Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em> Xenopus</em> Nyre

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

Den embryoniske nyre fra Xenopus laevis (frog), de pronephros, består af et enkelt nephron, og kan anvendes som en model for nyresygdom. Xenopus embryoner er store, udvikle eksternt, og kan nemt manipuleres ved mikroinjektion eller kirurgiske procedurer. Desuden er der etableret skæbne kort for tidlige Xenopus embryoner. Målrettet mikroinjektion i den enkelte blastomer, som til sidst vil give anledning til et organ eller væv af interesse, kan anvendes til selektivt overudtrykke eller vælte genekspression under denne begrænset område, faldende sekundære virkninger i resten af ​​det udviklende foster. I denne protokol, beskriver vi, hvordan man udnytter etablerede Xenopus skæbne kort til at målrette udviklingen af Xenopus nyre (de pronephros), gennem mikroinjektion i specifikke blastomer af 4- og 8-celle embryoer. Injektion af slægt sporstoffer tillader kontrol af specifik målretning af injektionen.Efter embryoner har udviklet til at iscenesætte 38-40, hel-mount immunfarvning bruges til at visualisere pronephric udvikling, og kan vurderes bidraget med målrettede celler til pronephros. Den samme teknik kan tilpasses til at målrette andre vævstyper i tillæg til de pronephros.

Introduction

Xenopus embryoniske nyre, de pronephros, er en god model til undersøgelse af nyre udvikling og sygdom. Embryonerne udvikler eksternt, er store i størrelse, kan produceres i store antal, og er let manipuleres gennem mikroinjektion eller kirurgiske procedurer. Desuden er generne for nyre udvikling i pattedyr og padder bevares. Pattedyr nyrer fremskridt gennem tre faser: de pronephros, mesonephros og metanephros ^1, mens embryonale padder har en pronephros og voksne padder har en metanephros. Den grundlæggende filtrering enhed af disse nyre former er nephron, og begge pattedyr og padder kræver de samme signalering kaskader og induktive begivenheder til at gennemgå nephrogenesis ^{2, 3.} De Xenopus pronephros indeholder en enkelt nephron består af proksimale, mellemliggende, distal og tilslutning tubuli, og en glomus (analog med den mammale glomerulus) ^{1, 4-6} (figur 1 </strong>). Det enkelte, store nephron stede i Xenopus pronephros gør den velegnet som en simpel model til undersøgelse af gener involveret i nyre udvikling og sygdomsprocesser.

Cell skæbne maps er blevet etableret for tidlige Xenopus embryoner, og er frit tilgængelige online på Xenbase ^7-11. Her beskriver vi en teknik til mikroinjektion af afstamning sporstoffer at målrette udviklingslandene Xenopus pronephros, selvom den samme teknik kan tilpasses til at målrette andre væv, såsom hjerte eller øjne. Lineage sporstoffer er etiketter (herunder vitale farvestoffer, fluorescensmærkede dextraner, histokemisk detekterbare enzymer og mRNA, der koder fluorescerende proteiner), der kan injiceres i en tidlig blastomer, tillader visualisering af afkommet af denne celle under udvikling. Denne protokol udnytter MEM-RFP-mRNA, der koder for membran målrettet rødt fluorescerende protein ¹² som en slægt sporstof. Den målrettede mikroinjektion technikker for individuelle blastomerer i 4- og 8-celle embryoer her beskrevne kan anvendes til injektion med morpholinos at vælte genekspression, eller med eksogent RNA at overudtrykke et gen af ​​interesse. Ved indsprøjtning i den ventrale, vegetabilsk blastomer, primært pronephros af embryo vil blive målrettet, forlader kontralaterale pronephros som en udviklingsmæssig kontrol. Co-injektion af et sporstof kontrollerer, at den korrekte blastomer blev injiceret, og viser, hvilke væv i fosteret opstod fra den injicerede blastomer, verificere målretning af de pronephros. Immunfarvning af de pronephros tillader visualisering af, hvor godt de pronephric tubuli er målrettet. Overekspression og Knockdown effekter kan derefter scorede mod den kontralaterale side af embryo, der tjener som en udviklingsmæssig kontrol, og kan bruges til at beregne den pronephric indeks ^13. Tilgængeligheden af ​​celle skæbne maps tillader det målrettede mikroinjektion, der skal anvendes til at målrette væv OTHis end pronephros og co-injektion af et fluorescerende sporstof tillader målrettet mikroinjektion til hver væv, der skal verificeres inden analyse.

Under embryo mikroinjektion, bør udviklingsmæssige temperatur reguleres stramt, da antallet af Xenopus udvikling er meget afhængig af det ^14. Embryoner skal inkuberes ved køligere temperaturer (14-16 ° C) i 4 og 8-celle injektioner, fordi udviklingstiden bremses. Ved 22 ° C, udviklingstid fra trin 1 (1 celle) til fase 3 (4-celler) er ca. 2 timer, mens ved 16 ° C udviklingstid til fase 3 er ca. 4 timer. Det tager ca. 15 minutter at gå fra en 4-celle embryon til en 8-celle (trin 4) embryo ved 22 ° C, men tager cirka 30 minutter ved 16 ° C. Tilsvarende ved 22 ° C, det tager kun 30 minutter for en 8-celle foster at gå videre til en 16-celle embryo (fase 5). Denne gang er forøget til 45 minutter ved 16 ° C. DetDerfor indgår, er det nyttigt at bremse udviklingen hastigheden af ​​embryonerne at muliggøre tilstrækkelig tid til injektioner på 8 celler fase før embryonerne videre til det 16-celle stadiet. Derudover kan temperaturen vækst moduleres til at fremskynde eller forsinke fosterudviklingen, indtil nyrerne har fuldt udviklet.

Epidermis af haletudse-trins Xenopus embryoer er forholdsvis gennemsigtig, giver mulighed for nem billeddannelse af udviklingslandene pronephros uden dissektion eller clearing af vævet ^15. På grund af den relative gennemsigtighed Xenopus embryoer, levende celler er også muligt ^16,17. Whole-mount immunfarvning at visualisere pronephros er muligt med etablerede antistoffer, som mærker den proksimale, mellemliggende, distal og forbinder tubuli af fase 38 – 40 embryoner, der giver mulighed for vurdering af pronephric udvikling efter målrettet manipulation af genekspression i Xenopus embryoer ^18-20.

Protocol

Følgende protokol er godkendt af University of Texas Health Science Center på Houstons Center for Laboratory Animal Medicine Trivsel udvalg, der tjener som Institutional Care og brug Udvalg (protokol #: HSC-AWC-13-135). 1. Identifikation og udvælgelse af blastomererne for Nyre målrettet Injektioner Forud for at generere embryoner, bruge Normal Table of Xenopus Development 21 at forstå orienteringen af de tidlige celledelinger i embryoet. Alternativt adgang diagrammer over de t…

Representative Results

Mikroinjektioner af 4- og 8-celle Xenopus embryoer med MEM-RFP mRNA viser forskellige niveauer af målretning til de pronephros. Figur 4 viser trin 40 embryoner med korrekte MEM-RFP mRNA ekspressionsmønstre. Embryoner blev injiceret i den venstre ventrale blastomer (figur 4A), og sorteret til den korrekte ekspressionsmønster af MEM-RFP mRNA. Ud over at udtrykke MEM-RFP i den proximale, mellemliggende, distal og forbindende tubuli i nyren, forv…

Discussion

Målretning af pronephros udvikle Xenopus embryoer afhængig identificere og injicere den korrekte blastomer. Injektion af V2 blastomer 8-celle embryoer er rettet mod venstre pronephros ^18. Dette efterlader kontralaterale rigtige pronephros som en intern kontrol. Hvis morpholino knockdown eller RNA-overekspression bruges til at ændre nyre udvikling, kan den kontralaterale højre pronephros anvendes til at sammenligne virkningerne af gen knockdown eller overekspression fra venstre i pronephros. I det…

Materials

Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional – for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional – for clearing embryos