Abstract
Visualisering av dynamiske signal hendelser i levende celler har vært en utfordring. Vi utvidet et etablert transient ekspresjonssystem, det biomolekylære fluorescerende komplemente (BiFC) assay i tobakk epidermale celler, fra forsøk protein-protein interaksjon for å overvåke romlig fordeling av signaltransduksjon i planteceller. I denne protokoll har vi brukt BiFC assay for å vise at interaksjonen og signaleringen mellom Arabidopsis MAPKKK YODAs og MAPK6 forekomme på plasmamembranen. Når scaffoldprotein BASL ble co-uttrykk, Yoda-MAPK interaksjon omfordeles og romlig co-polarisert med CFP-BASL. Denne modifiserte tobakk uttrykk system sørger for rask undersøkelse av signale lokalisering og dynamiske endringer (mindre enn 4 dager) og kan huse flere av fluorescerende protein farger (minst tre). Vi presenterte også detaljerte metoder for å kvantifisere protein distribusjon (asymmetrisk romlig lokalisering, eller "polarisering";) I tobakkceller. Denne avanserte tobakk uttrykk systemet har et potensial til å bli brukt mye for rask testing av dynamiske signal hendelser i levende planteceller.
Introduction
Proteiner samhandle innenfor en intrikat hierarkisk nettverk og danner komplekser som spiller en sentral rolle i nesten alle biologiske prosesser som skjer i en uforutsigbar mobilnettet miljø. Men fra anlegget utvikling til vekstresponser, har det vært en mangel på praktiske verktøy som kan ikke bare raskt, men også effektivt identifisere og overvåke disse dynamiske signal hendelser på den subcellulære nivå.
Den forbigående proteinekspresjon system i tobakksblad epidermis har tiltrekkende fordeler for visualisering av fluorescerende proteiner i levende celler. Dette systemet gir semi- in vivo forhold som gjør at post-translasjonell proteinmodifisering og rask undersøkelse av protein lokalisering. Ved å undersøke den suppleres YFP signal informerer bimolecular fluorescerende komplemente (BiFC) assay muligheten for protein-protein interaksjon i planteceller. Sammenlignet med andre metoder, for eksempel, gjær-to hybrid (Y2H) og co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC gir også et kraftig middel til å visualisere avdelinger der protein-protein interaksjoner kan oppstå på subcellulære nivå.
Fordi asymmetrisk celledeling (ACD) opprettholder stamcelle populasjon under generering av nye celletyper for vev / organ formasjonen, er det uunnværlig en mekanisme for å fremme eukaryot multicellularity. Arabidopsis stomatal utvikling har vært brukt som et modellsystem for å studere ACD i planter. Forløperen celle, meristemoid mor celle, skiller asymmetrisk for å fremstille to forskjellige datterceller, en meristemoid (gjennomgår stamcellelignende divisjoner før terminering inn i et par med skjermcellene) og en stomatal avstamning første celle (SLGC) (kan dele seg og differensiere i et fortau celle), henholdsvis (figur 1). I stomatal ACD, er romanen protein Breaking av Asymmetri i stomatal Lineage (BASL) polarisert premitotically å kjøre divisjon asymmetrier, som incLude fysisk asymmetri og celle skjebne asymmetri en. En MAPK kaskade sammensatt av MAPKKK YODA og MAPKs, MPK3 og 6 er sentral for stomatal divisjon mønster og skjebne adopsjon 2,3, 4,5.
Nylig, Zhang et al. knyttet polariteten protein BASL til YDA-MAPK signalveien i Arabidopsis stomatal ACD 6. Den kanoniske YODA-MAPK vei, gjennom MPK3 / 6, phosphorylates BASL og aktiverer sin polarisering. Fosforylerte BASL fungerer som et stillas og rekrutterer YODAs (YDA) og MPK3 / 6 for å danne et proteinkompleks og konsentrer signale på celle cortex 6. Polarisering av MAPK komponenter og den positive feedback loop mellom BASL og YDA-MAPK vei representerer en ny mekanisme for protein polarisering i planteceller. Lokalt beriket MAPK signal er antatt å være nært knyttet til celle skjebne differensiering i stomatal ACD 6 (figur 1). En av de key eksperimentelle data som støtter denne modellen kom fra tobakks analyser som viste den romlige fordeling av MAPK indusert ved ekspresjon av BASL 6.
Generelt er det ikke lett å overvåke hvor MAPK signalering skjer fordi MAPK-molekyler ble ofte funnet overalt inne i en celle. I denne studien, benyttet vi split-YFP system for å visualisere interaksjonen mellom oppstrøms og nedstrøms kinasen de til å foreslå hvor signaler relé inntreffer. Vi ytterligere utvidet bruk av BiFC system ved ko-uttrykker et tredje protein (CFP-merket) med splitten YFP paret (mulighet for protein-protein interaksjon) for å visualisere om og hvordan den suppleres YFP kan bli rommessig modulert av co- uttrykte CFP protein. Ved å gjøre dette, viste vi at samtidig uttrykk for CFP-BASL indusert romlig omorganisering av interaksjoner mellom YDA og MPK6, fra og med distribusjon til polarisert mønster på celle cortex av tobakk epidermal celler. Dette systemet har derfor potensial til å bli utviklet for å overvåke dynamiske signal hendelser i planteceller under forhold når cellene blir utfordret av interne eller eksterne stimuli (f.eks, co-uttrykk av andre proteiner, kjemiske søknad, patogen angripe eller miljømessige endringer, osv. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid Construction
- Generer konstruksjonene ved kloning teknologi som tidligere beskrevet 1,6.
- Først bruker en high fidelity DNA polymerase med egnede primere for å forsterke de kodende sekvenser av BASL, YDA og MPK6 og sub-klone dem inn i inngangs vektorer. Finn detaljert protokoll i 7.
- For å generere de dominerende negative versjoner av (henholdsvis DNmpk6 8 og DNyda 4,) MPK6 og YDA, bruke oppføringen plasmidene MPK6 og YDA som mal og innføre punktmutasjoner ved en seterettet mutagenese metode 9.
- Å bygge konstruksjonene for tobakkforbigående analyser, gjennomføre standard LR (attL x attr rekombinasjon) reaksjoner (detaljert prosedyre i 7) for å integrere BASL inn pH35CG 10, DNyda og DNmpk6 inn pXNGW og pXCGW vektorer 11, henholdsvis.
- Bekreft resulterende plasmider av enzymet fordøyelsen og sekvensering. Når sVellykket, forvandle de binære konstruksjoner inn i Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101 12 og dyrke dem på seleksjonsplater ved 28 ° C i 2 - 3 dager.
2. Utarbeidelse av Agrobacterium Infiltrasjon Solution
- Vaksinere et par ferskt transform Agrobacterium kolonier i 10 ml Luria-Bertani (LB) medium med egnede antibiotika (Gentamycin 25 ug / ml, Rifamycin 25 ug / ml, Spectinomycin 100 ug / ml for pH35CG, pXNGW og pXCGW konstruerer, de samme konsentrasjoner av Gentamycin og Rifamycin med Kanamycin 50 mikrogram / ml for P19 (uttrykke proteiner mot transgen lyddemping) 13.
- Grow Agrobacterium kulturer i en 28 ° C ristemaskin ved en hastighet på 200 rpm i ca 16 timer og deretter måle OD 600 (anslått til å nå 1/5 til 1/8) (Figur 2A-B). Spinn ned kulturer på 2500 xg i 10 min. Re-suspendere og wash cellepelletene med 10 mM MgCl2 (infiltrasjonsløsning).
- Spinne ned kulturene igjen, og gjensuspendere de pellets med egnet mengde av infiltrasjonsløsning for å nå den endelige OD 600 = 0,5 (figur 2C-D). Før infiltrering planter, forlater cellen blandinger ved værelsestemperatur i 1 - 3 timer. Dette trinnet hjelper til å holde celle homeostase.
3. tobakksplanten og Leaf Injection
- Bruk tobakksplanter (Nicotiana benthamiana), dyrket 4-5 uker gamle i en standard plantevekstkammer (23 ° C med sykluser av 16 timer lys / 8 timers mørke) 14 for blad injeksjon.
Merk: På dette stadiet, tobakksplanter vanligvis har 6 blader (2 store, 2 medium og 2 små). De to mellomstore bladene er den mest optimale for blad injeksjon (de to litt større er for gammel, mens de to små er ofte for ung). - Før infiltrasjon dag, vanne tobacco planter å mette jorden.
- På den infiltrasjon dag, pre-inkuberes plantene i mørket i 1 - 3 timer. I dette trinnet kan stomata i epidermis for å åpne vidt, noe som i stor grad forenkler Agrobacterium da trenge inn i blad epidermale celler.
- Ved hjelp av fargebånd merket med dato, flagg bladene å bli infiltrert. Marker de områdene som skal infiltreres med en svart tykk sharpie (valgfritt, de infiltrert områdene er synlig etter å ha blitt smittet.).
- Ta like volumer av Agrobacterium re-suspensjon og bland dem i en 100 x 15 mm petriskål med forsiktige virvelbevegelser (figur 2E). Merk: I vårt tilfelle, blandet vi en ml av p19 med 1 ml CFP-BASL, 1 ml DNyda-nYFP og 1 ml DNmpk-cYFP.
- I prosessen med infiltrasjon, fylle en 3 ml nålløs sprøyte med infiltrasjonen blanding (1 - 2 ml) og presse inn mot undersiden (abaxial) av tobakkblad (figur 2F). Mens infiltrere, er det nyttigå bruke en hånd til å skyve og den annen side for å understøtte forsiktig oversiden (adaxial, mot skyvekraften).
Merk: Når infiltrasjon blandingen er vellykket injiseres, vil den infiserte områder blir lett gjenkjennelig i overhuden. Imidlertid kan infiltrasjon mislykkes på grunn av tøffe injeksjon (vevsskade) eller utilstrekkelig push (ingen væske penetrasjon). For hver test, foreslår vi minst to injeksjoner i to uavhengige blader (fra forskjellige planter). - Plasser den infiserte plantene tilbake i vekstkammeret. Vanligvis protein uttrykk kan påvises etter 48 timer etter infiltrasjon.
4. Confocal Imaging
- På 48 timer etter infiltrasjon, bruk en hullemaskin for å skjære et blad disk fra det injiserte området (normalt 3 - 4 disker / området kan bli produsert) (figur 2G). Bruk pinsett for å forsiktig overføre blad disker til et lysbilde (abaxial side oppover) og montere dem med vanndråper. Unngå å trykke altfor Hard på dekkglass fordi presset / skadede celler ikke vil vise godt under det konfokale mikroskop (figur 2 H).
- Før confocal bildebehandling, skanne montert prøvene på en epi-fluorescerende forbindelse mikroskop for å se uttrykket nivåer. Merk: Basert på våre erfaringer, blir cellene som viser mellom uttrykk nivåer best representert under konfokal mikroskop.
- Start med 40X (NA 1.3) objektiv på et konfokal mikroskop. Juster glide til ønsket posisjon slik at cellene uttrykker middels nivåer av fluoriserende protein forbli i sentrum. De eksitasjon / utslipp spektrum for CFP og YFP er 458 nm / 480-500 nm og 514 nm / 520-540 nm, henholdsvis.
- Aktiver «Live" -knappen for å forhåndsvise bildene deretter justere laser intensitet og smart gevinst for den mest balanserte fluorescens intensitet / støyforhold. For å forbedre bildekvaliteten, øke skanning piksler og / eller ramme / linje gjennomsnittet. Til slutt, justere fokusvelgeren til reach median fokusplan, og klikk "Capture" for å ta bildet.
Merk: CFP og YFP bilder kan tas sekvensielt eller samtidig ved å merke av eller på muligheten til å "sekvensiell" skannemodus, henholdsvis. - Når Z-projeksjon er ønskelig for den detaljerte visningen av cellene, velg "xyz" bildemodus, definerer dybden på skanneområdet (10-15 mm) og samle bilder fra toppen til bunnen av målcellen . Kompilere innhentet bilder med Leica-programvaren ved å høyreklikke på bildefilen for å velge "endre navn" og eksportere bilder som TIFF-filer.
- Bilde 30 - 40 celler for kvantifisering analyse.
5. Bildebehandling og Kvantifisering Analysis
- Bruk Fiji programvare (http://fiji.sc/Fiji) til å behandle bilder og gjennomføre kvantifisering.
- Plott fluorescensintensiteten grafer.
- For bedre å visualisere om CFP / YFP uttrykk erjevnt fordelt, bruk Fiji for å demonstrere signalstyrken av CFP og YFP langs cellens omkrets. For å oppnå dette, må du først starte Fiji deretter velge "Fil" og "Åpne" for å starte bilde. Klikk "linje" på verktøymenyen og velg "segmentert line" ved å høyreklikke. Bestem regionen av interesse og trekke en linje langs cellen periferien å spore CFP eller YFP signal (figur 3A-C).
Merk: Fiji måler den absolutte fluorescens intensitet verdi langs segmentert linjer. - Velg rullegardinmenyen "Analyze" og "Plot profil" for å generere en graf med posisjon og intensitetsverdier som representerer nivåene av CFP / YFP langs segmenterte linjen. Dersom det er ønskelig, duplisere intensitetsverdiene (ved å velge menyen "Copy") inn i Excel eller annen grafisk programvare for å generere sammenlign intensitet grafer.
- For bedre å visualisere om CFP / YFP uttrykk erjevnt fordelt, bruk Fiji for å demonstrere signalstyrken av CFP og YFP langs cellens omkrets. For å oppnå dette, må du først starte Fiji deretter velge "Fil" og "Åpne" for å starte bilde. Klikk "linje" på verktøymenyen og velg "segmentert line" ved å høyreklikke. Bestem regionen av interesse og trekke en linje langs cellen periferien å spore CFP eller YFP signal (figur 3A-C).
- Kvantifisere polaritet grad.
- Samle ca 20 representertav- speiler celler fra 3 replikere eksperimenter for å evaluere polariteten grad av CFP og YFP i tobakkceller. Beregn polaritet grad basert på forholdet mellom høy fluorescensintensitet (definert som H) over lav fluorescensintensitet (definert som L). Merk: Kvantifiseringen Fremgangsmåten er forklart i figur 3.
- For å måle H og L verdier, tegne en segmentert linje langs interessert regionen på cellen periferien (beskrevet ovenfor), klikker du på "Analyze" fra rullegardinmenyen, og velg deretter "Mål". Når en "Resultater" vinduet dukker opp, bruk "Mean" verdier til å utføre kvantifisering.
- Fra cellene viser relativt ensartet uttrykk for CFP og YFP, f.eks, CFP-BASL (figur 3A) eller YFP suppleres fra co-uttrykk for DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP (figur 3B), få til H og L-verdier ved å måle to tilfeldig valgte periferiske segmenter med lik lengde. <li> Fra cellene stiller opplagt polar opphopning av fluorescerende proteiner, i dette tilfellet, co-uttrykk for CFP-BASL, DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP (figur 3C), samle H verdiene fra de perifere regioner med beriket fluorescens signaler og Ls fra regionene med lav / ingen fluorescens akkumulering.
- Pool de resulterende prosenter av H / L fra 20 celler sammen og test for normalfordeling. Beregn p-verdiene av studentens t-test (for normalfordeling) eller Kolmogorov-Smirnov (KS) test (for ikke-normalfordeling).
- Samle ca 20 representertav- speiler celler fra 3 replikere eksperimenter for å evaluere polariteten grad av CFP og YFP i tobakkceller. Beregn polaritet grad basert på forholdet mellom høy fluorescensintensitet (definert som H) over lav fluorescensintensitet (definert som L). Merk: Kvantifiseringen Fremgangsmåten er forklart i figur 3.
- Plott fluorescensintensiteten grafer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å forhindre celledød indusert av den hyperaktive MAPK-signalering, ble kinase inaktive versjoner av YDA (DNyda) og MPK6 (DNmpk6) som benyttes i koekspresjon analyse i tobakkcellene. Verken samspillet mellom DNyda og DNmpk6 avslørt av BiFC eller CFP-BASL selv generert ujevn fordeling mønster (figur 3A-B). Når imidlertid CFP-BASL ble innført i DNyda-DNmpk6 interaksjon paret, ble både CFP og YFP signaler videreformidles til en sterkt polarisert måte (figur 3C). Denne omfordelingen tyder på at BASL samhandler med YDA og MPK6 til romlig re-organisere MAPK signalveien i planteceller. Fosforyleringen status for BASL har differensial virkninger på polariteten graden av MAPK signal: en fosfor-ligne versjon av BASL generert veldig sterk polaritet, mens en fosfor-mangelfull versjon viste svakere aktivitet 6. Disse dataene støttet vår arbeidsmodell av en positive tilbakemeldinger regulering mellom BASL og YDA-MAPK vei i å generere celle polaritet 6.
Figur 1. Skisse av BASL-YDA-MPK6 polaritet Complex Under stomatal Asymmetric Celledeling (ACD) i Arabidopsis. I bladet epidermis, initierer stomatal linage fra protodermal celler, som utvides til å bli ACD precursor celler, de Meristemoid Mor Cells (MMCs). En MMC undergår en ACD for å skape en Meristemoid og en SLGC (stomatal avstamning første celle), som kan dele seg og eventuelt differensiere til stomatal vakt celler og fortau-celler, respektivt. Ved celle cortex av ACD forløpercellene (MMCer), BASL rekrutterer to komponentene i en MAPK-reaksjonsveien, den MAPKKK YDA og MAPK MPK6, for å danne et kompleks polaritet og regulere stomatal ACD.om / filer / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skisse av injeksjonsprosedyren i Tobacco Leaf huden. (A) Transform plasmidene husing CFP-BASL, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP og P19 i Agrobacterium tumefaciens GV3101 og dyrke dem på respektive valg plater (fra topp til bunn i EN). (B) Plukk opp kolonier fra (A) for å vaksinere flytende kultur for overnatting vekst. (C) Høst celler ved spinning og dekanter supernatanten. Etter en kort stund pipettering og vaske pellets, spinn ned cellene igjen. (D) Re-suspendere og fortynne cellepelletene med infiltrasjonsløsning (se protokollen) for å oppnå den endelige OD 600 = 0,5. (E) blandes forsiktig the re-suspenderes cellene i en petriskål. (F) Bruk en nålløs sprøyte for å presse infiltrasjon blandingen i abaxial siden av tobakksblader. (G) Om 48 timer etter infiltrasjon, bladene er klar for confocal bildebehandling. Vesenet blad disker som inneholder infiserte celler med en hullemaskin rundt infiltrasjon regionen. Stiplede sirkler indikerer skåret permisjon disker. (H) Bruk vann for å montere bladet diskene på en standard lysbilde for confocal bildebehandling. Boksen diagrammer i det skraverte området beskrive proteiner injisert i tobakksblader for polarisering analysen. Protein størrelser er ikke i målestokk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Skjerm og Kvantifisering av polaritet formasjonen. (AC) Confocal bilder for å vise CFP og YFP florescence i tobakk epidermal cellene. Cyan indikerer ekspresjon av CFP. Gul indikerer ekspresjon av YFP. (A) Overuttrykte CFP-BASL alene. (B) Samtidig uttrykk for DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP. YFP uttrykk kompletteres når to proteiner samhandle. (C) Co-uttrykk for CFP-BASL, DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP. Ujevn fordeling (polaritet) er tydelig for både CFP og YFP. Målestokk = 50 mikrometer i (AC). (DF) Grafisk plotte CFP / YFP fluorescens intensitet langs de stiplede linjene (Magenta) i (AC). Magenta trekanter markere starten og endepunktet av regionene som brukes for intensitet plotting. Kvantifiseringen av polariteten grad i tobakkcellene er presentert under. Verdiene av florescence intensitet (H for høy og L for lav) måles og oppsamlet ved Fiji fra regionene spores med rød dafelle linjer i (AC). For hver prøve, er verdiene fra 20 celler i gjennomsnitt for signifikans test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generell bruk og mulige endringer i tobakks Transient Expression System for signaltransduksjon: Overuttrykte fluorescerende protein (FP) -tagged proteiner i tobakk epidermis har blitt brukt for rask undersøkelse av protein subcellulære lokalisering i planteceller. Men å studere dynamisk signaldistribusjon av proteinkompleks i planta er en utfordrende tema på grunn av kompliserte subcellulære sammenhenger, forbigående protein-protein interaksjon og signaltransduksjon hendelser. For å møte denne utfordringen, vi tok fordel av BiFC system for å undersøke MAPK signal hendelser. Ved ko-uttrykke YDA-nYFP og MPK6-cYFP, det gjenvunnede YFP signal indikerte at aktiveringen av MAPK signale releet kan forekomme på plasmamembranen.
Det ville være ideelt å co-express fluorescens-merket YDA og MPK6 i Arabidopsis og å undersøke den dynamiske MAPK signal in vivo. Men generating transgene planter som er tidskrevende, særlig når mer enn én konstruksjoner er ønsket. Protein forbigående ekspresjon i tobakkcellene kan være en rask innledende test for in vivo-ekspresjon i Arabidopsis eller andre planter. Den andre fordelen at tobakks transient ekspresjon systemet tilbyr, men kan ikke lett oppnås ved å generere transgene planter, er det opp til 4 eller 5 fusjonsproteiner kan være co-uttrykt samtidig og undersøkt ved konfokalmikroskopi når kombinasjonen er oppnåelig.
Ved hjelp av tobakk epidermal cellene til å undersøke MAPK signal i planteceller kan videre gjennomføres til andre signalveier og under ulike miljøforhold. For eksempel vil interaksjonen av YDA-MAPK endre sin intensitet eller sted når den uttrykkende celle behandles med lokal H 2 O 2 program (en MAPK signale stimulus)? Slike analyser kan raskt konstruert og utført for å løse specIFIC spørsmål. Flere medlemmer eksisterer i hver tier av MAPK kassetter (3 - 4 forskjellige lag generelt), men hvordan signaliserer spesifisitet er oppnådd i planter eller andre systemer fortsatt i stor grad ukjent. Ved å gjøre forskjellige kombinasjoner av MAPKKKs med MAPKKs, eller MAPKKs med MAPK, gjør det mulig for tobakk transient ekspresjon system en forholdsvis stor-skala-analyse av ikke bare protein-protein interaksjon, men også den romlige organiseringen av signalstrømmen i planteceller.
Tilpasset Co-uttrykk og BiFC analyse for Undersøkelse av Protein Polarisering: En langvarig grunnleggende spørsmål i cellebiologi er hvordan universelle signalveier, f.eks MAPKs, oppnå deres spesifisitet på visse utviklingsstadiet eller under spesielle miljøforhold. Co-uttrykker polaritet protein BASL med BiFC komponentene i YDA og MPK6 i tobakkceller har tillatt oss å vise at YDA-MAPK samhandling og signalering romlig re-distributed av tilstedeværelsen av BASL, en bestemt polaritet proteiner under stomatal ACD. Derfor kan YDA-MAPK signale spesifisitet oppnås ved samvirke med BASL for å fremme celle polaritet og asymmetrisk fordeling.
Selv om det ikke er et universelt fenomen, har ganske mange proteiner blitt funnet å være ujevnt fordelt i planteceller, for eksempel små GTPase ROPS 15, auxin effluxer PIN proteiner 16 og deres regulatorer 17, bor transportører 18 og noen ukjente proteiner (blekksprut 19 , POLAR 20, og BRX 21). Denne protokollen var ikke ment for å søke de genetiske eller fysiske partnere i et bestemt protein polarisering vei, men vil sannsynligvis være nyttig for å teste om samspill proteiner med ROPS, PIN-koder eller andre kan danne en polaritet kompleks i planteceller. Men når jeg prøver å simulere en polarisering hendelse ved hjelp tobakkceller, bør man huske på at komplikasjonerkan forekomme i assayene. For eksempel kan Arabidopsis polarisering hendelsen ikke rekapitulert i tobakkceller, spesielt når flere komponenter er nødvendig enn det som kan bli innkvartert i analysen. Noen ukjente molekyler avledet fra tobakken bakgrunn, ikke nødvendigvis proteinene som undersøkes, kan være involvert i indusering av en polarisasjon hendelse. Derfor er det viktig å sette opp strenge kontrollforsøk i tobakk, og for å validere dataene i Arabidopsis eller andre planter.
Viktige elementer for å lykkes i forsøkene: For det første bør brukes grønnaktig og sunn tobakksplanter. Siden kvantifisering analyserer trenger å samle data fra ulike celler, er det avgjørende å bruke blomstrende tobakksplanter med gjennomgående friske celler. For det andre bør de celler som uttrykker mellomproteinnivåer benyttes for konfokal avbildning. Lave nivåer kan ikke gi nok proteiner for analysen og mettet uttrykk levels ville maskere polarisering / trans effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
