Abstract
Visualisering af dynamiske signaleringsbegivenheder i levende celler har været en udfordring. Vi udvidede en etableret transient ekspressionssystem, den biomolekylære fluorescerende komplementering (BiFC) assay i tobak epidermale celler, fra testning protein-protein-interaktion til overvågning rumlige fordeling af signaltransduktion i planteceller. I denne protokol, brugte vi BiFC analysen at vise, at interaktion og signalering mellem Arabidopsis MAPKKK YODA og MAPK6 forekomme på plasmamembranen. Når stilladset protein BASL blev co-udtrykt, at YODA-MAPK interaktion omfordeles og rumligt co-polariseret med FFP-BASL. Denne modificerede tobak ekspressionssystem giver mulighed for hurtig undersøgelse af signalering lokaliserings- og dynamiske ændringer (mindre end 4 dage) og kan rumme flere af fluorescerende protein farver (mindst tre). Vi præsenterede også detaljerede metoder til at kvantificere protein fordeling (asymmetrisk rumlig lokalisering, eller "polarisering";) I tobaksceller. Dette avancerede tobak ekspressionssystem har et potentiale til at blive brugt bredt til hurtig prøvning af dynamiske signaleringsbegivenheder i levende planteceller.
Introduction
Proteiner interagere i en indviklet hierarkiske netværk og danner komplekser, der spiller en central rolle i næsten alle biologiske processer, der forekommer i et uforudsigeligt cellulære miljø. Men fra plante udvikling til vækst reaktioner, der har været en mangel på praktiske værktøjer, der kan ikke kun hurtigt, men også effektivt identificere og overvåge disse dynamiske signalering begivenheder på det subcellulære niveau.
Den forbigående protein ekspressionssystem i tobaksbladskiver epidermis har tiltalende fordele til at visualisere fluorescerende proteiner i levende celler. Dette system giver halv- in vivo betingelser, der muliggør posttranslationel proteinmodifikation og hurtig undersøgelse af protein lokalisering. Ved at undersøge suppleret YFP signal, den bimolekylære fluorescerende komplementering (BiFC) assay informerer muligheden for protein-protein-interaktion i planteceller. Sammenlignet med andre metoder, f.eks gær-to-hybrid (Y2H) og co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC giver også et effektivt middel til at visualisere rum, hvor protein-protein interaktioner kan forekomme på det subcellulære niveau.
Fordi asymmetriske celledeling (ACD) opretholder stamcellepopulation samtidig skaber nye celletyper for væv / organ formation, er det en uundværlig mekanisme til fremme eukaryot multicellularity. Arabidopsis stomatal udvikling er blevet anvendt som et modelsystem til undersøgelse ACD i planter. Forstadiecellen, meristemoid mor celle, deler asymmetrisk til frembringelse af to forskellige datterceller, en meristemoid (undergår stamcelle-lignende divisioner før afslutning i et par beskyttelsesceller) og en stomatal afstamning jorden celle (SLGC) (kan dele sig og differentiere til et fortov celle), henholdsvis (figur 1). I stomatal ACD, er det nye protein Breaking af Asymmetri i stomatal Lineage (BASL) polariseret premitotically at køre division asymmetrier, som incLude fysiske asymmetri og celle skæbne asymmetri 1. En MAPK kaskade bestående af MAPKKK YODA og MAPK'er, MPK3 og 6 er centrale for stomatal division mønstret og skæbne vedtagelse 2,3, 4,5.
For nylig, Zhang et al. knyttet polariteten protein BASL til YDA-MAPK signalvejen i Arabidopsis stomatal ACD 6. Den kanoniske YODA-MAPK-vejen, gennem MPK3 / 6, phosphorylerer BASL og aktiverer dens polarisering. Phosphorylerede BASL fungerer som et stillads og rekrutterer YODA (YDA) og MPK3 / 6 for at danne et proteinkompleks og koncentrere signaleringen på cellen cortex 6. Polarisering af MAPK komponenter og den positive feedback loop mellem BASL og YDA-MAPK pathway repræsenterer en ny mekanisme for protein polarisering i planteceller. Lokalt beriget MAPK signalering antages at være tæt knyttet til celle skæbne differentiering i stomatal ACD 6 (figur 1). En af key eksperimentelle data, der støttede denne model kom fra tobak analyser, som demonstrerede den rumlige omfordeling af MAPK'er induceret af ekspression af BASL 6.
Generelt er det ikke let at overvåge, hvor MAPK signalering opstår, fordi MAPK molekyler ofte blev fundet overalt inde i en celle. I denne undersøgelse benyttede vi split-YFP system til at visualisere interaktionen mellem opstrømskinase og nedstrøms dem til at foreslå, hvor signaleringen relæet forekommer. Vi yderligere udvidet brug af BiFC systemet ved co-udtrykkende et tredje protein (CFP-mærkede) med split YFP par (tyder på protein-protein-interaktion) at visualisere, hvorvidt og hvordan suppleret YFP kunne rumligt moduleret af samtidig udtrykte CFP protein. Ved at gøre dette, viste vi, at co-ekspression af FFP-BASL induceret rumlig reorganisering af interaktioner mellem YDA og MPK6, fra jævn fordeling til polariseret mønster på cellens cortex af tobak epidermisal celler. Dette system har derfor mulighed for at blive udviklet til overvågning dynamiske signalering begivenheder i planteceller under betingelser, når cellerne bliver udfordret af de interne eller eksterne stimuli (f.eks co-ekspression af andre proteiner, kemiske ansøgning, patogen angreb eller miljømæssige forandringer, osv. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid Construction
- Generere konstruktionerne ved kloning teknologi som tidligere beskrevet 1,6.
- Brug først en high fidelity DNA-polymerase med passende primere til amplifikation de kodende sekvenser af BASL, YDA og MPK6 og sub-klone dem ind entry vektorer. Find den detaljerede protokol i 7.
- For at generere de dominerende negative versioner af MPK6 og YDA (DNmpk6 8 og DNyda 4, henholdsvis), bruge indrejse plasmider af MPK6 og YDA som skabelon og indføre de punktmutationer ved et site-directed mutagenese metode 9.
- At opbygge konstruktionerne for tobaksvarer forbigående analyser, udføre standard LR (attL x attR rekombination) reaktioner (detaljeret procedure i 7) at integrere BASL i pH35CG 10, DNyda og DNmpk6 ind pXNGW og pXCGW vektorer 11, hhv.
- Bekræft de resulterende plasmider ved enzymfordøjelse og sekventering. Når successful, omdanne de binære konstruktioner ind i Agrobacterium tumefaciens-stamme GV3101 12 og dyrke dem på selektionsplader ved 28 ° C i 2 - 3 dage.
2. Fremstilling af Agrobacterium Infiltration Solution
- Pode et par frisk transformerede Agrobacterium-kolonier i 10 ml Luria-Bertani (LB) medium med passende antibiotika (Gentamycin 25 ug / ml, rifamycin 25 ug / ml, Spectinomycin 100 ug / ml for pH35CG, pXNGW og pXCGW konstruerer, de samme koncentrationer gentamycin og rifamycin med kanamycin 50 pg / ml for P19 (ekspression af proteiner mod transgene silencing) 13.
- Grow Agrobacterium kulturer i et 28 ° C rysteapparat ved en hastighed på 200 rpm i ca. 16 timer og derefter måle OD600 (anslået være på 1,5 - 1,8) (figur 2A-B). Spin ned kulturerne ved 2.500 xg i 10 min. Re-suspendere og wash cellepellets med 10 mM MgCl2 (infiltration opløsning).
- Spin ned kulturerne igen og re-suspendere pellets med passende mængde af infiltration løsning til at nå den endelige OD600 = 0,5 (Figur 2C-D). Før infiltrerende planter, forlade cellen blandinger ved stuetemperatur til 1 - 3 timer. Dette trin hjælper med til at opretholde cellehomeostase.
3. Tobak Plant og Leaf Injection
- Brug tobaksplanter (Nicotiana benthamiana), dyrket 4. - 5. uger gamle i en standard plantevækst kammer (23 ° C med cyklusser af 16 timer lys / 8 timers mørke) 14 for blad injektion.
Bemærk: På dette tidspunkt, tobaksplanter typisk har 6 blade (2 store, 2 mellemstore og 2 små). De to mellemstore blade er den mest optimale for blad injektion (de to store dem er for gamle, mens de to små er ofte for ung). - Før infiltration dag, vande tobacco planter til at mætte jorden.
- På infiltration dag, præinkuberes planterne i mørke til 1 - 3 timer. Dette trin tillader stomata i epidermis at åbne bredt, hvilket i høj grad letter Agrobacterium når trænge ind i blad epidermale celler.
- Brug farve bånd mærket med datoer, flag bladene skal infiltreret. Marker de områder, der skal infiltreret med en sort tyk Sharpie (valgfri, da infiltrerede områder er synlige efter at være blevet smittet.).
- Tag lige store mængder af Agrobacterium resuspension og bland dem i en 100 x 15 mm petriskål ved forsigtig hvirvlende (Figur 2E). Bemærk: I vores tilfælde, vi blandede 1 ml p19 med 1 ml FFP-BASL, 1 ml DNyda-nYFP og 1 ml DNmpk-cYFP.
- I processen med infiltration, fylde en 3 ml injektionssprøjte uden nål med infiltration blanding (1 - 2 ml), og skub ind undersiden (abaxial) af tobaksbladet (figur 2F). Mens infiltrere, er det nyttigtat bruge den ene hånd til at skubbe og den anden hånd til forsigtigt at støtte den øvre side (adaxial, mod skubbekraften).
Bemærk: Når infiltration blandingen med succes injiceres, vil de inficerede områder bliver let genkendelig i overhuden. Dog kan infiltrationen mislykkes på grund af barske injektion (vævsskade) eller utilstrækkelig skub (ingen væske penetration). For hver test, foreslår vi mindst to injektioner i to uafhængige blade (fra forskellige planter). - Placer de inficerede planter tilbage ind i kammeret vækst. Generelt protein udtryk er påviselige efter 48 timer efter infiltration.
4. Konfokal Imaging
- På 48 timer efter infiltration, bruge et hul puncher at udskære et blad disk fra det injicerede område (normalt 3 - 4 diske / område kan produceres) (figur 2G). Brug en pincet til forsigtigt at overføre bladskiverne til et dias (den abaxial side opad) og montere dem med vanddråber. Undgå at trykke for hasd på dækglasset fordi presset / beskadigede celler vil ikke vise godt under det konfokale mikroskop (fig 2H).
- Før konfokal billeddannelse, scanne monterede prøver på en epi-fluorescerende forbindelse mikroskop for at kontrollere ekspressionsniveauerne. Bemærk: Baseret på vores erfaringer, er de celler, der udviser mellemliggende ekspressionsniveauer bedst repræsenteret under konfokalmikroskop.
- Start med den 40X (NA 1.3) objektiv på et konfokalt mikroskop. Juster dias til den ønskede position, således at de celler, der udtrykker mellemstore niveauer af fluorescerende protein forbliver i centrum. De excitation / emission spektre for den fælles fiskeripolitik og YFP er 458 nm / 480 - 500 nm og 514 nm / 520-540 nm.
- Aktiver "Live" -knappen for at få vist billederne derefter justere laser intensitet og smart gevinst for den mest afbalancerede fluorescensintensitet / støjforhold. For at forbedre billedkvalitet, øge scanning pixels og / eller ramme / line gennemsnit. Endelig justere fokus knop til reach medianen brændplanet og klik på "Capture" for at tage billedet.
Bemærk: Den fælles fiskeripolitik og YFP billeder kan sekventielt eller samtidigt fanget ved at kontrollere eller deaktivere indstillingen af "sekventiel" scanningstilstand hhv. - Når der ønskes Z-fremskrivning for den dybtgående visning af cellerne, skal du vælge "xyz" billedtilstand, definere dybden af scanning område (10 - 15 um) og indsamle billederne fra toppen til bunden af målcellen . Sammensæt de opnåede billeder med Leica-softwaren ved at højreklikke på billedfilen for at vælge "omdøbe" og eksport billeder som .tiff filer.
- Billede 30 - 40 celler til kvantificering analyse.
5. Billedbehandling og Kvantificering Analysis
- Brug Fiji software (http://fiji.sc/Fiji) til at behandle billeder og gennemføre kvantificering.
- Plot fluorescensintensitet grafer.
- For bedre at visualisere, om den fælles fiskeripolitik / YFP udtryk erjævnt fordelt, bruge Fiji for at demonstrere signalstyrken af den fælles fiskeripolitik og YFP langs cellens periferi. For at opnå dette, først starte Fiji derefter vælge "File" og "Open" billedet. Klik på "line" på menuen værktøjet og vælg "Segmenteret line" ved at højreklikke. Beslut området af interesse og trække en linje langs cellens periferi at spore den fælles fiskeripolitik eller YFP signal (figur 3A-C).
Bemærk: Fiji måler den absolutte fluorescensintensitet værdi langs de segmenterede linjer. - Vælg drop-down menuen "Analyser" og "Plot profil" for at generere en graf med positions- og intensitetsværdier der repræsenterer niveauet af den fælles fiskeripolitik / YFP langs segmenterede linie. Hvis det ønskes, duplikere værdierne intensitet (ved at vælge menuen "Copy") ind i Excel eller anden grafisk software til at generere sammenlignelige grafer intensitet.
- For bedre at visualisere, om den fælles fiskeripolitik / YFP udtryk erjævnt fordelt, bruge Fiji for at demonstrere signalstyrken af den fælles fiskeripolitik og YFP langs cellens periferi. For at opnå dette, først starte Fiji derefter vælge "File" og "Open" billedet. Klik på "line" på menuen værktøjet og vælg "Segmenteret line" ved at højreklikke. Beslut området af interesse og trække en linje langs cellens periferi at spore den fælles fiskeripolitik eller YFP signal (figur 3A-C).
- Kvantificer polaritet grad.
- Saml ca 20 reprætative celler fra 3 replikat forsøg for at vurdere polariteten graden af den fælles fiskeripolitik og YFP i tobak celler. Beregn polariteten grad baseret på forholdet af den høje fluorescensintensitet (defineret som H) over lav fluorescensintensitet (defineret som L). Bemærk: Kvantificeringen fremgangsmåde er forklaret i figur 3.
- For at måle H og L-værdier, tegne en segmenteret linje langs den interesserede region på cellens periferi (beskrevet ovenfor), klik på "Analyze" fra drop-down menuen, og vælg derefter "Measure". Når en "Results" vindue popper op, skal du bruge "Mean" værdier til at udføre kvantificering.
- Fra celler, som viser relativt ensartet udtryk for den fælles fiskeripolitik og YFP, f.eks CFP-BASL (figur 3A) eller YFP suppleret fra co-ekspression af DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP (figur 3B), opnå H og L-værdier ved at måle to tilfældigt udvalgte perifere segmenter med samme længde. <li> fra cellerne udviser indlysende polar ophobning af fluorescerende proteiner, i dette tilfælde, at co-ekspression af FFP-BASL, DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP (figur 3C), indsamle H værdier fra randområderne med berigede fluorescens signaler og Ls fra regioner med lav / ingen fluorescens akkumulation.
- Pool de resulterende forhold mellem H / L fra 20 celler sammen og test for normalfordeling. Beregn p-værdier ved Students t-test (til normal fordeling) eller Kolmogorov-Smirnov (KS) test (for ikke-normal fordeling).
- Saml ca 20 reprætative celler fra 3 replikat forsøg for at vurdere polariteten graden af den fælles fiskeripolitik og YFP i tobak celler. Beregn polariteten grad baseret på forholdet af den høje fluorescensintensitet (defineret som H) over lav fluorescensintensitet (defineret som L). Bemærk: Kvantificeringen fremgangsmåde er forklaret i figur 3.
- Plot fluorescensintensitet grafer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At forhindre celledød induceret af den hyperaktive MAPK signalering blev kinase inaktive versioner af YDA (DNyda) og MPK6 (DNmpk6) anvendt i co-ekspression assay tobaksceller. Hverken interaktionen mellem DNyda og DNmpk6 afsløret af BiFC eller FFP-BASL selv genereret ujævn fordeling mønster (figur 3A-B). Men når CFP-BASL blev indført i DNyda-DNmpk6 interaktion par, blev begge fælles fiskeripolitik og YFP signaler omfordeles til en yderst polariseret måde (figur 3C). Denne omfordeling tyder på, at BASL interagerer med YDA og MPK6 til rumligt omorganisere MAPK signalvejen i planteceller. Phosphoryleringsstatussen af BASL har forskellige konsekvenser af polariteten graden af MAPK signalering: en phospho-efterlignende version af BASL genereret meget stærk polaritet, mens en phospho-deficient udgave udviste svagere aktivitet 6. Disse data støttede vores arbejdsmodel af en positiv feedback regulering mellem BASL og YDA-MAPK-vejen i at generere celle polaritet 6.
Figur 1. Diagram over BASL-YDA-MPK6 polaritet Complex Under stomatal Asymmetrisk celledeling (ACD) i Arabidopsis. I bladet epidermis, det stomatal linage initierer fra protodermal celler, der udvider til at blive ACD præcursorceller, de Meristemoid Mor Cells (MMC). En MMC undergår en ACD at oprette en Meristemoid og én SLGC (stomatal afstamning jorden celle), som kan dele sig og til sidst differentiere til stomatale guard celler og fortovet celler. På cellen cortex af ACD precursorceller (MMC-kort), BASL rekrutterer to komponenter af et MAPK-vejen, den MAPKKK YDA og MAPK MPK6, til dannelse af et polaritet kompleks og regulere stomatal ACD.about / filer / ftp_upload / 53.790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Diagram over Injection Procedure i Tobacco Leaf Epidermis. (A) Transformer de plasmider, huser CFP-BASL, DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP og P19 i Agrobacterium tumefaciens GV3101 og dyrke dem på respektive udvalg plader (fra top til bund i EN). (B) Saml kolonier fra (A) til inokulering flydende kultur for vækst natten over. (C) Harvest celler ved spinde- og dekanter supernatanten. Efter kortvarigt pipettering og vask af pellets, spin ned cellerne igen. (D) Re-suspendere og fortynde cellepellets med infiltration opløsning (se protokollen) for at opnå den endelige OD600 = 0,5. (E) Bland forsigtigt the resuspenderet celler i en petriskål. (F) Brug en injektionssprøjte uden nål til at skubbe infiltration blandingen i abaxial side af tobaksbladene. (G) omkring 48 timer efter infiltration, bladene er klar til konfokal billeddannelse. Excise blad diske indeholder inficerede celler med et hul Puncher omkring infiltration region. Stiplede cirkler indikerer fjernet orlov diske. (H) Brug vand til at montere bladskiverne på en standard slide for konfokal billeddannelse. Boksens diagrammerne i det skraverede område beskrive proteinerne indsprøjtes i tobaksblade for polarisering assay. Protein størrelser er ikke i skala. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Display og Kvantificering af polaritet Formation. (AC) Konfokal billeder at vise fælles fiskeripolitik og YFP fluorescens i tobak epidermale celler. Cyan angiver udtryk for den fælles fiskeripolitik. Gul angiver udtryk for YFP. (A) Overekspression af FFP-BASL alene. (B) Co-ekspressionen af DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP. YFP ekspression suppleres, når to proteiner interagerer. (C) Co-ekspressionen af FFP-BASL, DNyda-nYFP og DNmpk6-cYFP. Ujævn fordeling (polaritet) er tydeligt for både den fælles fiskeripolitik og YFP. Scale bar = 50 um i (AC). (DF) Grafisk afbildning FFP / YFP fluorescensintensitet langs de punkterede linjer (magenta) i (AC). Magenta trekanter markerer start og slut punkt i de regioner, der bruges til intensitet plotte. Kvantificering af polariteten grad i tobak-celler præsenteres nedenunder. Værdierne for fluorescens intensitet (H for høj og L for lav), måles og indsamlet af Fiji fra regionerne spores med rød dakaste linjer i (AC). For hver prøve er værdierne fra 20 celler gennemsnit for signifikans test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generel brug og mulige ændringer af tobak Transient Expression System for signaltransduktion: Overekspression af fluorescerende protein (FP) -mærket proteiner i tobak epidermis er blevet anvendt til hurtig undersøgelse af protein subcellulære lokalisering i planteceller. Men studerer dynamisk signalering fordeling af protein kompleks in planta er en udfordrende emne på grund af komplicerede subcellulære sammenhænge, forbigående protein-protein-interaktion og signaltransduktionshændelser. For at løse denne udfordring, tog vi fordel af BiFC systemet til at undersøge MAPK signalering begivenheder. Ved co-udtrykkende YDA-nYFP og MPK6-cYFP oplyste genvundne YFP signal om, at aktivering af MAPK signalering relæ kan forekomme ved plasmamembranen.
Det ville være ideelt at co-udtrykkelig fluorescens mærkede YDA og MPK6 i Arabidopsis og undersøge den dynamiske MAPK signalering in vivo. Men generating transgene planter er tidskrævende, især når der ønskes mere end en konstruktioner. Protein transient ekspression i tobak-celler kan være en hurtig indledende test til in vivo ekspression i Arabidopsis eller andre planter. Den anden fordel, at tobakken forbigående ekspression system tilbyder, men kan ikke let opnås ved at generere transgene planter, er, at op til 4 eller 5 fusionsproteiner kan co- udtrykkes samtidigt og undersøgt ved konfokal mikroskopi, når kombinationen er opnåeligt.
Brug tobak epidermale celler til at undersøge MAPK signalering i planteceller kan yderligere implementeres til andre signalveje og under forskellige miljøforhold. For eksempel vil interaktionen af YDA-MAPK ændre sin intensitet eller placering, når den udtrykkende celle behandles med lokal H 2 O 2 ansøgning (a MAPK signalering stimulus)? Sådanne assays kan hurtigt konstrueret og udført for at løse specSp ec ifik spørgsmål. Flere medlemmer eksisterer i hvert lag af MAPK kassetter (3 - 4 tiers generelt), men hvordan signalering specificitet opnås i planter eller andre systemer stort set ukendt. Ved at gøre forskellige kombinationer af MAPKKKs med MAPKKs eller MAPKKs med MAPK'er, tobakken transient ekspressionssystem tillader en relativt stor skala analyse af ikke kun protein-protein-interaktion, men også den rumlige organisation af signal- flow i planteceller.
Customized Co-udtryk og BiFC Assay for Undersøgelse af protein Polarisering: Et mangeårigt grundlæggende spørgsmål i cellebiologi er, hvordan universelle signalveje, fx MAPK'er, nå deres specificitet på bestemte udviklingstrin eller under særlige miljøforhold. Co-udtrykker polaritet protein BASL med BiFC komponenter i YDA og MPK6 i tobak celler har givet os til at vise, at YDA-MAPK interaktion og signalering rumligt er re-distributed ved tilstedeværelsen af BASL, særlig polaritet proteiner under stomatal ACD. Derfor kan YDA-MAPK signalering specificitet opnås ved interaktion med BASL at fremme cellepolaritet og asymmetrisk deling.
Selv om det ikke er et universelt fænomen, er der fundet en hel del proteiner skal ujævnt fordelt i planteceller, fx lille GTPase ROPs 15, auxin effluxer PIN proteiner 16 og deres regulatorer 17, bor transportører 18 og nogle ukendte proteiner (Octopus 19 , POLAR 20, og BRX 21). Denne protokol blev ikke beregnet til at søge de genetiske eller fysiske partnere i et bestemt protein polarisering vej, men vil sandsynligvis være nyttigt for at teste, om de interagerende proteiner med ROPS, stifter eller andre kan danne en polaritet kompleks i planteceller. Men når de forsøger at simulere en polarisering begivenhed ved hjælp af tobak celler, bør man huske på, at komplikationerkan forekomme i assayene. For eksempel kan Arabidopsis polarisering begivenhed ikke blive gentaget tobaksceller, især når flere komponenter er nødvendige, end hvad der kan rummes i assayet. Nogle ukendte molekyler afledt fra tobakken baggrund, ikke nødvendigvis proteinerne, der undersøges, kan være involveret i induktion af en polarisering begivenhed. Derfor er det vigtigt at etablere strenge kontrol eksperimenter i tobak og at validere data i Arabidopsis eller andre planter.
Vigtige elementer til at lykkes i de Forsøg: For det første bør anvendes grønlige og sunde tobaksplanter. Da kvantificering analyser nødt til at samle data fra forskellige celler, er det afgørende at bruge blomstrende tobaksplanter med konsekvent raske celler. For det andet bør de celler, der udtrykker medium proteinniveauer anvendes til konfokal billeddannelse. Lave ekspressionsniveauer kan ikke give tilstrækkelige proteiner til assayet og mættet ekspression levels ville maskere polarisering / translokation effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
