Abstract
La visualización de los eventos de señalización dinámicos en células vivas ha sido un reto. Hemos ampliado un sistema de expresión transitoria establecida, el ensayo de complementación biomolecular fluorescente (BiFC) en las células epidérmicas de tabaco, de la interacción proteína-proteína de prueba para seguimiento de la distribución espacial de la transducción de señales en células vegetales. En este protocolo, se utilizó el ensayo de BiFC para demostrar que la interacción y la señalización entre la Arabidopsis MAPKKK Yoda y MAPK6 se producen en la membrana plasmática. Cuando se co-expresó el BASL andamio de proteínas, la interacción Yoda-MAPK redistribuido y espacialmente copolarizada con PPC-BASL. Este sistema de expresión del tabaco modificado permite la exploración rápida de la señalización de localización y dinámicos cambios (menos de 4 días) y puede acomodar múltiples colores de la proteína fluorescente (al menos tres). También presentamos los métodos detallados para cuantificar la distribución de proteínas (localización espacial asimétrica, o "polarización";) En células de tabaco. Este sistema de expresión del tabaco avanzado tiene un potencial de ser utilizado ampliamente para la prueba rápida de eventos de señalización dinámica en las células de plantas vivas.
Introduction
Las proteínas interactúan dentro de una red y forman intrincados complejos jerárquicos que juegan un papel fundamental en casi todos los procesos biológicos que ocurren en un entorno celular impredecible. Sin embargo, desde el desarrollo de las plantas a las respuestas de crecimiento, ha habido una falta de herramientas convenientes que no puede solo rápido, sino identificar de manera eficiente y monitorear estos eventos de señalización dinámica a nivel subcelular.
El sistema de expresión de proteína transitoria en epidermis de hojas de tabaco ha apelando ventajas para la visualización de las proteínas fluorescentes en células vivas. Este sistema proporciona semi condiciones in vivo que permiten la modificación de proteínas después de la traducción y el examen rápido de localización de la proteína. Mediante el examen de la señal de YFP complementado, la complementación fluorescente (BiFC) de ensayo bimolecular informa a la posibilidad de interacción proteína-proteína en las células vegetales. En comparación con otros métodos, por ejemplo, levadura de dos híbridos (Y2H) y co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC también proporciona un medio poderoso para la visualización de los compartimentos donde se pueden producir interacciones proteína-proteína a nivel subcelular.
Debido a la división celular asimétrica (ACD) mantiene vástago población de células, mientras que la generación de nuevos tipos de células para la formación de tejido / órgano, es un mecanismo indispensable para promover pluricelularidad eucariota. Desarrollo Arabidopsis estomática se ha usado como un sistema modelo para el estudio de ACD en las plantas. La célula precursora, célula madre meristemoide, divide asimétricamente para producir dos células hijas diferentes, un meristemoide (sufre vástago divisiones de células como antes de terminar en un par de células de guarda) y una célula de linaje suelo estomática (SLGC) (puede dividirse y diferenciarse en una célula de pavimento), respectivamente (Figura 1). En los estomas ACD, la novela Breaking proteína de la asimetría en el linaje de los estomas (BASL) está polarizado para conducir premitotically asimetrías de división, que incasimetría física lude y asimetría 1 destino celular. Una cascada MAPK compuesto por el MAPKKK Yoda y las MAPKs, MPK3 y 6 es central para modelar la división de los estomas y la adopción destino 2,3, 4,5.
Recientemente, Zhang et al. BASL vinculado la proteína de la polaridad de la vía de señalización YDA-MAPK en Arabidopsis estomas ACD 6. La vía canónica Yoda-MAPK, a través de MPK3 / 6, fosforila y activa BASL su polarización. Funciones BASL fosforilados como un andamio y recluta YODA (YDA) y MPK3 / 6 para formar un complejo de proteínas y concentran la señalización en la corteza celular 6. La polarización de los componentes de MAPK y el bucle de realimentación positiva entre BASL y la vía YDA-MAPK representa un nuevo mecanismo para la polarización de proteínas en células de plantas. Señalización de MAPK localmente enriquecido es la hipótesis de estar estrechamente vinculado a la diferenciación del destino celular en los estomas ACD 6 (Figura 1). Uno de los key datos experimentales que apoya este modelo vino de los ensayos de tabaco que demostraron la redistribución espacial de MAPKs inducidos por la expresión de BASL 6.
En general, no es fácil de controlar cuando se produce la señalización de MAPK porque las moléculas de MAPK se encuentran a menudo en todas partes en el interior de una célula. En este estudio, se utilizó el sistema split-YFP de visualizar la interacción entre la quinasa aguas arriba y aguas abajo los sugerir donde se produce el relé de señalización. Hemos ampliado aún más el uso del sistema de BiFC por la co-expresión de una tercera proteína (CFP-tagged) con la división YFP par (sugestiva de la interacción proteína-proteína) para visualizar si y cómo el YFP complementado podría espacialmente modulada por la co- proteína expresada PPC. Al hacerlo, hemos demostrado que la co-expresión de PPC-BASL inducida reorganización espacial de las interacciones entre YDA y MPK6, a partir de una distribución uniforme de los patrones de polarización en la corteza celular de la epidermis del tabacocélulas al. Por consiguiente, este sistema tiene el potencial de ser desarrollado para el seguimiento de eventos de señalización dinámicos en células de la planta en condiciones cuando las células son desafiados por los estímulos internos o externos (por ejemplo, la co-expresión de otras proteínas, la aplicación química, ataque de patógenos o los cambios ambientales, etc. ).
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Protocol
1. Construcción del plásmido
- Generar los constructos de la tecnología de clonación como se ha descrito previamente 1,6.
- En primer lugar utilizar una ADN polimerasa de alta fidelidad con cebadores adecuados para amplificar las secuencias codificadoras de BASL, YDA y MPK6 y los sub-clonan en vectores de entrada. Encuentra el protocolo detallado en 7.
- Para generar las versiones dominantes negativos de MPK6 y YDA (DNmpk6 8 y DNyda 4, respectivamente), utilizar los plásmidos de entrada de MPK6 y YDA como molde e introducir las mutaciones puntuales mediante un método de mutagénesis dirigida al sitio 9.
- Para construir las construcciones para ensayos transitorios de tabaco, llevar a cabo reacciones de RL estándar (attL x attR recombinación) (procedimiento detallado en el 7) para integrar en BASL pH35CG 10, DNyda y DNmpk6 en pXNGW y pXCGW vectores 11, respectivamente.
- Confirmar los plásmidos resultantes de la digestión enzimática y secuenciación. Una vez successful, transformar los constructos binarios en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 12 y cultivarlas en placas de selección a 28 ° C durante 2 - 3 días.
2. Preparación de la solución de infiltración de Agrobacterium
- Inocular unas pocas colonias de Agrobacterium recién transformados en 10 ml de medio Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados (gentamicina 25 g / ml, rifamicina 25 g / ml, espectinomicina 100 mg / ml para pH35CG, pXNGW y pXCGW construye; las mismas concentraciones de gentamicina y rifamicina con kanamicina 50 mg / ml de P19 (que expresan las proteínas contra el silenciamiento transgénico) 13.
- Crecer cultivos de Agrobacterium en un agitador C 28 ° a la velocidad de 200 rpm durante aproximadamente 16 horas y después medir la OD 600 (estimado para llegar a 1.5 a 1.8) (Figura 2A-B). Centrifugar los cultivos a 2.500 xg durante 10 min. Vuelva a suspender y wash los sedimentos celulares con 10 mM de MgCl 2 (la solución de infiltración).
- Centrifugar los cultivos de nuevo y vuelva a suspender los pellets con la cantidad apropiada de la solución de infiltración para llegar a la final OD 600 = 0,5 (Figura 2C-D). Antes de la infiltración de las plantas, dejar las mezclas de células a temperatura ambiente por 1 - 3 horas. Este paso ayuda a mantener la homeostasis celular.
3. planta de tabaco y la hoja de Inyección
- Use plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) que se cultivan 4 - 5 semanas de edad, en una cámara de crecimiento de plantas estándar (23 ° C con ciclos de 16 h luz / 8 h oscuridad) 14 para la inyección de la hoja.
Nota: En esta etapa, las plantas de tabaco suelen tener 6 hojas (2 grandes, 2 medianas y 2 pequeñas). Las dos hojas de tamaño medio son los más óptimo para la inyección de la hoja (los dos más grandes son demasiado viejos, mientras que los dos más pequeños son a menudo demasiado joven). - Antes del día de infiltración, regar el Tobacplantas compañeros para saturar el suelo.
- En el día de infiltración, pre-incubar las plantas en la oscuridad durante 1-3 hr. Este paso permite estomas en la epidermis para abrir ampliamente, lo que facilita en gran medida el Agrobacterium al penetrar en las células epidérmicas de la hoja.
- El uso de cintas de color en la sección de fechas, la bandera de las hojas para ser infiltrada. Marcar las áreas que se infiltraron con un rotulador negro grueso (opcional; las zonas infiltradas son visibles después de ser infectados.).
- Tome volúmenes iguales de la Agrobacterium resuspensión y mezclarlas en un 100 x 15 mm placa de Petri agitando suavemente (Figura 2E). Nota: En nuestro caso, hemos mezclado 1 ml de p19 con 1 ml de PPC-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP y 1 ml de DNmpk-cYFP.
- En el proceso de infiltración, llenar una jeringa sin aguja 3 ml con la mezcla de infiltración (1 - 2 ml) y empuje en la parte inferior (abaxial) de la hoja de tabaco (Figura 2F). Mientras que la infiltración, es útilutilizar una mano para empujar y la otra mano para apoyar suavemente el lado superior (adaxial, contra la fuerza de empuje).
Nota: Una vez que la mezcla de infiltración se inyecta con éxito, las áreas infectadas serán fácilmente reconocibles en la epidermis. Sin embargo, la infiltración puede fallar debido a la inyección dura (daño tisular) o presionado bastante (sin penetración de líquidos). Para cada prueba, se sugiere al menos dos inyecciones en dos hojas independientes (de diferentes plantas). - Colocar las plantas infectadas de nuevo en la cámara de crecimiento. En general, las expresiones de proteínas son detectables después de seguir la infiltración de 48 hr.
4. Imagen confocal
- A las 48 horas la infiltración de correos, utilizar una perforadora para extirpar un disco de hoja de la zona de inyección (normalmente 3 - 4 discos / área pueden ser producidos) (Figura 2G). Use pinzas para transferir suavemente los discos de hoja a una diapositiva (el lado abaxial hacia arriba) y montarlos con gotas de agua. Evite presionar demasiado Hard en la hoja de la cubierta porque las células dañadas exprimidos / no mostrará bien bajo el microscopio confocal (Figura 2H).
- Antes de imagen confocal, escanear las muestras montadas en un microscopio compuesto de epi-fluorescencia para comprobar los niveles de expresión. Nota: Sobre la base de nuestra experiencia, las células que muestran los niveles de expresión intermedios se representan mejor en el microscopio confocal.
- Comenzar con el (1,3 NA) del objetivo 40X en un microscopio confocal. Ajuste el deslizante a la posición deseada de manera que las células que expresan niveles medios de proteína fluorescente permanecen en el centro. Los espectros de excitación / emisión de PPC y YFP son 458 nm / 480 - 500 nm y 514 nm / 520 - 540 nm, respectivamente.
- Activar el botón "vivo" para previsualizar las imágenes a continuación, ajustar la intensidad del láser y la ganancia inteligente para la relación de la intensidad de fluorescencia / ruido más equilibrado. Para mejorar la calidad de imagen, aumentar píxeles de exploración y / o media de trama / línea. Finalmente, ajuste el botón de enfoque para reach el plano focal mediana y haga clic en "Capture" para tomar la imagen.
Nota: El PPC y YFP imágenes se pueden capturar de forma secuencial o simultánea mediante la comprobación o desactivar la opción de modo de escaneo "secuencial", respectivamente. - Cuando se desea Z-proyección para la visión en profundidad de las celdas, seleccione el modo de imagen "xyz", definir la profundidad del campo de barrido (10 - 15 micras) y recoger las imágenes de la parte superior a la parte inferior de la célula diana . Compilar las imágenes obtenidas con el software Leica haciendo clic derecho sobre el archivo de imagen para seleccionar "cambiar el nombre" y exportar imágenes como archivos .tiff.
- Image 30 - 40 células para el análisis de la cuantificación.
5. Procesamiento y Análisis de Imágenes Cuantificación
- Utilice el software de Fiji (http://fiji.sc/Fiji) para procesar imágenes y llevar a cabo la cuantificación.
- Trazar los gráficos de intensidad de fluorescencia.
- Para visualizar mejor si la expresión PPC / YFP esuniformemente distribuida, Fiji utilizar para demostrar la potencia de la señal de PPC y YFP lo largo de la periferia de la célula. Para lograr esto, primero lanzar Fiji a continuación, seleccione "Archivo" y "Abrir" para iniciar la imagen. Haga clic en "línea" en el menú de herramientas y seleccione "línea segmentada" haciendo clic derecho. Decidir la región de interés y trazar una línea a lo largo de la periferia de la célula para rastrear la PPC o la señal de YFP (Figura 3A-C).
Nota: Fiji mide el valor de la intensidad de fluorescencia absoluta a lo largo de las líneas segmentadas. - Seleccione el menú desplegable "Analizar" y "Lote perfil" para generar un gráfico con los valores de posición e intensidad que representan los niveles de PPC / YFP a lo largo de la línea segmentada. Si se desea, duplicar los valores de intensidad (seleccionando el menú "Copiar") en Excel u otro software gráfico para generar gráficos de intensidad comparable.
- Para visualizar mejor si la expresión PPC / YFP esuniformemente distribuida, Fiji utilizar para demostrar la potencia de la señal de PPC y YFP lo largo de la periferia de la célula. Para lograr esto, primero lanzar Fiji a continuación, seleccione "Archivo" y "Abrir" para iniciar la imagen. Haga clic en "línea" en el menú de herramientas y seleccione "línea segmentada" haciendo clic derecho. Decidir la región de interés y trazar una línea a lo largo de la periferia de la célula para rastrear la PPC o la señal de YFP (Figura 3A-C).
- Cuantificar el grado de polaridad.
- Recoger aproximadamente 20 represencélulas tativos de 3 experimentos replicados para evaluar el grado de polaridad del PPC y YFP en células de tabaco. Calcule el grado de polaridad en base a la relación de la intensidad de fluorescencia alta (definida como H) sobre la intensidad de fluorescencia baja (definido como L). Nota: El método de cuantificación se explica en la Figura 3.
- Para medir los valores de H y L, trazar una línea segmentada a lo largo de la región interesados en la periferia de la célula (descrito anteriormente), haga clic en "Analizar" en el menú desplegable, y luego seleccione "Medición". Cuando un "Resultados" ventana aparece, utilice "Mean" valores para llevar a cabo la cuantificación.
- A partir de las células que muestran expresión relativamente uniforme de PPC y YFP, por ejemplo, CFP-BASL (Figura 3A) o la YFP complementan de la co-expresión de DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3B), obtener los valores de H y L midiendo seleccionados de manera aleatoria segmentos periféricos con la misma longitud. <li> A partir de las células que muestran la acumulación polar evidente de proteínas fluorescentes, en este caso, la co-expresión de CFP-BASL, DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP (Figura 3C), recoger los valores de H de las regiones periféricas con señales de fluorescencia enriquecidos y los Ls de las regiones con baja acumulación / fluorescencia.
- Se combinan las proporciones resultantes de H / L de 20 células juntos y las pruebas para la distribución normal. Calcular los valores de p de la prueba t de Student (para distribución normal) o la prueba de Kolmogorov-Smirnov (KS) (para su distribución no normal).
- Recoger aproximadamente 20 represencélulas tativos de 3 experimentos replicados para evaluar el grado de polaridad del PPC y YFP en células de tabaco. Calcule el grado de polaridad en base a la relación de la intensidad de fluorescencia alta (definida como H) sobre la intensidad de fluorescencia baja (definido como L). Nota: El método de cuantificación se explica en la Figura 3.
- Trazar los gráficos de intensidad de fluorescencia.
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Representative Results
Para evitar la muerte celular inducida por la señalización de MAPK hiperactivo, se utilizaron las versiones inactivas de quinasa de YDA (DNyda) y MPK6 (DNmpk6) en el ensayo de co-expresión en células de tabaco. Ni la interacción entre DNyda y DNmpk6 revelado por sí ni BiFC patrón de distribución desigual generado (Figura 3A-B) CFP-BASL. Sin embargo, cuando CFP-BASL se introdujo en el par de interacción DNyda-DNmpk6, tanto las señales de YFP PPC y se redistribuyeron en una manera altamente polarizado (Figura 3C). Esta redistribución sugiere que BASL interactúa con YDA y MPK6 a espacialmente reorganizar la vía de señalización MAPK en células vegetales. El estado de fosforilación de BASL tiene efectos diferenciales en el grado de polaridad de la señalización de MAPK: una versión fosfo-imitando de BASL generada muy fuerte polaridad, mientras que una versión fosfo-deficientes mostró que la actividad más débil 6. Estos datos apoyaron nuestro modelo de trabajo de una regulación de la retroalimentación positiva entre BASL y la vía YDA-MAPK en la generación de la polaridad celular 6.
Figura 1. Esquema de la polaridad Complejo BASL-YDA-MPK6 Durante los estomas celular asimétrica División (ACD) en Arabidopsis. En la epidermis de las hojas, el linaje de los estomas inicia a partir de células protodermal, que se expanden para convertirse en células precursoras de ACD, las células madre meristemoide (MMC). Un MMC se somete a un ACD para crear una meristemoide y uno SLGC (estomática célula suelo linaje), que puede dividirse y finalmente diferenciarse en células de guarda de los estomas y células de pavimento, respectivamente. En la corteza celular de las células precursoras de ACD (MMC), BASL recluta dos componentes de una vía MAPK, la MAPKKK YDA y la MAPK MPK6, para formar un complejo de polaridad y regulan estomática ACD.om / archivos / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diagrama del procedimiento de inyección de tabaco en hoja epidermis. (A) Transformación de los plásmidos que albergan PPC-BASL, DNyda-NYFP, DNmpk6-cYFP y P19 en Agrobacterium tumefaciens GV3101 y crecen en platos de selección respectivos (de arriba a abajo en UN). (B) Recogida de colonias (A) para inocular un cultivo líquido para el crecimiento durante la noche. Células (C) de la cosecha por hilado y decantar el sobrenadante. Después de pipeteado brevemente y lavar los pellets, centrifugar las células de nuevo. (D) Vuelva a suspender y diluir los sedimentos celulares con la solución de infiltración (ver el protocolo) para lograr el final OD 600 = 0,5. (E) mezclar suavemente THcélulas e re-suspendidas en una placa de Petri. (F) el uso de una jeringa sin aguja para empujar la mezcla de infiltración en el lado abaxial de las hojas de tabaco. (G) Sobre 48 hr después de la infiltración, las hojas están listos para la formación de imágenes confocal. discos de hoja Impuestos Especiales que contiene células infectadas con una perforadora alrededor de la región de infiltración. Los círculos de guiones indican cortaron discos de licencia. (H) Use agua para montar los discos de hojas en un portaobjetos estándar para la imagen confocal. Los diagramas de caja en el área sombreada describen las proteínas inyectadas en hojas de tabaco para el ensayo de polarización. Tamaños proteínas no son a escala. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Visualización y cuantificación de Formación de polaridad. (AC) Confocal para mostrar PPC y YFP fluorescencia en las células epidérmicas de tabaco. Cian indica la expresión de la PPC. El amarillo indica la expresión de YFP. (A) La sobreexpresión de PPC-BASL solo. (B) Co-expresión de DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP. La expresión YFP se complementa cuando interactúan dos proteínas. (C) La co-expresión de PPC-BASL, DNyda-NYFP y DNmpk6-cYFP. La distribución desigual (polaridad) es evidente tanto para PPC y YFP. Barra de escala = 50 micras de (AC). (DF) Gráficamente el trazado de la intensidad de fluorescencia PPC / YFP lo largo de las líneas de puntos (magenta) en (AC). triángulos magenta marcan el punto de las regiones utilizadas para trazar la intensidad de inicio y fin. Cuantificaciones del grado de polaridad en las células de tabaco se presentan debajo. Los valores de intensidad de fluorescencia (H y L para alta para la baja) se miden y se recogieron por Fiji desde las regiones trazadas con da rojaarrojar en líneas (CA). Para cada muestra, los valores de 20 células se promedian para la prueba de significación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Uso General y posibles modificaciones del sistema de expresión transitoria del tabaco para la transducción de señales: La sobreexpresión de la proteína fluorescente (FP)-etiquetados proteínas en la epidermis de tabaco ha sido utilizado con éxito para el examen rápido de la localización subcelular de proteínas en las células vegetales. Sin embargo, el estudio de distribución de señalización dinámica del complejo de la proteína in planta es un tema difícil debido a los contextos subcelulares complicado, interacción proteína-proteína transitoria y eventos de transducción de señales. Para hacer frente a este reto, nos aprovechamos del sistema BiFC para examinar los eventos de señalización de MAPK. Por co-expresión de YDA-NYFP y MPK6-cYFP, la señal de YFP recuperado indicó que la activación del relé de señalización MAPK se puede producir en la membrana plasmática.
Sería ideal para co-Express con fluorescencia etiquetados YDA y MPK6 en Arabidopsis y examinar la señalización de MAPK dinámico in vivo. Sin embargo, generating plantas transgénicas consume mucho tiempo, particularmente cuando se desea más de un constructos. Proteína expresión transitoria en células de tabaco puede ser una prueba preliminar rápido para la expresión in vivo en Arabidopsis y otras plantas. La otra ventaja de que el sistema de expresión transitoria de tabaco ofrece, pero no se puede conseguir fácilmente mediante la generación de plantas transgénicas, es que las proteínas de hasta 4 o 5 de fusión se pueden co-expresaron simultáneamente y examinadas por microscopía confocal cuando la combinación es alcanzable.
El uso de células epidérmicas de tabaco para investigar la señalización de MAPK en las células vegetales se puede implementar además a otras vías de señalización y bajo diferentes condiciones ambientales. Por ejemplo, sería la interacción de YDA-MAPK cambiar su intensidad o localización cuando la célula que expresa se trata con H 2 O 2 local de aplicación (un estímulo de señalización MAPK)? Tales ensayos se pueden diseñar de forma rápida y llevan a cabo para abordar specpreguntas IFIC. Existen múltiples miembros en cada nivel de las cintas de MAPK (3 - 4 niveles en general), pero ¿cómo se consigue la especificidad de señalización en plantas o en otros sistemas siguen siendo en gran parte desconocido. Al hacer que diferentes combinaciones de MAPKKK con MAPKKs, o MAPKKs con MAPKs, el sistema de expresión transitoria de tabaco permite un análisis relativamente a gran escala, no sólo de la interacción proteína-proteína, pero también la organización espacial de la flujo de señalización en células vegetales.
Personalizado Co-expresión y BiFC Ensayo para la Investigación de la polarización Proteína: Una pregunta fundamental de larga data en la biología celular es la forma en vías de señalización universales, por ejemplo, las MAPK, logran su especificidad en cierta etapa de desarrollo o bajo condiciones ambientales particulares. Co-expresión de la proteína BASL polaridad con los componentes de BiFC YDA y MPK6 en células de tabaco nos ha permitido demostrar que la interacción YDA-MAPK y la señalización está espacialmente re-distributed por la presencia de BASL, a las proteínas de polaridad específicos durante estomática ACD. Por lo tanto, la especificidad de señalización YDA-MAPK se puede lograr por la interacción con BASL para promover la polaridad celular y la división asimétrica.
Aunque no es un fenómeno universal, un buen número de proteínas se han encontrado para ser distribuida de manera desigual en células de plantas, por ejemplo, 15, proteínas pequeña GTPasa ROPs auxina effluxer PIN 16 y sus reguladores 17, transportistas de boro 18 y algunas proteínas desconocidas (Octopus 19 , POLAR 20 y BRX 21). Este protocolo no tenía la intención de buscar los socios genéticos o físicos en una vía de polarización, las proteínas, pero es probable que sea útil para probar si las proteínas que interactúan con ROPS, PIN u otras personas pueden formar un complejo de polaridad en las células vegetales. Sin embargo, cuando se trata de simular un evento de polarización utilizando células de tabaco, hay que tener en cuenta que las complicacionespuede ocurrir en los ensayos. Por ejemplo, el evento Arabidopsis polarización no puede ser recapitulado en células de tabaco, en particular cuando se requieren más componentes de lo que se pueden acomodar en el ensayo. Algunas moléculas desconocidas derivados del fondo del tabaco, no necesariamente las proteínas objeto de examen, pueden estar involucrados en la inducción de un evento de polarización. Por lo tanto, es esencial para establecer estrictas experimentos de control en el tabaco y para validar los datos de Arabidopsis o de otras plantas.
Elementos clave para tener éxito en los experimentos: En primer lugar, las plantas de tabaco verdes y sanas deben ser utilizados. Dado que la cuantificación análisis deben combinar los datos de diversas células, es fundamental utilizar próspera plantas de tabaco con células sanas constantemente. En segundo lugar, las células que expresan niveles de proteína medianas deben usarse para formación de imágenes confocal. bajos niveles de expresión no pueden proporcionar las proteínas suficientes para el ensayo y la expresión saturada levels serían enmascarar el efecto de polarización / translocación.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
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