Abstract
Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d'expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l'interaction protéine-protéine d'essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l'interaction et la signalisation entre l'Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d'échafaudage a été co-exprimé, l'interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d'expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d'expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.
Introduction
Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d'outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire.
Le système d'expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluorescentes dans les cellules vivantes. Ce système fournit des semi - conditions in vivo qui permettent la modification des protéines post-traductionnelle et un examen rapide de la localisation des protéines. En examinant le signal complémenté YFP, le dosage de complémentation bimoléculaire fluorescente (BiFC) indique la possibilité d'une interaction protéine-protéine dans les cellules végétales. Par rapport à d' autres méthodes, par exemple, la levure deux hybrides (Y2H) et co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fournit également un puissant moyen de visualiser les compartiments où les interactions protéine-protéine peuvent se produire au niveau subcellulaire.
Parce que la division cellulaire asymétrique (ACD) maintient la tige population de cellules tout en générant de nouveaux types de cellules pour la formation de tissu / organe, il est un mécanisme indispensable pour la promotion de la multicellularité eucaryote. Le développement d' Arabidopsis stomatique a été utilisé comme un système modèle pour l' étude ACD dans les plantes. La cellule précurseur, cellule mère meristemoid, divise asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, un meristemoid (subit souches divisions cellulaires comme avant de se terminer dans une paire de cellules de garde) et une cellule de terre de la lignée stomatique (SLGC) (peut se diviser et se différencier en une cellule de revêtement), respectivement (figure 1). En stomatique ACD, le roman rupture des protéines de Asymétrie dans le Lineage stomatique (de BASL) est polarisé premitotically pour conduire asymétries de la division, qui incasymétrie physique lude et le destin des cellules d'asymétrie 1. Une cascade MAPK composé du MAPKKK YODA et les MAPK, MPK3 et 6 est central pour la division des stomates motifs et sort adoption 2,3, 4,5.
Récemment, Zhang et al. lié à la protéine de polarité BASL à la voie de signalisation MAPK YDA-Arabidopsis stomatique ACD 6. La voie YODA-MAPK canonique, par MPK3 / 6, phosphoryle BASL et active sa polarisation. Fonctions BASL phosphorylés comme un échafaudage et recrute YODA (YDA) et MPK3 / 6 pour former un complexe de protéines et de concentrer la signalisation au niveau du cortex cellulaire 6. Polarisation des composantes de MAPK et de la boucle de rétroaction positive entre BASL et la voie MAPK-YDA représente un nouveau mécanisme pour la protéine de polarisation dans les cellules végétales. Signalisation MAPK localement enrichi est supposé être étroitement liée à la différenciation du destin cellulaire dans stomatique ACD 6 (Figure 1). Un des key données expérimentales qui ont soutenu ce modèle provenaient des essais de tabac qui ont démontré la redistribution spatiale des MAPK induite par l'expression de BASL 6.
D'une manière générale, il est facile de surveiller la signalisation MAPK où se produit parce que les molécules de MAPK ont souvent été trouvés partout à l'intérieur d'une cellule. Dans cette étude, nous avons utilisé le système split-YFP pour visualiser l'interaction entre la kinase en amont et en aval les suggérer où le relais de signalisation se produit. Nous avons également étendu l'utilisation du système BiFC par co-exprimant une troisième protéine (CFP-tagged) avec la paire YFP fendue (suggestive d'interaction protéine-protéine) pour visualiser si et comment le YFP complété pourrait être modulée spatialement par la coopération protéine exprimée PCP. Ce faisant, nous avons démontré que la co-expression de la PCP-BASL induite réorganisation spatiale des interactions entre YDA et MPK6, de même la distribution à la structuration polarisée au niveau du cortex cellulaire de l'épiderme du tabaccellules al. Ce système a donc le potentiel d'être développé pour la surveillance des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales dans des conditions où les cellules sont contestées par les stimuli internes ou externes (par exemple, co-expression d'autres protéines, l' application chimique, pathogène attaque ou changements environnementaux, etc. ).
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Protocol
1. Construction du plasmide
- Générer les constructions par la technologie du clonage comme décrit précédemment 1,6.
- Tout d'abord utiliser un ADN polymérase haute fidélité avec des amorces appropriées pour amplifier les séquences codantes de BASL, YDA et MPK6 et sous-clone dans les vecteurs d'entrée. Trouver le protocole détaillé dans 7.
- Pour générer les versions négatives dominantes de MPK6 et YDA (DNmpk6 8 et DNyda 4, respectivement), utiliser les plasmides de MPK6 et YDA entrée en tant que modèle et introduire les mutations ponctuelles par une méthode 9 mutagenèse dirigée.
- Pour construire les constructions pour les essais de tabac transitoires, effectuer LR standard (attL x attR de recombinaison) Réactions (procédure détaillée dans 7) pour intégrer BASL dans pH35CG 10, DNyda et DNmpk6 en pXNGW et pXCGW vecteurs 11, respectivement.
- Confirmez les plasmides résultants par la digestion enzymatique et séquençage. Une fois successful, transformer les constructions binaires dans la souche d' Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 et les cultiver sur des plaques de sélection à 28 ° C pendant 2 - 3 jours.
2. Préparation de la solution d' Agrobacterium Infiltration
- Inoculer quelques colonies d'Agrobacterium fraîchement transformées dans 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés (gentamicine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml de spectinomycine à 100 pg / ml pour pH35CG, pXNGW et pXCGW construit, les mêmes concentrations de la gentamycine et de la kanamycine rifamycine avec 50 pg / ml pour la p19 (exprimant des protéines contre silençage transgénique) 13.
- Cultivez cultures d'Agrobacterium dans un shaker C 28 ° à la vitesse de 200 tours par minute pendant environ 16 heures, puis de mesurer la DO 600 (estimé pour atteindre 1,5 à 1,8) (Figure 2A-B). Isoler les cultures à 2500 xg pendant 10 min. Re-suspendre et wash les culots cellulaires avec 10 mM de MgCl 2 (la solution d'infiltration).
- Isoler les cultures à nouveau et remettre en suspension les pastilles avec quantité appropriée de la solution d'infiltration pour atteindre la DO finale 600 = 0,5 (figure 2C-D). Avant l'infiltration de plantes, de laisser les mélanges de cellules à la température ambiante pendant 1-3 heures. Cette étape permet de maintenir l'homéostasie cellulaire.
3. Plante du tabac et des feuilles Injection
- Utiliser des plants de tabac (Nicotiana benthamiana), cultivés 4-5 semaines d'âge dans une chambre de croissance des plantes standard (23 ° C avec des cycles de / 8 h-16 h dark-light) 14 pour l' injection de la feuille.
Remarque: A ce stade, les plants de tabac ont généralement 6 feuilles (2 grandes, 2 moyennes et 2 petites). Les deux feuilles moyennes sont les plus optimales pour l'injection de feuilles (les deux grands sont trop vieux, alors que les deux petits sont souvent trop jeunes). - Avant le jour de l'infiltration, l'eau de la Tobacplantes co pour saturer le sol.
- Le jour d'infiltration, pré-incuber les plantes dans l'obscurité pendant 1-3 heures. Cette étape permet stomates dans l'épiderme pour ouvrir largement, ce qui facilite grandement l'Agrobacterium en pénétrant dans les cellules des feuilles épidermiques.
- Utilisation de bandes de couleurs marquées avec des dates, drapeau des feuilles à infiltrer. Marquer les zones à infiltrées avec un sharpie noir épais (en option, les zones infiltrées sont visibles après avoir été infecté.).
- Prenez des volumes égaux de l'Agrobacterium remise en suspension et les mélanger dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm par douce tourbillonnant (Figure 2F). Note: Dans notre cas, nous avons mélangé 1 ml de p19 avec 1 ml de CFP-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP et 1 ml de DNmpk-cYFP.
- Dans le processus d'infiltration, remplir un 3 ml seringue sans aiguille avec le mélange d'infiltration (1 - 2 ml) et pousser sur le côté inférieur (abaxiale) de la feuille de tabac (figure 2F). Alors que l'infiltration, il est utileà utiliser une main pour pousser et d'autre part pour appuyer doucement sur le côté supérieur (adaxial, contre la force de poussée).
Note: Une fois que le mélange d'infiltration est injecté avec succès, les zones infectées seront facilement reconnaissables dans l'épiderme. Cependant, l'infiltration peut échouer en raison de l'injection dure (de dommages aux tissus) ou insuffisante push (pas de pénétration de liquide). Pour chaque test, nous suggérons au moins deux injections dans deux feuilles indépendantes (à partir de différentes plantes). - Placer les plantes infectées de nouveau dans la chambre de croissance. En règle générale, les expressions de protéines sont détectables après 48 h infiltration suivante.
4. imagerie confocale
- A 48 heures après l' infiltration, utiliser une perforatrice pour exciser un disque de feuille de la zone injectée (normalement 3 - 4 disques / zone peuvent être produites) (figure 2G). Utilisez des pinces pour transférer doucement les disques de feuilles à une diapositive (le côté abaxiale vers le haut) et les monter avec des gouttes d'eau. Évitez d'appuyer trop hard sur le feuillet de couverture , car les cellules comprimées / endommagées ne montrera pas bien sous le microscope confocal (Figure 2H).
- Avant l'imagerie confocale, analyser les échantillons montés sur un composé microscope epi-fluorescence pour vérifier les niveaux d'expression. Remarque: D'après notre expérience, les cellules qui présentent un niveau d'expression intermédiaires sont mieux représentés sous le microscope confocal.
- Commencez avec le 40X (NA 1.3) lentille sur un microscope confocal. Ajuster le coulisseau à la position désirée de sorte que les cellules exprimant des niveaux moyens de protéines fluorescentes restent au centre. Les spectres d'excitation / émission de CFP et YFP sont 458 nm / 480-500 nm et 514 nm / 520-540 nm, respectivement.
- Activez le bouton "Live" pour prévisualiser les images puis réglez l'intensité du laser et le gain à puce pour le rapport intensité de fluorescence / bruit le plus équilibré. Pour améliorer la qualité d'image, augmenter les pixels de balayage et / ou moyenne trame / ligne. Enfin, réglez le bouton de mise au point reach le plan focal médian et cliquez sur "Capture" pour prendre l'image.
Note: La PCP et les images YFP peuvent être capturées successivement ou simultanément en cochant ou désactiver l'option de mode de balayage "séquentiel", respectivement. - Lorsque Z projection est souhaitée pour la vue en profondeur des cellules, sélectionner le mode d'imagerie "xyz", définir la profondeur de la plage de balayage (10 - 15 um) et récupérer les images à partir du haut vers le bas de la cellule cible . Compiler les images obtenues avec le logiciel Leica en cliquant droit sur le fichier d'image pour sélectionner "renommer" et d'exporter des images sous forme de fichiers .tiff.
- Photo 30 - 40 cellules pour l'analyse de quantification.
Traitement 5. Image et analyse de Quantification
- Utilisez le logiciel Fidji (http://fiji.sc/Fiji) pour traiter des images et effectuer la quantification.
- Tracer les graphes d'intensité de fluorescence.
- Pour mieux visualiser si l'expression CFP / YFP estuniformément répartie, utiliser Fidji pour démontrer la puissance du signal du CFP et YFP le long de la périphérie de la cellule. Pour ce faire, lancer la première Fidji puis sélectionnez "Fichier" et "Ouvrir" pour démarrer l'image. Cliquez sur "ligne" dans le menu d'outils et sélectionnez "ligne segmentée" par un clic droit. Décidez de la région d'intérêt et tracer une ligne le long de la périphérie de la cellule pour tracer la PCP ou le signal YFP (figure 3A-C).
Note: Fidji mesure la valeur d'intensité de fluorescence absolue le long des lignes segmentées. - Sélectionnez le menu déroulant "Analyser" et "Profil de la parcelle" pour générer un graphique avec la position et l'intensité des valeurs qui représentent les niveaux de CFP / YFP le long de la ligne segmentée. Si vous le souhaitez, dupliquer les valeurs d'intensité (en sélectionnant le menu "Copier") dans EXCEL ou un autre logiciel graphique pour générer des graphiques d'intensité comparables.
- Pour mieux visualiser si l'expression CFP / YFP estuniformément répartie, utiliser Fidji pour démontrer la puissance du signal du CFP et YFP le long de la périphérie de la cellule. Pour ce faire, lancer la première Fidji puis sélectionnez "Fichier" et "Ouvrir" pour démarrer l'image. Cliquez sur "ligne" dans le menu d'outils et sélectionnez "ligne segmentée" par un clic droit. Décidez de la région d'intérêt et tracer une ligne le long de la périphérie de la cellule pour tracer la PCP ou le signal YFP (figure 3A-C).
- Quantifier degré de polarité.
- Prélever environ 20 représencellules tatives de 3 expériences répétées pour évaluer le degré de polarité du CFP et YFP dans les cellules de tabac. Calculer le degré de polarité sur la base du rapport de l'intensité de fluorescence élevée (définie comme H) par rapport à la faible intensité de fluorescence (définie comme L). Remarque: La méthode de quantification est expliqué dans la Figure 3.
- Pour mesurer les valeurs de H et L, tracer une ligne segmenté le long de la région intéressée à la périphérie de la cellule (décrite ci-dessus), cliquez sur "Analyser" dans le menu déroulant, puis sélectionnez "Mesure". Lorsqu'une fenêtre "Résultats" apparaît, utiliser "moyenne" des valeurs pour effectuer la quantification.
- A partir des cellules présentant une expression relativement uniforme de CFP et YFP, par exemple, CFP-BASL (figure 3A) ou YFP complétées de la co-expression de DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3B), obtenir les valeurs H et L en mesurant deux choisis au hasard segments périphériques de longueur égale. <li> A partir des cellules présentant l' accumulation polaire évidente de protéines fluorescentes, dans ce cas, la co-expression de la PCP-BASL, DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3C), collecter les valeurs H des régions périphériques avec des signaux de fluorescence enrichis et les Ls des régions à faible / pas d'accumulation de fluorescence.
- Réunir les rapports résultants de H / L de 20 cellules ensemble et essai pour la distribution normale. Calculer les valeurs de p par le test t de Student (pour la distribution normale) ou le test de Kolmogorov-Smirnov (KS) (pour la distribution non-normale).
- Prélever environ 20 représencellules tatives de 3 expériences répétées pour évaluer le degré de polarité du CFP et YFP dans les cellules de tabac. Calculer le degré de polarité sur la base du rapport de l'intensité de fluorescence élevée (définie comme H) par rapport à la faible intensité de fluorescence (définie comme L). Remarque: La méthode de quantification est expliqué dans la Figure 3.
- Tracer les graphes d'intensité de fluorescence.
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Representative Results
Pour empêcher la mort cellulaire induite par la signalisation MAPK hyperactif, la kinase de versions inactives YDA (DNyda) et MPK6 (DNmpk6) ont été utilisés dans le test de co-expression dans des cellules de tabac. Ni l'interaction entre DNyda et DNmpk6 révélé par BiFC ni CFP-BASL se modèle de distribution inégale générée (figure 3A-B). Toutefois, lorsque CFP-BASL a été introduit dans la paire d'interaction DNyda-DNmpk6, à la fois des signaux YFP PCP et ont été redistribués à une manière très polarisée (figure 3C). Cette redistribution suggère que BASL interagit avec YDA et à l'espace MPK6 réorganiser la voie de signalisation MAPK dans les cellules végétales. L'état de phosphorylation de BASL a des effets différents sur le degré de polarité de la signalisation MAPK: une version de phospho-imitant de BASL généré une très forte polarité, tandis qu'une version phospho déficiente a montré une activité plus faible 6. Ces données ont appuyé notre modèle de travail d'un régulation de rétroaction positive entre BASL et la voie YDA-MAPK dans la génération de la polarité cellulaire 6.
Figure 1. Schéma du complexe Polarité BASL-YDA-MPK6 Pendant stomatique division cellulaire asymétrique (ACD) chez Arabidopsis. Dans l'épiderme des feuilles, le lignage stomatique initie à partir des cellules protodermal, qui se dilatent pour devenir des cellules précurseurs ACD, les cellules Meristemoid Mère (RHM). Un MMC subit un ACD pour créer un Meristemoid et un SLGC (Cellule de terre de la lignée stomatique), qui peut diviser et, éventuellement, se différencier en cellules de garde des stomates et des cellules de la chaussée, respectivement. Au niveau du cortex cellulaire des cellules précurseurs de l'ACD (RHM), BASL recrute deux composants d'une voie MAPK, la MAPKKK YDA et MAPK MPK6, pour former un complexe de polarité et régulent stomates ACD.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de la procédure d'injection dans le tabac Épiderme de la feuille. (A) Transformer les plasmides hébergeant CFP-BASL, DNyda-NYFP, DNmpk6-cYFP et P19 dans Agrobacterium tumefaciens GV3101 et se développent eux sur des plaques de sélection respectives (de haut en bas dans UNE). (B) Prise en charge des colonies de (A) à inoculer une culture liquide pour la croissance pendant une nuit. Cellules (C) Récolte en filature et décanter le surnageant. Après pipetage brièvement et le lavage des pastilles, centrifuger les cellules à nouveau. (D) Re-suspendre et de diluer les culots de cellules avec la solution d'infiltration (voir le protocole) pour atteindre la DO finale 600 = 0,5. (E) e mélanger doucementcellules e remises en suspension dans une boîte de Pétri. (F) utiliser une seringue sans aiguille pour pousser le mélange d'infiltration dans la face abaxiale des feuilles de tabac. (G) Environ 48 heures après l' infiltration, les feuilles sont prêts pour l' imagerie confocale. disques de feuilles d'accise contenant des cellules infectées par un perforateur de trou autour de la région d'infiltration. cercles pointillées indiquent excisées disques de congé. (H) Utiliser de l' eau pour monter les disques de feuilles sur une lame standard pour l' imagerie confocale. Les diagrammes de la boîte dans la zone ombrée décrivent les protéines injectées dans feuilles de tabac pour le dosage de polarisation. Tailles de protéines ne sont pas à l' échelle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Affichage et Quantification de Polarité Formation. (AC) confocale pour afficher CFP et YFP florescence dans les cellules épidermiques du tabac. Cyan indique l'expression de la PCP. Le jaune indique l'expression de la YFP. (A) La surexpression de CFP-BASL seul. (B) Co-expression de DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP. L'expression YFP est complétée lorsque deux protéines interagissent. (C) Co-expression de CFP-BASL, DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP. La répartition inégale (polarité) est évidente pour les deux CFP et YFP. Barre d' échelle = 50 pm (AC). (DF) traçant graphiquement l'intensité de fluorescence CFP / YFP le long des lignes en pointillés (magenta) à (AC). triangles de Magenta marquent le point des régions utilisées pour le traçage d'intensité début et la fin. Quantifications du degré de polarité dans les cellules de tabac sont présentés ci-dessous. Les valeurs d'intensité de fluorescence (H pour la haute et L pour la basse) sont mesurées et recueillies par les Fidji des régions tracées avec da rougejeter lignes (AC). Pour chaque échantillon, les valeurs de 20 cellules sont en moyenne pour le test de signification. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Utilisation générale et modifications possibles du système d'expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l'épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l' étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un sujet difficile en raison de contextes sous - cellulaires complexes, transitoire interaction protéine-protéine et des événements de transduction du signal. Pour relever ce défi, nous avons profité du système BiFC pour examiner les événements de signalisation MAPK. Par co-exprimant YDA-NYFP et MPK6-cYFP, le signal récupéré YFP a indiqué que l'activation du relais de signalisation MAPK peut se produire à la membrane plasmique.
Il serait idéal de co-express marqués par fluorescence YDA et MPK6 dans Arabidopsis et d'examiner la signalisation MAPK dynamique in vivo. Cependant, GEnerating plantes transgéniques prend du temps, en particulier lorsque plusieurs constructions est souhaitée. L' expression de protéine transitoire dans des cellules de tabac peut être un test préliminaire rapide pour l'expression in vivo chez Arabidopsis ou d' autres plantes. L'autre avantage du système d'expression transitoire du tabac offre, mais ne peut pas être facilement réalisé en générant des plantes transgéniques, est que les protéines jusqu'à 4 ou 5 fusion peuvent être co-exprimés simultanément et examinées par microscopie à foyer commun lorsque la combinaison est réalisable.
En utilisant des cellules de l'épiderme du tabac pour étudier la signalisation MAPK dans les cellules végétales peuvent être en outre mis en oeuvre pour d'autres voies de signalisation et dans différentes conditions environnementales. Par exemple, serait l'interaction de YDA-MAPK changer son intensité ou de l' emplacement où la cellule exprimant est traitée avec H locale 2 O 2 de l' application (un stimulus de signalisation MAPK)? De tels tests peuvent être rapidement conçus et réalisés pour répondre specdes questions IFIC. Plusieurs membres existent dans chaque niveau des cassettes MAPK (3 - 4 de Tiers en général), mais la façon dont la spécificité de signalisation est réalisée dans des plantes ou d'autres systèmes demeurent largement inconnus. En faisant différentes combinaisons de MAPKKKs avec MAPKK, ou MAPKK avec MAPK, le système d'expression transitoire du tabac permet une analyse relativement à grande échelle, non seulement de l'interaction protéine-protéine, mais aussi l'organisation spatiale du flux de signalisation dans les cellules végétales.
Customized Co-expression et BiFC Assay d'Investigation de la protéine Polarisation: Une question de longue date fondamentale en biologie cellulaire est de savoir comment les voies de signalisation universelles, par exemple, MAPK, atteindre leur spécificité à un certain stade de développement ou dans des conditions environnementales particulières. Co-expression de la protéine BASL de polarité avec les composants BiFC de YDA et MPK6 dans des cellules de tabac nous a permis de démontrer que l'interaction YDA-MAPK et la signalisation est spatialement re-distributed par la présence de BASL, une des protéines spécifiques de la polarité lors de l'ACD stomatique. Par conséquent, la spécificité de la signalisation MAPK-YDA peut être obtenue par l'interaction avec BASL pour promouvoir la polarité et la division cellulaire asymétrique.
Bien qu'il ne soit pas un phénomène universel, quelques protéines mal ont été trouvés à être distribués de manière inégale dans les cellules végétales, par exemple, 15, auxine effluxer PIN protéines de petite GTPase 16 et leurs régulateurs 17, les transporteurs de bore 18 et des protéines inconnues (OCTOPUS 19 , POLAR 20 et BRX 21). Ce protocole n'a pas été conçu pour rechercher les partenaires génétiques ou physiques dans une voie de polarisation de protéine particulière, mais sera probablement utile pour tester si les protéines interagissant avec ROP, PINs ou d'autres peuvent former un complexe de polarité dans les cellules végétales. Toutefois, lorsque vous essayez de simuler un événement de polarisation en utilisant des cellules de tabac, il faut garder à l'esprit que les complicationspeut se produire dans les dosages. Par exemple, l'événement d' Arabidopsis de polarisation ne peut être récapitulé dans les cellules du tabac, en particulier lorsque plus de composants que ce qui peut être logé dans l'essai. Certaines molécules inconnues provenant de l'arrière-plan du tabac, pas nécessairement les protéines en cours d'examen, peuvent être impliqués dans l'induction d'un événement de polarisation. Par conséquent, il est essentiel de mettre en place des expériences de contrôle strictes dans le tabac et de valider les données de Arabidopsis ou d' autres plantes.
Éléments clés pour réussir dans les expériences: Tout d' abord, les plants de tabac verdâtres et en bonne santé devraient être utilisés. Depuis les analyses de quantification ont besoin de mettre en commun les données provenant de diverses cellules, il est essentiel d'utiliser en plein essor des plants de tabac avec des cellules toujours en bonne santé. Ensuite, les cellules exprimant des taux de protéines moyennes doivent être utilisées pour l'imagerie confocale. faibles niveaux d'expression ne peuvent pas fournir suffisamment de protéines pour le dosage et saturé l 'expressionNIVEAUXATTEINTSPARLEP ASSE seraient masquer l'effet de polarisation / translocation.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
