים מסוימים. Co-המבטאת את החלבון בזל הקוטבי עם רכיבי BiFC של Yda ו MPK6 בתאי טבק אפשרה לנו להפגין שהאינטראקציה ואיתות Yda-MAPK מחדש ד מרחביתistributed על ידי הנוכחות של בזל, לחלבונים קוטביים ספציפיים במהלך הפיוניות ACD. לכן, את הספציפיות איתות Yda-MAPK יכולה להיות מושגת על ידי אינטראקציה עם בזל לקדם הקוטביות בתא וחילוק סימטרית.
למרות זאת הוא לא תופעה אוניברסלית, לא מעט חלבונים נמצאו שיחולקו באופן לא אחיד בתאי צמח, למשל, 15 ROPs GTPase הקטן, חלבוני PIN אוקסין effluxer 16 והרגולטורים שלהם 17, מובילי בורון 18 וכמה חלבונים לא-מוכרים (OCTOPUS 19 , POLAR 20, ו -21 BRX). פרוטוקול זה לא נועד לחפש השותפים הגנטיים או פיסיים מסלול קיטוב חלבון מסוים, אבל יהיה שימושי סביר לבדוק האם חלבוני האינטראקציה עם ROPs, סיכות או אחרים עלולים להיוצר מתחם קוטבי בתאי צמח. עם זאת, כאשר מנסים לדמות אירוע קיטוב באמצעות תאי טבק, אחד צריך לזכור כי סיבוכיםעלול להתרחש המבחנים. לדוגמא, במקרה קיטוב ארבידופסיס לא ניתן לחזור בדיוק תאי טבק, בפרט כאשר רכיבים נוספים נדרשים ממה ניתן לאכלס assay. מולקולות לא ידועות כמה נגזר רקע הטבק, לא בהכרח החלבונים בבחינה, עשויות להיות מעורבות בזירוז אירוע קיטוב. לכן, זה הכרחי כדי להגדיר ניסויי שליטה קפדנים בטבק וכדי לאמת את הנתונים ארבידופסיס או צמחים אחרים.
גורמי מפתח להצליח ניסויים: ראשית, ירקרקים וצמחי טבק בריאים אמורים לשמש. מאז כימות המנתח צריך למאגר נתונים מתאים שונים, חשוב להשתמש משגשגת צמחי טבק עם תאים בריאים באופן עקבי. שנית, התאים המבטאים רמות החלבון בינוני צריך לשמש הדמיה confocal. רמות ביטוי נמוכות עלולות לא לספק חלבונים מספיק עבור assay ואני ביטוי הרוויevels היה להסוות את אפקט הקיטוב / טרנסלוקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
