Abstract
Визуализация динамических сигнальных событий в живых клетках было проблемой. Мы расширили установленную систему транзиторной экспрессии, биомолекулярной флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализа в эпидермальных клеток табака, от взаимодействия тестирования белок-белок для контроля пространственного распределения сигналов в клетках растений. В этом протоколе, мы использовали пробу BiFC , чтобы показать , что взаимодействие и передача сигналов между Arabidopsis MAPKKK Йоду и MAPK6 происходит на плазматической мембране. Когда совместно высказывалось каркасный белок BASL, взаимодействие YODA-МАРК перераспределены и пространственно совместно с поляризованным CFP-BASL. Эта модифицированная система экспрессии табака позволяет быстро обследования сигнализации локализации и динамических изменений (менее 4-х дней) и может работать с несколькими флуоресцентных цветов белка (не менее трех). Мы также представили подробные методы для количественного определения распределения белка (асимметричную пространственную локализацию, или "поляризации";) В клетках табака. Эта усовершенствованная система экспрессии табака имеет потенциал, чтобы быть широко используется для быстрого тестирования динамических сигнальных событий в клетках живых растений.
Introduction
Белки взаимодействуют в запутанную иерархической сети и образуют комплексы, которые играют ключевую роль практически во всех биологических процессах, происходящих в непредсказуемом клеточной среде. Тем не менее, от развития растений в ответах роста, наблюдается отсутствие удобных инструментов, которые могут не только быстро, но и эффективно идентифицировать и контролировать эти динамические сигнализации событий на субклеточном уровне.
Переходная система экспрессии белка в табачных листьев эпидермис имеет привлекательный преимущества для визуализации флуоресцентных белков в живых клетках. Эта система обеспечивает условия полу- прижизненно, позволяющие посттрансляционной модификации белков и быстрое исследование локализации белка. Рассматривая дополненный сигнал YFP, бимолекулярный флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализ информирует возможность взаимодействия белок-белок в клетках растений. По сравнению с другими методами, например, дрожжи-два гибридных (Y2H) и со-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC также предоставляет мощные средства визуализации отсеков, где белок-белковые взаимодействия могут происходить на субклеточном уровне.
Поскольку асимметричное деление клеток (ДСА) поддерживает стволовые популяции клеток при создании новых типов клеток для формирования ткани / органа, он является незаменимым механизмом содействия эукариотической многоклеточность. Развитие Arabidopsis устичный была использована в качестве модельной системы для изучения ДСА в растениях. Клетка-предшественник, meristemoid материнские клетки, разрывами асимметрично, чтобы производить два разных дочерних клеток, а meristemoid (претерпевает стволовые клетки, как разделение, перед завершением на пару замыкающих клеток) и устичный родословная наземной клетки (SLGC) (может делиться и дифференцироваться в мостовая клетки), соответственно (рис 1). В устьичной ДСА, новый белок Преломление Асимметрия в Lineage УСТЬИЧНОГО (BASL) поляризован premitotically водить деление асимметрию, которая вклЛюд физическая асимметрия и клеточная судьба асимметрия 1. МАРК каскад , состоящий из MAPKKK Йоду и МАРК, MPK3 и 6 является центральным для формирования паттерна устичный деления и судьбы принятия 2,3, 4,5.
В последнее время , Zhang и др. связала полярности белка BASL к сигнального пути YDA-МАРК в Arabidopsis устьичной ДСА 6. Канонический YODA-МАРК путь, через MPK3 / 6, фосфорилирует BASL и активизирует свою поляризацию. Фосфорилированные BASL функционирует как помост и вербует Йоду (Yda) и MPK3 / 6 с образованием белкового комплекса и концентрировать сигнализацию на клетки коры головного мозга 6. Поляризационная компонентов МАРК и положительной обратной связи между BASL и пути YDA-МАРК представляет собой новый механизм поляризации белка в клетках растений. Локально обогащается сигнализации МАРК гипотетически быть тесно связана с судьбой клеток дифференциации в устьичной ДСА 6 (рисунок 1). Один из КEY экспериментальные данные , которые поддержали эту модель пришла от табака анализов , которые продемонстрировали пространственное перераспределение МАРК индуцированных выражением BASL 6.
В общем, это не так легко контролировать, где передача сигналов МАРК происходит потому, что молекулы МАРК часто встречаются повсеместно внутрь клетки. В данном исследовании мы использовали систему сплит-YFP визуализировать взаимодействие между вверх по течению и вниз по течению киназ те предположить, где происходит реле сигнализации. Кроме того, мы расширили использование системы BiFC путем коэкспрессирующей третий белок (CFP-меченый) с раздельным YFP пары (предполагающим белок-белкового взаимодействия), чтобы визуализировать ли и каким образом дополнены YFP может быть пространственно модулируют СО- выразил CFP белок. Поступая таким образом, мы показали, что совместное выражение CFP-BASL индуцированной пространственной реорганизации взаимодействий между Yda и MPK6, от равномерного распределения к поляризованной кучность в клеточной коре табака эпидермисаAl клетки. Таким образом , эта система имеет потенциал , чтобы быть разработаны для мониторинга динамических сигнальных событий в клетках растений в условиях , когда клетки сталкиваются с проблемой внутренних или внешних раздражителей (например, совместная экспрессия других белков, химического применения, атаки патогена или изменений в окружающей среде, и т.д.. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Плазмиду Строительство
- Генерирование конструкции по технологии клонирования , как описано выше 1,6.
- Сначала с помощью ДНК-полимеразы с высокой точностью соответствующих праймеров для амплификации кодирующих последовательностей BASL, YDA и MPK6 и суб-клонировать их в векторы входа. Найти подробный протокол в 7.
- Для создания доминирующие негативные версии MPK6 и Yda (DNmpk6 8 и DNyda 4 соответственно), использовать запись плазмид MPK6 и Yda в качестве матрицы и ввести точечные мутации с помощью сайт-направленного мутагенеза 9.
- Для построения конструкции для временных тестах табака, проводят стандартную LR (ATTL х атр рекомбинация) реакции (подробная процедура в 7) включить BASL в pH35CG 10, DNyda и DNmpk6 в pXNGW и pXCGW векторы 11, соответственно.
- Подтвердите результирующих плазмид путем ферментативного расщепления и последовательности. После того, как Successful, преобразование бинарных конструкций в Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101 12 и выращивают их на селекции пластин при 28 ° С в течение 2 - 3 дней.
2. Приготовление раствора Agrobacterium Infiltration
- Инокулируйте несколько свеже трансформированных Agrobacterium колонии в 10 мл Лурии-Бертани (LB) среде с соответствующими антибиотиками (Гентамицин 25 мкг / мл, Рифамицин 25 мкг / мл, Спектиномицина 100 мкг / мл для pH35CG, pXNGW и pXCGW конструирует, одни и те же концентрации гентамицина и рифамицин с использованием канамицина 50 мкг / мл для P19 (экспрессии белков против трансгенной глушителей) 13.
- Grow Agrobacterium культур в C шейкере 28 ° со скоростью 200 оборотов в минуту в течение приблизительно 16 часов , а затем измерить OD 600 ( по оценкам, достигает 1,5 - 1,8) (рис 2A-B). Спин вниз культур при 2500 мкг в течение 10 мин. Повторное приостановить и ваSh гранул клеток с 10 мМ MgCl 2 (инфильтрация раствора).
- Спином вниз культуры вновь и вновь приостановить гранул с соответствующим количеством раствора инфильтрации для достижения конечной OD 600 = 0,5 (рис 2C-D). Перед инфильтрации растения, оставляют клеточные смеси при комнатной температуре в течение 1 - 3 ч. Этот шаг помогает поддерживать гомеостаз клеток.
3. Завод Табак и листьев для инъекций
- Использование растений табака (Nicotiana benthamiana), выращиваемых 4 - 5-недельных в стандартной камере роста растений (23 ° C с циклами 16 ч-света / 8 ч-темный) 14 для инъекций листьев.
Примечание: На данном этапе растения табака, как правило, имеют 6 листьев (2 больших, 2 средних и 2 маленьких). Две средние листья являются наиболее оптимальными для инъекций листа (две большие из них слишком стары, в то время как два маленьких часто слишком молоды). - Перед инфильтрации день, поливать tobacсовместные предприятия, чтобы насытить почву.
- На инфильтрационной день, предварительно инкубировать растения в темноте в течение 1 - 3 ч. Этот шаг позволяет устьица в эпидермисе широко открыть, что значительно облегчает Agrobacterium при проникновении в лист клеток эпидермиса.
- Используя цветные ленты меченых с датами, флаг листья, чтобы быть инфильтрации. Отметьте области, которые будут пропитаны черным толстым шулер (опционально, инфильтрации зоны видны после заражения.).
- Возьмем равные объемы Agrobacterium ресуспендирования и смешать их в 100 х 15 мм чашки Петри Осторожным закрученной (рис 2E). Примечание: В нашем случае, мы смешали 1 мл p19 1 мл CFP-BASL, 1 мл DNyda-NYFP и 1 мл DNmpk-cYFP.
- В процессе инфильтрации, заполнить 3 мл безыгольного шприца с инфильтрацией смеси (1 - 2 мл) и нажать на нижнюю сторону (абаксиальной) табачного листа (рис 2F). В то время как инфильтрации, полезноиспользовать одну руку, чтобы нажать и, с другой стороны, чтобы мягко поддерживать верхнюю сторону (адаксиальная, против толкающей силы).
Примечание: После того, как инфильтрация смесь успешно впрыскивается, зараженные районы станут легко узнаваемы в эпидермисе. Тем не менее, инфильтрация может потерпеть неудачу из-за резкой инъекции (повреждение ткани) или недостаточной толчке (без проникновения жидкости). Для каждого теста, мы предлагаем, по крайней мере две инъекции в двух независимых листьев (из разных растений). - Поместите Зараженные растения обратно в камеру роста. Как правило, белковые выражения могут быть обнаружены через 48 ч следующего инфильтрации.
4. конфокальной микроскопии
- В 48 ч после инфильтрации, используйте перфоратора акцизным листовую диск из области инъекции (обычно 3 - 4 дисков / область может быть получена) (рис 2G). Используйте пинцет, чтобы аккуратно перенести диски листа к слайду (абаксиальной боковой вверх) и смонтировать их с каплями воды. Не нажимайте слишком харd на покровного стекла , потому что выжимали / поврежденные клетки не будут отображаться хорошо под конфокальной микроскопии (рис 2H).
- Перед конфокальной микроскопии, сканировать смонтированные образцы на эпи-флуоресцентный сложного микроскопа, чтобы проверить уровни экспрессии. Примечание: Основываясь на нашем опыте, клетки, которые показывают промежуточные уровни экспрессии лучше всего представлены под конфокальной микроскопии.
- Начните с 40X (NA 1.3) объектив на конфокальной микроскопии. Воспроизведения слайд в желаемое положение таким образом, что клетки, экспрессирующие средние уровни флуоресцентных белка остаются в центре. Спектры возбуждения / эмиссии для CFP и YFP 458 нм / 480 - 500 нм и 514 нм / 520 - 540 нм, соответственно.
- Активировать кнопку "Live" для предварительного просмотра изображения затем отрегулировать интенсивность лазерного излучения и смарт усиления для наиболее сбалансированного соотношения интенсивности флуоресценции / шум. Для улучшения качества изображения, увеличение сканирования пикселей и / или средний кадр / линии. И, наконец, отрегулируйте ручки фокусировки на REAч средний фокальной плоскости и нажмите кнопку "Capture", чтобы принять изображение.
Примечание: CFP и YFP изображения могут быть захвачены последовательно или одновременно путем проверки или выключения опции "последовательного" режима сканирования, соответственно. - Когда Z-проекция желателен для вида углубленном ячеек, выберите режим формирования изображения "XYZ", определить глубину диапазона сканирования (10 - 15 мкм) и собирать изображения с верхней к нижней части клетки-мишени , Обобщение полученных изображений с помощью программного обеспечения Leica, щелкнув правой кнопкой мыши на файл изображения, чтобы выбрать "переименовать" и экспортировать изображения в качестве .tiff файлов.
- Image 30 - 40 клеток для анализа количественной оценки.
Обработка изображений и 5. Количественный анализ
- для обработки изображений и проведения количественной оценки Использование программного обеспечения Фиджи (http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=dobj).
- Изобразите графики интенсивности флуоресценции.
- Чтобы лучше визуализировать ли выражение CFP / YFP являетсяравномерно распределены, используют Фиджи, чтобы продемонстрировать силу сигнала CFP и YFP вдоль периферии клетки. Для достижения этой цели, сначала запустить Фиджи затем выберите "Файл" и "Открыть", чтобы начать изображение. Нажмите кнопку "линии" в меню инструментов и выберите "Сегментированный линию", щелкнув правой кнопкой мыши. Определите область интереса и провести линию вдоль периферии клетки проследить CFP или YFP сигнал (рис 3A-C).
Примечание: Фиджи измеряет абсолютное значение интенсивности флуоресценции вдоль сегментированных линий. - Выберите в раскрывающемся меню "Анализ" и "Plot Profile", чтобы создать граф с положения и интенсивности значений, которые представляют уровни CFP / YFP вдоль сегментированной линии. При желании, дублируют значения интенсивности (выбрав меню "Copy") в EXCEL или другого графического программного обеспечения для создания сопоставимых графиков интенсивности.
- Чтобы лучше визуализировать ли выражение CFP / YFP являетсяравномерно распределены, используют Фиджи, чтобы продемонстрировать силу сигнала CFP и YFP вдоль периферии клетки. Для достижения этой цели, сначала запустить Фиджи затем выберите "Файл" и "Открыть", чтобы начать изображение. Нажмите кнопку "линии" в меню инструментов и выберите "Сегментированный линию", щелкнув правой кнопкой мыши. Определите область интереса и провести линию вдоль периферии клетки проследить CFP или YFP сигнал (рис 3A-C).
- Количественно степень полярности.
- Соберите приблизительно 20 представивенные клетки из 3-х экспериментов дублирующих оценить степень полярности CFP и YFP в клетках табака. Рассчитывают степень полярности на основе соотношения интенсивности флуоресценции высокого (определяемой как H) над низкой интенсивности флуоресценции (определяется как L). Примечание: Метод Количественное поясняется на рисунке 3.
- Для измерения H и L значения, нарисуйте сегментированный линию вдоль заинтересованной области на периферии клетки (описанной выше), нажмите кнопку "Анализ" из выпадающего меню, а затем выберите "Мера". Когда окно "Результаты" всплывает, используйте "Среднее" значения для выполнения количественной оценки.
- Из клеток , воспроизводящих относительно однородную экспрессию CFP и YFP, например, КФП-BASL (фиг.3А) или YFP дополнены от совместного выражения DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP (рис 3б), получаем значения H и L путем измерения два случайно выбранных периферийных сегментов с одинаковой длины. <li> Из клеток , проявляющих явный полярную накопление флуоресцирующих белков, в этом случае совместная экспрессия CFP-BASL, DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP (рис 3C), собрать значения H из периферийных областей с обогащенными флуоресцентных сигналов и Ls из регионов с низким никакого накопления / флуоресценции.
- Бассейн результирующие соотношения H / L от 20 клеток вместе и тест для нормального распределения. Вычислить значения р Т критерию Стьюдента (для нормального распределения) или Колмогорова-Смирнова (KS) тест (для не нормального распределения).
- Соберите приблизительно 20 представивенные клетки из 3-х экспериментов дублирующих оценить степень полярности CFP и YFP в клетках табака. Рассчитывают степень полярности на основе соотношения интенсивности флуоресценции высокого (определяемой как H) над низкой интенсивности флуоресценции (определяется как L). Примечание: Метод Количественное поясняется на рисунке 3.
- Изобразите графики интенсивности флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы предотвратить гибель клеток, вызванную гиперактивного сигнализации МАРК, использовались киназ неактивные версии Yda (DNyda) и MPK6 (DNmpk6) в анализе с совместным экспрессии в клетках табака. Ни взаимодействие между DNyda и DNmpk6 выявлены BiFC ни самой генерируется неравномерный характер распределения (рис 3A-B) СФП-BASL. Тем не менее, когда КФП-BASL был введен в пару DNyda-DNmpk6 взаимодействия, как СФП и сигналы YFP были перераспределены крайне поляризованной образом (рис 3C). Такое перераспределение предполагает, что BASL взаимодействует с Yda и MPK6 пространственно реорганизовать сигнализации МАРК пути в клетках растений. Статус фосфорилирования BASL имеет различное влияние на степень полярности сигналов МАРК: в фосфорно-имитируя версии BASL генерируемого очень сильной полярности, в то врем как фосфо-дефицитных версия показала слабую активность 6. Эти данные поддержали нашу рабочую модель положительное регулирование обратной связи между BASL и пути YDA-МАРК в генерации клеточной полярности 6.
Рисунок 1. Схема Полярность комплекса BASL-YDA-MPK6 Во время УСТЬИЧНОГО Асимметричная клеточного деления (АДС) в Arabidopsis. В эпидермы листьев, устьичной инициирует построчная оплата от protodermal клеток, которые расширяются , чтобы стать клетки - предшественники, ACD в Meristemoid материнские клетки (КММ). ГМК подвергается ДСА, чтобы создать один Meristemoid и один SLGC (устичный линия заземления клеток), которая может разделяться и в конечном итоге дифференцироваться в устьичными замыкающие клетки и тротуарных клеток, соответственно. В клетки коры головного мозга клеток-предшественников ДСА (ММС), BASL вербует два компонента МАРК метаболическом пути MAPKKK YDA и МАРК MPK6, чтобы сформировать комплекс полярности и регулировать устьичного ДСА.ом / файлов / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схема процедуры Инъекция в табачный лист эпидермисе. (A) Transform плазмиды , несущие CFP-BASL, DNyda-NYFP, DNmpk6-cYFP и P19 в Agrobacterium tumefaciens GV3101 и выращивать их на соответствующих пластинах отбора (сверху вниз в А). (B) Возьмите колонии из (а) для инокуляции жидкой культуры для роста в течение ночи. (C) Урожай клеток путем прядения и переливать супернатант. После краткого пипеткой и промывки гранул, спином вниз клетки снова. (D) Повторное приостановить и разбавьте гранул клеток с раствором инфильтрации (см протокол) для достижения конечной OD 600 = 0,5. (E) Аккуратно перемешайте юе ресуспендировали клетки в чашке Петри. (F) С помощью безыгольного шприца , чтобы толкать инфильтрацией смесь в абаксиальной сторону листьев табака. (G) Около 48 ч после инфильтрации, листья готовы к конфокальной микроскопии. Акцизный диски листьев, содержащие зараженные клетки с перфоратором вокруг области инфильтрации. Пунктирные круги указывают вырезают диски отпуска. (H) Используйте воду , чтобы смонтировать диски листьев на стандартную горкой для конфокальной микроскопии. Коробочные диаграммы в затененной области описывают белки впрыскивается в листьях табака для анализа поляризации. Размеры белка не в масштабе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Дисплей и Количественное Полярность свиты. (AC) конфокальной изображения , чтобы показать CFP и YFP в цветение эпидермальных клетках табака. Cyan указывает на экспрессию CFP. Желтый цвет указывает на экспрессию YFP. (А) Сверхэкспрессия только CFP-BASL. (B) Совместная экспрессия DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP. Выражение YFP дополняется, когда два белка взаимодействуют между собой. (C) Совместная экспрессия CFP-BASL, DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP. Неравномерное распределение (полярность) очевидна для обоих CFP и YFP. Шкала бар = 50 мкм (AC). (DF) Графически черчения интенсивности флуоресценции CFP / YFP вдоль пунктирных линий (Magenta) в (AC). Magenta треугольники отмечают начальную и конечную точку областей, используемых для интенсивности черчения. Количественными от степени полярности в клетках табака представлены ниже. Значения интенсивности цветения (H для высокого и L для низких) измеряются и собирают Фиджи из регионов отслеживаемых с красным дапролил линии в (AC). Для каждого образца значения из 20 ячеек усредняются для тестирования значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Общее использование и возможные модификации Преходящего системы Expression табака для передачи сигнала: гиперэкспрессия флуоресцентного белка (FP) -tagged белков в табаке эпидермиса успешно используется для быстрого изучения белка внутриклеточной локализации в клетках растений. Тем не менее, изучение динамического распределения сигнализации белкового комплекса в Planta является сложной проблемой из - за сложных субклеточных контекстов, транзиторной белок-белкового взаимодействия и сигнальной трансдукции событий. Для решения этой проблемы, мы воспользовались системой BiFC для изучения МАРК сигнализации событий. По коэкспрессирующей Yda-NYFP и MPK6-cYFP, восстановленный сигнал YFP показал, что активация сигнального реле МАРК может привести к возникновению на плазматической мембране.
Было бы идеально , чтобы совместно выразить флуоресцентно меченый YDA и MPK6 в Arabidopsis и для изучения динамической сигнализации МАРК в естественных условиях. Тем не менее, GEnerating трансгенные растения, отнимает много времени, особенно, когда более одной конструкции желательно. Белок кратковременная экспрессия в клетках табака может быть быстрым предварительным испытанием для экспрессии в естественных условиях в Arabidopsis или других растений. Другое преимущество, что табачный переходная система экспрессии предлагает, но не может быть легко достигнуто путем генерации трансгенных растений, в том, что до 4 или 5 слитые белки могут быть совместно выражены одновременно и исследовали с помощью конфокальной микроскопии, когда комбинация достижимо.
Использование эпидермальных клеток табака для исследования сигналов МАРК в клетках растений могут быть дополнительно реализованы в других сигнальных путей и при различных условиях окружающей среды. Например, будет ли взаимодействие Yda-МАРК изменить его интенсивность или местоположение при экспрессии клеток обрабатывают локальной H 2 O 2 приложения (сигнальный стимул МАРК)? Такие анализы могут быть быстро разработаны и выполнены для решения спецификацииIfic вопросы. Несколько членов существуют в каждом ярусе МАРК кассет (3 - 4 яруса в целом), но как сигнализации специфичность достигается в растениях или других систем остаются неизвестными. Делая различные комбинации MAPKKKs с MAPKKs или MAPKKs с МАРК, табачный переходная система экспрессии позволяет сравнительно крупномасштабный анализ не только белок-белкового взаимодействия, но и пространственной организации сигнального потока в клетках растений.
Индивидуальные коэкспрессией и BiFC Пробирной для изучения белок Поляризация: Один давний фундаментальный вопрос в клеточной биологии, как универсальные сигнальные пути, например, MAPKs, достигают своей специфичности на определенной стадии развития или в определенных условиях окружающей среды. Коэкспрессирующей полярности белка BASL с компонентами BiFC из Yda и MPK6 в клетках табака позволило нам продемонстрировать, что взаимодействие YDA-МАРК и сигнализации пространственно повторно дistributed наличием BASL, специфической белками полярности во время устьичным ДСА. Таким образом, специфичность сигнализации YDA-МАРК может быть достигнуто за счет взаимодействия с BASL для продвижения клеточной полярности и асимметричное деление.
Хотя это не является универсальным явлением, немало белков было обнаружено, что неравномерно распределены в клетках растений, например, небольшие ГТФ ROPS 15, ПИН - белки ауксина effluxer 16 и их регуляторы 17, бор транспортеров 18 и неизвестные белки (Octopus 19 , POLAR 20 и BRX 21). Этот протокол не был предназначен для поиска генетических или физических партнеров в поляризационном пути конкретного белка, но, вероятно, будет полезно для тестирования ли взаимодействующие белки с ROPS, ПИНы или другие могут образовывать комплекс полярности в растительных клетках. Тем не менее, при попытке имитировать событие поляризации с использованием клетки табака, следует иметь в виду, что осложненияможет происходить в анализах. Например, событие арабидопсиса поляризация не может быть обобщено клетках табака, в частности , когда большее количество компонентов требуется , чем то , что могут быть размещены в данном анализе. Некоторые неизвестные молекулы, полученные из табака фоне, не обязательно белков при обследовании, могут быть вовлечены в вызывая событие поляризации. Поэтому, важно , чтобы установить строгие контрольные эксперименты в табаке и для проверки данных в Arabidopsis или других растений.
Ключевые элементы для достижения успеха в экспериментах: Во - первых, зеленоватые и здоровые растения табака , должны быть использованы. Поскольку Количественное анализы необходимо объединить данные из различных клеток, очень важно использовать процветающий растения табака с последовательно здоровыми клетками. Во-вторых, клетки, экспрессирующие средние уровни белка должны быть использованы для конфокальной микроскопии. Низкие уровни экспрессии не может обеспечить достаточное количество белков для анализа и насыщенных экспрессии Levels бы замаскировать эффект поляризации / транслокации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
