Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
Visualisierung von dynamischen Signalereignisse in lebenden Zellen war eine Herausforderung. Wir erweiterten einen etablierten transienten Expressionssystem, wobei das biomolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Test in Tabak Epidermiszellen von Test Protein-Protein-Wechselwirkung, um die Überwachung der räumlichen Verteilung der Signaltransduktion in Pflanzenzellen. In diesem Protokoll verwendeten wir den BiFC Assay zeigen , dass die Wechselwirkung und die Signalisierung zwischen dem Arabidopsis MAPKKK YODA und MAPK6 an der Plasmamembran auftreten. Wenn das Gerüstprotein BASL wurde co-exprimiert, neu verteilt die YODA-MAPK-Interaktion und räumlich kopolarisierte mit GFP-BASL. Dieses modifizierte Tabakexpressionssystem ermöglicht eine schnelle Prüfung von Signal Lokalisierung und dynamischen Veränderungen (weniger als 4 Tage) und kann mehrere von fluoreszierenden Protein Farben (mindestens drei) aufzunehmen. Wir stellten auch detaillierte Methoden Proteinverteilung (asymmetrische räumliche Lokalisierung oder "Polarisierung" zu quantifizieren;) In Tabakzellen. Diese fortschrittliche Tabak-Expressionssystem hat ein Potenzial weit für einen schnellen Test der dynamischen Signalereignisse in lebenden Pflanzenzellen verwendet werden.
Introduction
Proteine interagieren innerhalb eines verwickelten hierarchischen Netzwerk und bilden Komplexe, die eine zentrale Rolle in nahezu allen biologischen Prozessen in einer unvorhersehbaren zellulären Umgebung auftreten. Doch von der Entwicklung von Pflanzen Wachstumsreaktionen, hat es einen Mangel an praktischen Tools gewesen, die nicht nur schnell, sondern auch effizient zu identifizieren und diese dynamischen Signalereignisse auf subzellulärer Ebene überwachen.
Die transiente Protein-Expressionssystem in Tabak Blattepidermis aufweist ansprechende Vorteile zur Visualisierung fluoreszierende Proteine in lebenden Zellen. Dieses System bietet halb- in – vivo – Bedingungen , die post-translationalen Lokalisierung Proteinmodifikation und schnelle Untersuchung von Protein ermöglichen. Durch die Untersuchung informiert den ergänzt YFP-Signal, die bimolekulare fluoreszierendes Komplementation (BiFC) -Assay die Möglichkeit von Protein-Protein-Wechselwirkung in Pflanzenzellen. Im Vergleich zu anderen Methoden, beispielsweise Hefe-Zwei – Hybrid (Y2H) und co-immunoprecipitation (Co-IP), BIFC stellt auch ein mächtiges Mittel von Fächern zu visualisieren, wo Protein-Protein-Interaktionen auf subzellulärer Ebene auftreten können.
Weil asymmetrische Zellteilung (ACD) Stammzellenpopulation beibehält , während neue Zelltypen für Gewebe- / Organbildung zu erzeugen, ist es ein unverzichtbarer Mechanismus für eukaryotische Vielzelligkeit fördern. Arabidopsis stomatal Entwicklung als Modellsystem verwendet wurde , für die Untersuchung ACD in Pflanzen. Die Vorläuferzelle, meristemoid Mutterzelle teilt sich asymmetrisch zwei verschiedene Tochterzellen zu erzeugen, eine meristemoid (erfährt zellähnliche Divisionen stammen, bevor sie in ein Paar von Schließzellen beendet) und einer Stomata Linie Grundzelle (SLGC) (dividieren kann und differenzieren sich in eine Fahrbahn Zelle), bzw. (Abbildung 1). In Stomata ACD wird das neue Protein Breaking of Asymmetry in der Stomata Lineage (BASL) polarisiert premitotically Division Asymmetrien zu fahren, die include physische Asymmetrie und Zellschicksal Asymmetrie 1. Eine MAPK Kaskade , bestehend aus dem MAPKKK YODA und den MAPK, MPK3 und 6 ist von zentraler Bedeutung für die Stomata Division Strukturierung und Schicksal Annahme 2,3, 4,5.
Vor kurzem Zhang et al. die Polarität Protein BASL zur YDA-MAPK – Signalweg in Arabidopsis Stomata ACD 6 verbunden. Die kanonische YODA-MAPK-Weg, durch MPK3 / 6, phosphoryliert BASL und aktiviert seine Polarisation. Phosphoryliert BASL Funktionen als Gerüst und rekrutiert YODA (YDA) und MPK3 / 6 einen Proteinkomplex zu bilden , und die Signalisierung an der Zell cortex 6 konzentrieren. Polarisierung der MAPK-Komponenten und die positive Rückkopplungsschleife zwischen BASL und dem YDA-MAPK-Weg stellt einen neuen Mechanismus für die Protein Polarisierung in Pflanzenzellen. Vor Ort angereicherte MAPK – Signalisierung wird vermutet , eng mit Zellschicksal Differenzierung in Stomata ACD 6 (Abbildung 1) zu werden. Einer der key experimentellen Daten , die dieses Modell unterstützt kamen aus den Tabak Assays , die die räumliche Umverteilung von MAPKs durch die Expression von BASL 6 induziert demonstriert.
Im allgemeinen ist es nicht leicht zu überwachen, wo MAPK Signalisierung tritt auf, weil MAPK Moleküle oft überall innerhalb einer Zelle gefunden wurden. In dieser Studie verwendeten wir die Split-YFP System die Wechselwirkung zwischen der stromaufwärts-Kinase und den stromabwärtigen visualisieren vorzuschlagen, wo die Melderelais auftritt. Wir verlängert weiter die Verwendung des BiFC System durch Co-Exprimieren eines dritten Protein (CFP-tagged) mit dem geteilten YFP Paar (suggestiv von Protein-Protein-Wechselwirkung) sichtbar zu machen, ob und wie die ergänzt YFP räumlich durch die co- moduliert werden könnten ausgedrückt GFP-Protein. Auf diese Weise haben wir gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von GFP-BASL induzierte räumliche Reorganisation von Wechselwirkungen zwischen YDA und MPK6, aus gleichmäßige Verteilung zu polarisierte Strukturierung an der Zellrinde des Tabak epidermal Zellen. Dieses System hat daher das Potential , zur Überwachung dynamischer Signalereignisse in Pflanzenzellen unter Bedingungen entwickelt werden , wenn die Zellen durch die internen oder externen Stimuli (zB Co-Expression von anderen Proteinen, chemischen Anwendung Pathogenbefall oder Umgebungsänderungen herausgefordert werden, etc. ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Allgemeine Verwendung und mögliche Modifikationen des Transient Expression System Tabak für die Signalübertragung: Eine Überexpression von Fluoreszenzprotein (FP) -markierte Proteine in den Tabak Epidermis wurde für die schnelle Untersuchung von Protein subzelluläre Lokalisierung in Pflanzenzellen erfolgreich eingesetzt. Jedoch ist das Studium dynamischer Signalverteilung der Proteinkomplex in planta ein herausforderndes Thema aufgrund der komplizierten subzellulär…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
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