Abstract
canlı hücrelerde dinamik sinyal olaylarının Görselleştirme bir meydan okuma olmuştur. Bu, bitki hücrelerinde sinyal transdüksiyonu uzaysal dağılımının izlenmesi için test protein-protein etkileşimi kurulu bir geçici ifade sisteminin tütün epidermal hücrelerinde biyomoleküler floresan tamamlama (BiFC) deneyi genişletilmiştir. Bu protokol, etkileşimi ve Arabidopsis MAPKKK Yoda ve MAPK6 arasındaki sinyal plazma membranında meydana göstermek için BiFC tahlili kullanılmıştır. çatgı proteini BASL birlikte ifade edildiğinde Yoda-MAPK etkileşimi dağıtılabilir ve mekansal CFP-BASL ile birlikte polarize. Bu modifiye tütün sentezleme sistemi lokalizasyonu ve dinamik değişiklikleri (az 4 gün) ve floresan protein renk (en az üç) çarpanı ağırlayacak sinyalizasyon hızlı inceleme için izin verir. Biz de protein dağılımı (asimetrik mekansal lokalizasyonu, ya da "kutuplaşma" ölçmek için ayrıntılı yöntemler sundu;), Tütün hücrelerinde. Bu gelişmiş tütün ifade sistemi, canlı bitki hücrelerinde dinamik sinyal olaylarının hızlı test için yaygın olarak kullanılan bir potansiyele sahiptir.
Introduction
Proteinler öngörülemeyen hücresel ortamda meydana gelen neredeyse tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır karmaşık bir hiyerarşik ağ ve form kompleksleri içinde etkileşimde. Ancak, büyüme yanıtları bitki gelişiminden, sadece hızlı değil, aynı zamanda etkin bir şekilde hücre içi düzeyde bu dinamik sinyal olaylarını tespit etmek ve izlemek edemez uygun araçlardan bir eksikliği vardır.
Tütün yaprağı epidermis geçici protein sentezleme sistemi canlı hücrelerin floresan proteinleri görselleştirmek için avantajlar cazip gelmiştir. Bu sistem post-translasyonel protein modifikasyonu ve protein lokalizasyonu hızlı incelenmesine olanak yarı in vivo koşulları sağlar. tamamlanmaktadır YFP sinyal inceleyerek, bimoleküler flüoresan tamamlama (BiFC) deneyi, bitki hücrelerinde protein-protein etkileşimi olasılığı bildirir. Diğer yöntemler, örneğin, maya-iki hibrid (Y2H) ve CO ile karşılaştırıldığında-immunoprecipitation (Co-IP) BiFC, protein-protein etkileşimleri hücre içi seviyede oluşabilir bölmeleri görselleştirme güçlü bir yol temin etmektedir.
Asimetrik hücre bölünmesi (ACD) doku / organ oluşumu için yeni bir hücre tipleri oluştururken hücre popülasyonu kök tutar için, ökaryotik multicellularity teşvik etmek için vazgeçilmez bir mekanizmadır. Arabidopsis stoma gelişimi bitkilerde ACD çalışmak için bir model sistem olarak kullanılmıştır. öncü hücre, Meristemoid anne hücresi, asimetrik bölmek ve içine ayırt edebilir (ve bir stoma soy zemin hücre (SLGC) (bekçi hücreleri bir çift içine sonlandırmadan önce hücre benzeri bölünmeleri kök uğrar), bir Meristemoid iki farklı kızı hücreler üretmek için bölen bir kaldırım hücresi), sırasıyla (Şekil 1). stoma ACD olarak, Stoma Lineage içinde Asimetrisinin yeni protein Kırma (BASL) inc hangi bölünme asimetrilerini sürücü premitotically polarizelude fiziksel asimetri ve hücre kaderi asimetri 1. MAPKKK YODA ve MAPK, MPK3 ve 6 oluşan bir MAPK kaskad stoma bölümü desen ve kader kabulü 2,3, 4,5 için merkezi.
Son zamanlarda, Zhang ve diğ. ACD 6 stoma Arabidopsis YDA-MAPK sinyal yoluna polarite protein BASL bağlı. kanonik YODA-MAPK yolağı, MPK3 / 6'ya kadar, BASL fosforile ve kutuplaşma aktive eder. Fosforile BASL bir iskele olarak fonksiyonları ve YODA (YDA) ve MPK3 / 6 acemi bir protein kompleksi oluşturmak ve hücre korteks 6 da sinyalini konsantre. MAPK bileşenleri ve BASL ve YDA-MAPK yolağı arasındaki pozitif geri besleme döngüsü Polarizasyon bitki hücrelerinde protein kutuplaşma için yeni bir mekanizmayı temsil etmektedir. Yerel olarak zenginleştirilmiş MAPK sinyal yakından stoma ACD 6 hücre kaderi farklılaşma (Şekil 1) bağlantılı olduğu varsayılmaktadır. k birBu model desteklenen ey deneysel veriler BASL 6 ekspresyonu ile sebep olunan MAPK mekansal yeniden dağıtım gösterdi tütün tahlilleri geldi.
MAPK molekülleri genellikle hücrenin içine her bulunduğu için, MAPK sinyal meydana geldiği, genel olarak, takip etmek kolay değildir. Bu çalışmada, biz sinyal rölesi oluştuğu önermek yukarı kinaz ve aşağı olanlar arasındaki etkileşimi görselleştirmek için bölünmüş YFP sistemi kullanılmaktadır. Bu, ek olarak BiFC sisteminin kullanımı uzatılmış birlikte ifade (protein-protein etkileşimi göstermektedir) bölünmüş YFP çift üçüncü bir proteini (CFP-etiketli) tamamlanmaktadır YFP uzamsal CO- ile modüle edilebilir ve bunun nasıl görselleştirmek CFP proteini ifade etmiştir. Bu şekilde, Tütün Epiderm hücre kortekste polarize dokusuna da dağıtım YDA ve MPK6 arasındaki etkileşimlerin uzaysal yeniden düzenlenmesi neden CFP-BASL bu ko-ifadesini gösterdial hücreleri. Bu sistem, bu nedenle hücre dahili veya harici stimuli ile meydan zaman koşulları altında, bitki hücrelerinde, dinamik sinyal olaylarını izlenmesi için geliştirilecek bir potansiyele sahip (örneğin, başka proteinler, kimyasal uygulama, patojen saldırısı ya da çevresel değişiklikler, vb birlikte ifadesi. ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid Yapı
- Daha önce 1,6 açıklandığı gibi teknoloji klonlama yoluyla yapıları oluşturmak.
- İlk BASL kodlama dizilerini amplifiye etmek için uygun olan primerler ile yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak, YDA ve MPK6 ve giriş vektörleri içine alt klonlanması. 7'de ayrıntılı protokol bulun.
- (Sırasıyla DNmpk6 8 ve DNyda 4) MPK6 ve YDA baskın negatif sürümlerini oluşturmak için şablon olarak MPK6 ve YDA giriş plazmidleri kullanmak ve bölgeye yönelik mutajenez yöntemi 9 ile nokta mutasyonlar.
- PH35CG 10 içine BASL entegre standart LR (attL x attR rekombinasyon) reaksiyonları (7 ayrıntılı prosedürü) yürütmek, tütün geçici deneyleri için yapıları inşa etmek, DNyda ve pXNGW içine DNmpk6 ve pXCGW sırasıyla 11 vektörleri.
- enzim sindirimi ve dizileme ile elde edilen plazmidler teyit edin. Bir kez successful Agrobacterium GV3101 ırkına 12 tumefaciens içine ikili yapılar dönüştürmek ve 2 28 ° C 'de seçme plakaları üzerinde büyümek - 3 gün.
Agrobacterium Sızma Çözüm 2. Hazırlık
- Inşa pH35CG, pXNGW ve pXCGW için 100 ug / ml Luria-Bertani (LB), uygun antibiyotik ile birlikte ortam 10 ml taze bir kaç transforme edilmiş Agrobacterium koloniler inoküle (gentamisin 25 ug / ml, Rifamisin 25 ug / ml, spektinomisin, aynı konsantrasyonlar P19 için Kanamisin 50 ug / ml gentamisin ve rifamisin (transgenik susturma karşı proteinleri eksprese) 13.
- Yaklaşık 16 saat boyunca 200 rpm hızda 28 ° C çalkalayıcı Agrobacterium kültürleri büyür ve sonra (1.5 ulaştığı tahmin - 1.8) OD 600 ölçümü (Şekil 2A-B). 10 dakika boyunca 2.500 xg'de kültürleri aşağı doğru döndürün. Yeniden askıya ve waMgCl 2 10 mM (infiltrasyon çözeltisi) ile hücre pelletleri sh.
- Yine kültürleri aşağı Spin ve nihai OD 600 = 0.5 (Şekil 2C-D) ulaşmak için sızma solüsyonu uygun miktarda pelet yeniden askıya. 3 saat - bitkiler nüfuz etmeden önce, 1, oda sıcaklığında hücre karışımları bırakın. Bu aşama, hücre homeostazının muhafaza edilmesine yardımcı olur.
3. Tütün Fabrikası ve Yaprak Enjeksiyon
- Yaprak enjeksiyon için (16 saat ışık / 8 saat-karanlık döngüleri ile 23 ° C) standart bitki büyüme odasında 5 haftalık 14-4 yetiştirilen tütün bitkileri (Nicotiana benthamiana), kullanın.
Not: Bu aşamada, tütün bitkileri genellikle 6 yaprakları (2 büyük, 2 orta, ve 2 küçük) var. İki orta ölçekli yaprakları yaprak enjeksiyonu (iki küçük olanlar genellikle çok genç iken iki büyük olanlar, çok eski) için en uygun bulunmaktadır. - sızma gün önce, tobac suco bitkiler toprak doyurmak için.
- 3 saat - infiltrasyon günde 1 karanlıkta bitkiler önceden inkübe edin. Bu adım yaprak epidermal hücreler nüfuz zaman büyük ölçüde Agrobacterium kolaylaştıran, epidermis stoma yaygın açmanızı sağlar.
- Yaprakları tarihleri ile etiketlenmiş renk bantları bayrağını kullanarak sızmış olması. Mark alanlar siyah kalın sharpie ile infiltre olması (isteğe bağlı; sızmış alanlar enfekte edildikten sonra görebilir.).
- Agrobacterium yeniden süspansiyon eşit hacimlerde alın ve Hafifçe girdapladıktan (Şekil 2E) ile, 100 x 15 mm Petri kabı içinde karıştırın. NOT: durumda, CFP-BASL 1 ml, 1 DNyda-nYFP ml ve DNmpk-cYFP 1 ml P19 1 ml karışık.
- Infiltrasyonu işlemde, infiltrasyon karışımı ile 3 mi iğnesiz şırınga dolgu (1-2 mi) ve tütün yaprak (Şekil 2F) alt tarafına (eksen dışı) itin. infiltre iken, yararlıitmek için tek bir elinizi kullanın ve diğer yandan hafifçe (itme kuvvetine karşı, adaxial) üst tarafını destekleyecek.
Not: infiltrasyon karışımı başarıyla enjekte edildikten sonra, enfekte alanlar epidermis kolayca tanınabilir hale gelecektir. Ancak, sızma nedeniyle sert enjeksiyon (doku hasarı) ya da yetersiz itme (herhangi bir sıvı penetrasyon) başarısız olabilir. Her bir test için, (çeşitli bitkilerden) iki bağımsız yapraklarda en az iki enjeksiyon göstermektedir. - geri büyüme odasına enfekte bitkiler yerleştirin. Genellikle, protein ekspresyonları 48 saat aşağıdaki sızma sonra saptanabilir.
4. Konfokal Görüntüleme
- (- 4 disk / alan üretilebilir normalde 3) (Şekil 2G) 48 saat sonrası infiltrasyonu at, enjekte edilen bölgede bir yaprak diski çıkarılması için bir delgeç kullanın. yavaşça su damlaları ile bir slayt (yukarı abaxial tarafı) yaprak diskleri aktarmak ve monte etmek için cımbız kullanın. Çok har basılmasını önlemekkapak kayma d sıkılmış / hasarlı hücreler konfokal mikroskop (Şekil 2H) altında iyi göstermez çünkü.
- konfokal görüntüleme önce ifade seviyelerini kontrol etmek için bir epi-floresan bileşik mikroskop üzerine monte örnekleri tarayın. Not: Bizim deneyime dayalı, orta ifade seviyelerini göstermek hücreler en konfokal mikroskop altında temsil edilmektedir.
- konfokal mikroskop 40X (NA 1.3) lens ile başlayın. floresan protein ve orta seviyelerde ifade eden hücreler merkezinde kaldığı şekilde istenen konuma slaydı ayarlayın. OBP ve YFP için uyarma / emisyon spektrumları 458 nm / olan 480-500 nm ve 514 nm / 520 - sırasıyla 540 nm.
- Görüntüler daha sonra en dengeli floresan yoğunluğu / gürültü oranı için lazer yoğunluğu ve akıllı kazancı ayarlamak önizleme "Canlı" düğmesini etkinleştirin. Görüntüleme kalitesini artırmak tarama piksel ve / veya çerçeve / hat ortalamasını artırmak için. Son olarak, rea için odaklama topuzunu ayarlamakch medyan odak düzlemi ve görüntü almak için "Capture" butonuna tıklayınız.
Not: OBP ve YFP görüntüleri veya sırasıyla "sıralı" tarama modu, seçeneği işaretleyerek sırayla veya aynı anda yakalanabilir. - Z-projeksiyon hücrelerinin derinlemesine görünüm için istendiğinde, tarama aralığı derinliğini tanımlamak, "xyz" görüntüleme modunu seçin (10-15 mikron) ve hedef hücrenin alt üst görüntüleri toplamak . seçmek .tiff dosyaları olarak "yeniden adlandırmak" ve ihracat görüntüleri resim dosyası üzerinde sağ tıklayarak Leica yazılımı ile elde edilen görüntüleri derleyin.
- Resim 30 - ölçümü analizi için 40 hücreleri.
5. Görüntü İşleme ve miktarının belirlenmesi Analizi
- görüntüleri işlemek ve kantifikasyonunu yapmak Fiji yazılımı (http://fiji.sc/Fiji) kullanın.
- Floresan yoğunluğu grafikleri çizilir.
- daha CFP / YFP sentezleme olup görselleştirmek içineşit dağıtılmış, hücre çevresi boyunca CFP ve YFP sinyal gücünü göstermek için Fiji kullanın. Bunu başarmak için, öncelikle Fiji ardından resmi başlatmak için "Dosya" ve "Aç" seçeneğini başlatın. aracı menüsünden "çizgi" tıklayın ve sağ tıklayarak "Segment çizgi" seçeneğini seçin. Ilgi bölgeyi karar verin ve CFP veya YFP sinyali (Şekil 3A-C) iz hücre çevresi boyunca bir çizgi çizin.
Not: Fiji dilimli çizgisinde mutlak floresan yoğunluğu değerini ölçer. - Parçalara hattı boyunca CFP / YFP seviyelerini temsil eden pozisyon ve yoğunluk değerleri ile bir grafik oluşturmak için açılır menüyü "Analiz" ve "Plot profili" seçeneğini seçin. İstenirse, karşılaştırılabilir yoğunluk grafikler oluşturmak için EXCEL veya diğer grafik yazılımı içine (menü "Kopyala" seçerek) yoğunluk değerlerini çoğaltmak.
- daha CFP / YFP sentezleme olup görselleştirmek içineşit dağıtılmış, hücre çevresi boyunca CFP ve YFP sinyal gücünü göstermek için Fiji kullanın. Bunu başarmak için, öncelikle Fiji ardından resmi başlatmak için "Dosya" ve "Aç" seçeneğini başlatın. aracı menüsünden "çizgi" tıklayın ve sağ tıklayarak "Segment çizgi" seçeneğini seçin. Ilgi bölgeyi karar verin ve CFP veya YFP sinyali (Şekil 3A-C) iz hücre çevresi boyunca bir çizgi çizin.
- polarite derecesini ölçmek.
- yaklaşık 20 Represen toplamak3 tekrarlı deneyler niteliksel hücreler tütün hücrelerinde CFP ve YFP polarite derecesini değerlendirmek için. (L olarak tanımlanan) düşük floresan yoğunluğu üzerinde (H olarak tanımlanır) yüksek floresan yoğunluğu oranına göre polarite derecesine hesaplayın. Not: ölçme yöntemi Şekil 3'te açıklanmıştır.
- H ve L değerlerini ölçmek için, "Tedbir" açılır menüden "Analiz" ve sonra seçim tıklayın (yukarıda anlatılan) hücre çevresinde ilgi bölge boyunca bir parçalı bir çizgi çizin. Bir "Sonuçlar" penceresi açıldığında, kullanmak miktarının gerçekleştirmek için değerler "ortalama".
- Örneğin CFP ve YFP, nispeten homojen bir ifade gösteren hücrelerden, CFP-BASL (Şekil 3A) ve YFP ölçülmesiyle, H ve L değerlerini elde, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3B) birlikte ekspresyonundan tamamlanmaktadır iki rastgele eşit uzunlukta olan periferik segmentleri seçildi. <li> Bu durumda, floresan proteinleri belirgin polar birikimini gösteren hücrelerden, CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP (Şekil 3C), ko-ekspresyonu zenginleştirilmiş floresans sinyalleri ile çevre bölgelerinden H değerleri toplamak ve düşük / hayır floresan birikimi ile bölgelerden Ls.
- normal dağılım 20 birlikte hücre ve testi, H / L Elde edilen oranları havuz. (Normal dağılım için) Student t testi p değerleri veya (non-normal dağılım için) Kolmogorov-Smirnov (KS) testi hesaplayın.
- yaklaşık 20 Represen toplamak3 tekrarlı deneyler niteliksel hücreler tütün hücrelerinde CFP ve YFP polarite derecesini değerlendirmek için. (L olarak tanımlanan) düşük floresan yoğunluğu üzerinde (H olarak tanımlanır) yüksek floresan yoğunluğu oranına göre polarite derecesine hesaplayın. Not: ölçme yöntemi Şekil 3'te açıklanmıştır.
- Floresan yoğunluğu grafikleri çizilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
hiperaktif MAPK sinyallemesinin başlatılan hücre ölümünü engellemek için, YDA (DNyda) ve MPK6 (DNmpk6) kinaz aktif olmayan ve tütün hücrelerine eş-sentezleme tahlilinde kullanılmıştır. Ne BiFC de CFP-BASL kendisinde oluşturulan düzensiz dağılım deseni (Şekil 3A-B) ortaya DNyda ve DNmpk6 arasındaki etkileşim. CFP-BASL DNyda-DNmpk6 etkileşim çifti girmiştir Ancak, OBP ve YFP sinyalleri hem son derece kutuplaşmış bir şekilde (Şekil 3C) yeniden dağıtılır bulundu. Bu yeniden dağıtım BASL mekansal bitki hücrelerinde MAPK sinyal yolunu yeniden organize etmek YDA ve MPK6 ile etkileşim olduğunu göstermektedir. Bir fosfor eksikliği versiyonu zayıf aktivite 6 gösterdi iken, çok güçlü polarite oluşturulan BASL bir fosfo-taklit versiyonu: BASL fosforilasyon durumu MAPK sinyallerinin polarite derecesine üzerinde farklı etkileri vardır. Bu veriler bir bizim çalışma modeli desteklenen BASL ve hücre polarite 6 üreten YDA-MAPK yolağı arasındaki olumlu geribildirim düzenleme.
Stoma Asimetrik Hücre Bölünmesi Arabidopsis'te (ACD) sırasında BASL-YDA-MPK6 Polarizasyon Kompleksi Şekil 1. diyagramı. Yaprak epidermis ise, stoma nesilli, Meristemoid Anne Hücreleri ACD öncü hücreler haline genişletmek protodermal hücrelerinden başlatır (MMK). Bir MMC bölmek ve sonunda sırasıyla stoma bekçi hücreleri ve kaldırım hücrelerine ayırt edebilir bir Meristemoid ve bir SLGC (stoma soy zemin hücresi) oluşturmak için bir ACD uğrar. ACD öncü hücrelerin (MMK) hücre kortekste, BASL bir MAPK yolunun iki bileşeni acemi, MAPKKK YDA ve MAPK MPK6, bir polarite kompleksi oluşturmak ve stoma ACD düzenler.om / files / ftp_upload / 53790 / 53790fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tütün yaprak epidermis sokma prosedürü Şekil 2. diyagramı. (A) CFP-BASL barındıran plasmidleri dönüşümü, Agrobacterium DNyda-nYFP, DNmpk6-cYFP ve P19 GV3101 Agrobacterium tumefaciens ve yukarıdan aşağıya doğru (ilgili seçme plakaları üzerinde büyümek A). (B) gece boyunca büyümeleri için sıvı kültürü aşılamak için (A) dan koloniler Pick up. Eğirme ve süpernatant süzün (C) Hasat hücreleri. kısaca pipetle ve pelet yıkandıktan sonra, yine hücreleri aşağı doğru döndürün. (D) yeniden askıya ve sızma çözeltisi ile hücre pelletleri sulandırmak (bkz protokolü) son OD = 0.5 600 elde etmek. (E) yavaşça th mixE, bir Petri tabağına hücreler yeniden süspansiyon haline. (F) tütün yapraklarının eksen dışı tarafına sızma karışımı itmek için iğnesiz şırınga kullanın. (G) sızma sonra yaklaşık 48 saat, yapraklar konfokal görüntüleme için hazırız. Tüketim yaprak diskleri sızma bölgenin etrafında bir delik zımba hücreleri enfekte içeren. Kesik çevreler izin diskleri eksize göstermektedir. (H) konfokal görüntüleme için bir standart slayt üzerine yaprak diskleri monte su kullanın. gölgeli alanda kutu diyagramları tütün enjekte proteinler polarizasyon tahlili için bırakır açıklar. Protein boyutları ölçek değildir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Ekran ve Polarite Oluşumunun miktarının belirlenmesi. (AC) Konfokal görüntüleri tütün epidermal hücrelerinde CFP ve YFP floresans gösterir. Mavi CFP ekspresyonunu gösterir. Sarı YFP ekspresyonunu gösterir. Yalnız CFP-BASL (A) aşırı ekspresyonu. (B) DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP birlikte ifadesi. İki protein etkileşim zaman YFP ifadesi tamamlanır. (C) CFP-BASL, DNyda-nYFP ve DNmpk6-cYFP birlikte ifadesi. Dengesiz dağılım (kutupluluk) OBP ve YFP hem de bellidir. Ölçek çubuğu (AC) 'de = 50 um. (DF) Grafiksel kesikli çizgiler (Eflatun) (AC) boyunca CFP / YFP floresan yoğunluğu komplo. Eflatun üçgenler yoğunluk komplo için kullanılan bölgelerin başlangıç ve bitiş noktasını işaretlemek. tütün hücrelerinde polarite derece sayımsal altında sunulmuştur. çiçeklenme yoğunluğu değerleri (düşük yüksek ve L H) kırmızı dekar ile takip bölgelerden Fiji ile ölçülür ve toplanan(AC) satırları döken. Her numune için, 20 hücrelerinden değerler önem testi için ortalaması alınır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genel Kullanım ve sinyal iletimi için Tütün geçiş sentezleme sisteminin olası değişiklikler: floresan proteinin aşırı ekspresyonunu (FP) başarılı bir şekilde, bitki hücrelerinde protein hücre içi lokalizasyonu hızlı inceleme için kullanılmıştır Tütün epidermis proteinleri etiketli. Bununla birlikte, in planta protein kompleksi dinamik sinyal dağılımını incelemek komplike hücre içi ortamlarda, geçici protein-protein etkileşimi ve sinyal transdüksiyon etkinlikleri için zor bir konudur. Bu zorluğu gidermek için, biz MAPK sinyal olayları incelemek için BiFC sisteminin yararlandı. birlikte ifade YDA-nYFP ve MPK6-cYFP, geri kazanılır YFP sinyal MAPK sinyalleme rölesi aktivasyon plazma membranında oluşabilir göstermiştir.
Bu ideal olacaktır co-express floresan YDA ve MPK6 Arabidopsis ve in vivo dinamik MAPK sinyalini incelemek için etiketledi. Bununla birlikte, GETransgenik bitkilerin nerating birden fazla yapıları arzulandığında, zaman alıcıdır. Tütün hücrelerde protein geçici ifade Arabidopsis ve diğer bitkilerde, in vivo ifadesi için hızlı bir ön test olabilir. Tütün geçiş sentezleme sistemi sunar, ancak kolay bir transgenik bitkilerin üretilmesiyle elde edilemez, diğer bir avantajı, en fazla 4 veya 5 füzyon proteinleri, aynı anda, birlikte ifade edilen ve kombine elde olduğunda konfokal mikroskopla incelenmiş olmasıdır.
Bitki hücrelerinde, MAPK sinyal araştırmak için, tütün epidermal hücreleri kullanılarak daha fazla diğer sinyal yollarının ve farklı çevre koşulları altında gerçekleştirilebilir. Eksprese eden hücre yerel H 2 O 2 uygulama (a MAPK sinyal uyaran) ile tedavi edilir Örneğin, YDA-MAPK etkileşimi yoğunluğunu veya konumunu değiştirmek istiyorsunuz? Bu gibi deneyler, hızlı bir şekilde tasarlanmış ve spec gidermek için gerçekleştirilebilirIFIC sorular. Birden fazla üye MAPK kasetlerinin her katman var (3 - Genel olarak 4 katlı), ama nasıl sinyal özgüllük tesisleri veya diğer sistemlerde elde edilir ölçüde bilinmemektedir. MAPK ile MAPKKs veya MAPKKs ile MAPKKKs farklı kombinasyonlarını yaparak, Tütün geçiş sentezleme sistemi, sadece protein-protein etkileşimi, nispeten büyük çaplı bir analizi, aynı zamanda, bitki hücrelerindeki sinyal akışı mekansal organizasyon sağlar.
Protein Polarizasyon Soruşturma Eş ifade ve BiFC Testi Özelleştirilmiş: hücre biyolojisinde bir uzun süredir temel soru evrensel sinyal yolları, örneğin, MAPK'lar, belli bir gelişim aşamasında ya da belirli çevre koşulları altında kendi özgüllüğü elde nasıl. Eş-sentezleyen tütün hücre YDA ve MPK6 bölgesinin BiFC bileşenleri ile kutup proteini BASL US YDA-MAPK etkileşimi ve sinyal uzaysal olarak re-d göstermek için sağladıBASL varlığında stoma ACD boyunca belirli bir polarite proteinleri tarafından istributed. Bu nedenle, YDA-MAPK sinyal özgüllük hücre polarite ve asimetrik bölünmesini teşvik etmek BASL ile etkileşim sağlanabilir.
Evrensel bir olay değildir, ancak, oldukça az protein eşit bitki hücrelerinde, dağıtılmak üzere tespit edilmiştir, örneğin, küçük bir GTPaz ROP 15, oksin effluxer PIN proteinleri 16 ve regülatör 17, boron taşıyıcıları 18 ve bilinmeyen bir protein (ahtapot 19 POLAR 20 ve BRX 21). Bu protokol belirli bir protein polarizasyon yolunun genetik ve fiziksel ortak arama amaçlanmamıştır, fakat büyük olasılıkla ROP, PIN ya da başkaları ile etkileşime giren proteinlerin bitki hücrelerinde bir polarite kompleks oluşturabilmektedir olup olmadığını test için yararlı olacaktır. tütün hücrelerini kullanarak bir polarizasyon olayı simüle etmek için çalışırken Ancak bir o komplikasyonlar tutmalıtahlillerde ortaya çıkabilir. Daha fazla bileşen deneyde yerleştirilebilir olandan gerekmektedir, örneğin Arabidopsis polarizasyon olayı, özellikle de tütün hücrelerine değinmeyecek olabilir. Tütün arka, ille de inceleme altındaki proteinlerden türetilen bazı bilinmeyen moleküller, bir polarizasyon etkinliği indüklenmesinde dahil olabilirler. Nedenle, tütün sıkı kontrol deneyleri kurmak ve Arabidopsis ya da diğer bitkilerde verileri doğrulamak için gereklidir.
Öncelikle, yeşilimsi ve sağlıklı tütün bitkileri kullanılmalıdır: Temel Unsurları Deneyler başarılı olmak. miktar, çeşitli hücrelerden veri havuzuna ihtiyaç analizleri yana, sürekli olarak sağlıklı hücreler ile tütün bitkileri gelişen kullanmak çok önemlidir. İkinci olarak, ortalama protein seviyelerini ifade eden hücrelerin konfokal görüntüleme için kullanılmalıdır. Düşük ifade seviyeleri tahlil için yeterli protein ve doymuş sentezleme l sağlamayabilirevels polarizasyon / translokasyon etkisini maskeleyebilir olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25 x 75 mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24 x 50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40X objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO, NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
References
- Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
- Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
- Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
- Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4 (2008).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
- Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
- Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
- Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
- Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
- Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
- Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
- Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
- Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
- Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).
