Abstract
Il rene embrionale di Xenopus laevis (rana), le pronephros, costituito da un unico nefrone, e può essere usato come modello per malattie renali. Embrioni di Xenopus sono grandi, sviluppano esternamente, e possono essere facilmente manipolati da microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, le mappe destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus. microiniezione mirata nella blastomere individuo che alla fine darà origine a un organo o tessuto di interesse può essere usata per iperespressione selettivamente o abbattere l'espressione genica all'interno di questa regione ristretta, diminuendo gli effetti secondari nel resto dell'embrione in via di sviluppo. In questo protocollo, si descrive come utilizzare le mappe di Xenopus destino stabilito di indirizzare il sviluppo di Xenopus rene (i pronephros), tramite microiniezione in specifiche blastomeri di embrioni a 4 e 8 celle. Iniezione di traccianti lineage permette la verifica del targeting specifico dell'iniezione.Dopo gli embrioni si sono sviluppati a mettere in scena 38-40, tutto il montaggio immunostaining viene usato per visualizzare lo sviluppo pronephric, e il contributo da parte delle cellule mirati alle pronephros può essere valutata. La stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tipi di tessuto oltre ai pronephros.
Introduction
Il rene embrionale di Xenopus, i pronephros, è un buon modello per lo studio dello sviluppo dei reni e le malattie. Gli embrioni sviluppano esternamente, sono di grandi dimensioni, può essere prodotto in grandi quantità, e sono facilmente manipolati tramite microiniezione o procedure chirurgiche. Inoltre, i geni che regolano lo sviluppo del rene nei mammiferi e anfibi sono conservati. Reni mammiferi progredire attraverso tre fasi: Pronefro, mesonefro e metanefro 1, mentre gli anfibi embrionali hanno un pronephros e anfibi adulti hanno una metanefro. L'unità di filtraggio di base di queste forme di rene è il nefrone, ed entrambi i mammiferi e gli anfibi richiedono la stessa cascate di segnalazione ed eventi induttivi di sottoporsi nefrogenesi 2, 3. Le pronephros Xenopus contiene un singolo nefrone composto da prossimale, intermedio, distale e collegamento tubuli, e un glomo (analogo al glomerulo mammiferi) 1, 4-6 (Figura 1 Xenopus lo rende adatto come un semplice modello per lo studio dei geni coinvolti nei processi di sviluppo renale e malattie.
Mappe cellulare destino sono stati stabiliti per i primi embrioni di Xenopus, e sono liberamente disponibili online all'indirizzo Xenbase 7-11. Qui, descriviamo una tecnica per microiniezione di rivelatori di derivazione per indirizzare le sviluppo pronephros Xenopus, anche se la stessa tecnica può essere adattato per indirizzare altri tessuti come il cuore o gli occhi. traccianti Lineage sono etichette (tra cui coloranti vitali, destrani fluorescente, enzimi istochimicamente rilevabili, e mRNA che codifica per proteine fluorescenti) che possono essere iniettati in un blastomero precoce, che permette la visualizzazione della progenie di cellule che durante lo sviluppo. Questo protocollo utilizza MEM-RFP mRNA, membrana codifica mirata proteina fluorescente rossa 12, come tracciante lignaggio. Il tecnico microiniezione miratoniche per i singoli blastomeri in embrioni di 4 e 8 celle qui descritti possono essere utilizzati per l'iniezione con morpholinos per abbattere l'espressione genica, o con l'RNA esogeno di iperespressione di un gene di interesse. Iniettando nella ventrale, blastomeri vegetale, in primo luogo i pronephros dell'embrione saranno mirati, lasciando i pronephros controlaterale come controllo dello sviluppo. Co-iniezione di un tracciante verifica che il blastomere corretto è stato iniettato, e mostra quali tessuti nell'embrione nasce dalla blastomero iniettato, verificando mira dei pronephros. Immunocolorazione dei pronephros permette la visualizzazione di come tubuli pronephric sono stati presi di mira. Sovraespressione e knockdown effetti possono essere ottenuti contro il lato controlaterale dell'embrione, che serve come controllo dello sviluppo, e possono essere utilizzati per calcolare l'indice pronephric 13. La disponibilità di mappe destino delle cellule permette questa tecnica microiniezione mirato da utilizzare per indirizzare i tessuti OTHer rispetto alle pronephros e co-iniezione di un tracciante fluorescente permette la microiniezione mirato per ciascun tessuto da verificare prima dell'analisi.
Durante embrione microiniezione, la temperatura di sviluppo dovrebbe essere regolata strettamente, dato che il tasso di sviluppo di Xenopus è fortemente dipendente su di esso 14. Gli embrioni devono essere incubate a temperature più fredde (14 - 16 ° C) per preparazioni iniettabili 4 e 8-cell, perché il tempo di sviluppo è rallentato. A 22 ° C, tempo di sviluppo dallo stadio 1 (1 cellula) alla fase 3 (4 celle) è di circa 2 ore, mentre a 16 ° C il tempo di sviluppo alla fase 3 è di circa 4 ore. Ci vogliono circa 15 minuti per andare da un embrione a 4 celle a 8 celle (fase 4) embrione a 22 ° C, ma richiede circa 30 minuti a 16 ° C. Allo stesso modo, a 22 ° C, ci vogliono solo 30 minuti per un embrione a 8 celle a progredire a un embrione di 16 cellule (fase 5). Questo tempo è aumentato a 45 minuti a 16 ° C. Ilto, è è utile a rallentare il tasso di sviluppo degli embrioni per consentire un tempo sufficiente per iniezioni nello stadio di 8 cellule prima gli embrioni passare alla fase 16 cellule. Inoltre, le temperature di crescita possono essere modulate per accelerare o rallentare lo sviluppo embrionale fino a quando il rene è completamente sviluppato.
L'epidermide di girino stadio Xenopus embrioni è relativamente trasparente, consentendo una facile l'imaging dei pronephros in via di sviluppo senza dissezione o compensazione del tessuto 15. A causa della relativa trasparenza di embrioni di Xenopus, l'imaging cellulare dal vivo è anche fattibile 16,17. Tutto il montaggio immunocolorazione per visualizzare le pronephros è possibile con anticorpi stabilito che etichettano prossimale, intermedio, distale e tubuli di collegamento della fase 38 - 40 embrioni che permettono di valutare lo sviluppo pronephric dopo la manipolazione dell'espressione genica mirata in Xenopus embrioni 18-20.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato dalla University of Texas Health Science Center presso il Centro di Houston per animali da laboratorio Animal Medicine Comitato Welfare, che serve come cura e del Comitato Istituzionale Usa (protocollo #: HSC-AWC-13-135).
1. Identificazione e selezione dei blastomeri per iniezioni renali mirati
- Prima di generare embrioni, utilizzare la tabella Normale di Xenopus Sviluppo 21 per capire l'orientamento delle divisioni cellulari primi nell'embrione. In alternativa, gli schemi di accesso dei primi stadi di sviluppo di Xenopus su Xenbase 11.
- Accedere alle mappe interattive destino delle cellule Xenopus su Xenbase 11 per selezionare quali blastomere sarà mirato per microiniezione.
- Si osservi che l'embrione singola cella ha un polo animale pigmentazione scura e un polo vegetale, che è bianco e yolky. Si noti che una membrana protettiva, noto come vitellina envelope, copre l'embrione.
- Si noti che la prima scissione si verifica in genere tra i lati sinistro e destro dell'embrione. Queste cellule contribuiscono ugualmente al lignaggio pronephric.
- Si noti che la seconda scissione divide la dorsale e metà ventrali dell'embrione, portando ad un embrione 4 celle. Le cellule dorsali sono più piccoli e hanno meno pigmento rispetto alle cellule ventrale (Figura 2A e la Figura 3A).
- Identificare i blastomeri ventrale (V; i grandi, cellule scure) sui lati sinistro e destro, che contribuiscono di più al rene in via di sviluppo rispetto alla dorsale (D; piccole celle luce) blastomeri (Figura 2A).
- Se l'iniezione in un embrione a 4 celle, iniettare il blastomeri ventrale sinistro per colpire il rene sinistro (figura 3A e la Sezione 3).
- La terza fenditura biseca lati animali e vegetali, risultante in un embrione di otto cellule. A questo punto, ci sono quattro blastomeri animali [a destra ea sinistra ventrale(V1) e dorsale (D1)] e quattro blastomeri vegetali [sinistra e destra ventrale (V2) e dorsale (D2)] (Figura 2B e Figura 3B).
- Individuare i blastomeri, vegetali ventrali (V2). Questi blastomeri contribuire maggiormente al rene sviluppare eventuali altre cellule in questa fase (Figura 2B). Per indirizzare il rene sinistro di un embrione di 8 cellule, iniettare il V2 blastomere sinistra (Figura 3B e la Sezione 3).
- Si noti che il quarto e quinto spaccature si intersecano i blastomeri animali e vegetali. Due progenie sono generati da ciascuna blastomere, risultando in un embrione di 16 cellule. Le cellule sono chiamati dopo il loro predecessore. Ad esempio, il blastomero V2 dallo stadio 8 cellule dà origine a V2.1 e V2.2 progenie allo stadio di 16 cellule (Figura 2C). La cella V2.2 allo stadio di 16 cellule fornisce la maggior parte delle cellule che contribuiscono al rene sviluppo.
- Nota fratture sesto e settimo comportano un Embry 32 celleo. Anche in questo caso, due discendenti sono generati da ogni blastomeri, che prendono il nome dopo la loro predecessore. Ad esempio, il blastomero V2.2 dalla fase 16 cellule dà origine a V2.2.1 e V2.2.2 nella fase 32 cellule. C'è un sistema di denominazione alternativa nella fase 32 cellule in cui le cellule vengono identificate in quattro righe come A, B, C, e D (da animale a vegetale), e in quattro colonne 1, 2, 3, e 4 ( da dorsale ventrale). Così, il blastomeri V2.2.2, che contribuisce più ai pronephros in via di sviluppo, si chiama C3 con questo sistema di denominazione alternativa (Figura 2D).
2. Preparazione di embrioni
- Preparare 50 ml di Dejelly Solution (2% cisteina, NaOH a pH 8,0).
- Isolare entrambi i testicoli da una singola rana maschio secondo protocolli standard 14. Mettere i testicoli in una capsula di 60 millimetri di Petri riempita con 10 ml di testicoli Storage Solution (di 1x Marc Modified Ringers [MMR; 0,1 M di NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA] 12, 1% di albumina sierica bovina, 50 ug / ml di gentamicina). Conservare i testicoli a 4 ° C.
Nota: I testicoli possono essere conservati per circa 7 - 10 giorni a 4 ° C, ma l'efficienza di fecondazione diminuirà il più i testicoli sono stati memorizzati. - Spremere una rana femminile per ottenere le uova secondo protocolli standard 14. Raccogliere le uova in un 100 millimetri piastra di Petri. Versare l'acqua in eccesso.
- Tagliare ¼ di testicoli mentre è in testicoli soluzione di conservazione con pinze e una lama di rasoio. Trasferire il pezzo di testicoli alla piastra di Petri contenenti uova. Regolare la dimensione della porzione testicoli utilizzato per conto per la dimensione del testicolo, da quanto tempo è stato memorizzato il testicolo, e quante uova devono essere fecondato. Generalmente usare ¼ a 1/3 di un testicolo fresco sezionato per fertilizzare una frizione di uova.
- Tagliare la parte del testicolo in piccoli pezzi con pinze e una lama di rasoio. Aggiungere abbastanza MMR 0.3x+ 30 mg / ml gentamicina al piatto Petri per coprire le uova. Agitare la MMR nel piatto di mescolare.
- Attendere circa 30 minuti per la fecondazione avvenga a temperatura ambiente. Si noti che l'emisfero animale (lato pigmentata dell'embrione) siederà sopra l'embrione upon concimazione efficace. Poi, rimuovere il MMR dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento. Aggiungere sufficiente soluzione Dejelly al piatto per coprire gli embrioni.
- Nel corso dei prossimi minuti, agitare delicatamente il piatto in modo intermittente. agitazione vigorosa del piatto in questo momento può causare difetti assi. Il cappotto gelatina su embrioni si dissolverà, e gli embrioni si riuniscono nel centro del piatto durante vorticoso. Una volta che gli embrioni sono strettamente toccano nel centro del piatto, rimuovere la soluzione Dejelly con una pipetta di trasferimento. Non lasciare gli embrioni nella soluzione Dejelly per più di 5 minuti, o gli embrioni possono essere danneggiati.
- Lavare gli embrioni dejellied 3 - 5 volte a 0.3xMMR + 30 mg / ml di gentamicina con attenzione versando o pipettaggio fuori MMR e riempiendo il piatto con nuova MMR. Non rimuovere tutto il MMR dal piatto, o gli embrioni possono essere danneggiati.
- Rimuovere eventuali uova non fecondate o pezzi di testicoli dalla piastra di Petri con una pipetta di trasferimento.
- Incubare gli embrioni tra i 14 ei 22 ° C.
Nota: embrioni coltivati a temperature inferiori sviluppano più lentamente rispetto embrioni coltivati a temperature più elevate. Tempi di stadi di sviluppo può essere trovato sul Xenbase 22.- Per distanziare il loro sviluppo, posto metà degli embrioni da un singolo fecondazione in una capsula di Petri mantenuta a 14 ° C, e l'altra metà degli embrioni in una capsula di Petri mantenuta a 18 ° C. Questo permette per due serie di iniezioni in embrioni di 4 cellule o 8 celle da un'unica fecondazione.
3. preparazione di soluzioni iniezione e la microiniezione di embrioni
- Preparare la soluzione iniettabile contenente 0,01ng / nl proteine di membrana rosso fluorescente (MEM-RFP) mRNA 9, mentre gli embrioni stanno sviluppando alla fase 4 celle o 8 celle. Conservare la soluzione di iniezione sul ghiaccio fino al momento per iniettare.
- Caricare un "tubo capillare di vetro sostituzione in un estrattore ago, con la parte superiore del tubo di sostituzione allineato con la sommità della cassa dell'ago estrattore. Impostare il valore di calore ° 2 a 800, e il valore di tiro al 650. Premere il" 7 tirare "per tirare l'ago. Ciò creerà 2 aghi da un singolo 7" tubo capillare di vetro.
- Tagliare la punta di un ago tirato con un paio di pinze Dumont.
Nota: Dopo aver tirato l'ago, la punta è sigillata chiusa e deve essere tagliato aperto. Il più vicino al punto dell'ago che viene tagliato, minore è il diametro della punta dell'ago sarà. Anche se il diametro della punta non influenzerà il volume di iniezione con il sistema di microiniezione usato qui, una punta con un diametro più grande è più probabile che danneggiare l'embrione. - Infilare il micropipette pinza sul retro dell'ago. Successivamente, scivolare l'O-ring foro grande sul retro dell'ago dietro la pinza.
- Riempire l'ago con olio minerale con un ago ipodermico calibro 27, facendo attenzione a non ottenere bolle d'aria nel ago.
- Infilare l'ago sulla stantuffo della microinjector, sedere l'ago nel foro grande del distanziatore plastica bianca installata sul pistone. Il pistone deve avere un piccolo O-ring più vicino al corpo del microinjector, seguito dal distanziale bianco, grande O-ring buche e pinza. Fissare l'ago stringendo la pinza. Tirare delicatamente l'ago per assicurarsi che sia fissata correttamente.
- Premere e tenere premuto il tasto "vuoto" sulla scatola di comando microinjector fino a quando ci sono due segnali acustici.
- Pipettare 3 ml di soluzione per l'iniezione su un pezzo di Parafilm. Inserire la punta dell'ago nella goccia di soluzione di iniezione sul Parafilm. Premere e tenere premuto il pulsante "riempire" il microinjector scatola di controllo per disegnare la soluzione iniezione nel ago.
- Riempire un piatto 60 millimetri Petri foderato con 500 micron di poliestere maglia con il 5% Ficoll a 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina. pipetta con attenzione 20 - 30 embrioni a 4 celle o 8 celle nel piatto.
- Con un'ansa capelli 14, manipolare gli embrioni in modo che il blastomere da iniettare è di fronte all'ago. Per indirizzare il rene sinistro, allineare gli embrioni in modo che i blastomeri ventrale sinistro di embrioni a 4 cellulari o blastomeri V2 sinistra di embrioni 8 celle si affacciano sul ago.
- Iniettare 10 nl di soluzione di iniezione nel blastomere selezionata di ogni embrione nel piatto.
Nota: La mesh sul fondo del piatto Petri stabilizza gli embrioni e impedisce loro di laminazione, permettendo loro di essere iniettato senza l'uso di un anello di capelli per la stabilizzazione. - Trasferimento iniettato embrioni nei pozzetti di una piastra di coltura che sono stati riempiti con 5% Ficoll in 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina. Incubare l'embrione iniettatos a 16 ° C per almeno un'ora per consentire i blastomeri iniettati di guarire.
- Trasferire gli embrioni guarite in pozzetti di una nuova piastra di coltura che sono stati riempiti di 0.3x MMR + 30 mg / ml di gentamicina per stadio 9 (prima della gastrulazione).
- Incubare gli embrioni a 14-22 ° C, fino a raggiungere gli embrioni fase 38-40 21.
4. Fissazione e Immunocolorazione di embrioni
- Preparare 50 ml di MOPS / EGTA / solfato di magnesio / Formaldeide Buffer [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4, 3,7% (v / v) di formaldeide].
- Usando una pipetta di trasferimento, mettere 10-20 stadio 38 - 40 embrioni in un flaconcino di vetro. Aggiungere 10 ml 5% benzocaina in 100% di etanolo al flaconcino e invertito flacone per mescolare. Attendere 10 minuti per anestetizzare gli embrioni.
- Rimuovere la MMR dalla fiala usando una pipetta di vetro. Se l'elaborazione più flaconi allo stesso tempo, le fiale possono essere tenuti in posizione verticale in una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti.
- Con un tubo di vetrotte, riempire il flacone con MEMFA. Posizionare il flaconcino su una piattaforma oscillante tridimensionale per 1 ora a temperatura ambiente.
- Rimuovere il MEMFA dalla fiala con una pipetta di vetro. Riempire il flacone con 100% di metanolo. Posizionare il flaconcino su una piattaforma oscillante tridimensionale per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta, e conservare gli embrioni in metanolo 100% durante la notte a -20 ° C.
- Preparare 1x tampone fosfato isotonico-albumina sierica bovina-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml albumina sierica bovina, 0,1% Triton X-100.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario: 1x PBT con 10% siero di capra con una diluizione 1: 5 di topo monoclonale 4A6 anticorpi (per etichettare le membrane degli intermedi, distale e collegamento tubuli 20), una diluizione 1:30 di topo monoclonale 3G8 (a lume etichetta dei tubuli prossimali 20), e una diluizione 1: 250 di coniglio anticorpo policlonale RFP (per etichettare tracciante MEM-RFP). Conservare a 4 ° C.
- Preparare la Secondasoluzione di anticorpi ry: 1x PBT con il 10% di siero di capra, 1: 500 Alexa 488 di capra anti-topo IgG (magazzino concentrazione 2 mg / ml, per l'etichetta 4A6 e 3G8), e 1: 500 Alexa 555 capra anti-IgG di coniglio (magazzino concentrazione 2 mg / ml, per etichettare il tracciante MEM-RFP). Conservare a 4 ° C, che copre il tubo in un foglio per proteggere dalla luce.
- In alternativa, raccogliere gli anticorpi primari e secondari dopo la colorazione, e salvare a 4 ° C per il riutilizzo in esperimenti futuri. Se l'anticorpo deve essere salvato per il riutilizzo, aggiungere lo 0,01% di sodio azide.
- Immunostain gli embrioni utilizzando protocolli stabiliti 18.
5. Visualizzazione di embrioni e analisi dei mirata del tessuto Pronephric
- Schermo gli embrioni immunostained per verificare che il blastomere corretto è stato iniettato visualizzando la fluorescenza del tracciante sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza a 1X (per visualizzare tutto embrionale) e 5X (per visualizzare rene) ingrandimento. Luogo embrioni in una lastra di vetro multi-bene con il noiLLS pieni di 1x PBT con una pipetta di trasferimento con la punta tagliata. Manipolare gli embrioni con un ciclo di capelli. Utilizzare solo embrioni che hanno il co-iniettata tracciante presente nei pronephros sul lato sinistro dell'embrione (Figura 3C, F e Figura 4C, F) per la sovraespressione del gene o l'analisi knockdown.
- In alternativa, eliminare gli embrioni a Clear di Murray (2 parti benzoato benzilico: 1 parte benzilico alcool) posizionando gli embrioni in un flacone di vetro e riempire il flacone con Clear di Murray. Visualizza gli embrioni utilizzando una lastra di vetro bene.
Nota: Sereno di Murray è un solvente organico, e deve essere maneggiato con cura. Indossare guanti, e utilizzare solo flaconi di vetro e pipette con Clear di Murray. - embrioni Conservare a 4 ° C in 1x PBT per 2 - 3 settimane. Per la conservazione a lungo termine di embrioni, disidratano gli embrioni lavando due volte in metanolo 100% a temperatura ambiente per 10 min. Conservare gli embrioni a -20 ° C in 100% metanolo.
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Representative Results
Microiniezioni di 4 e 8-cell embrioni di Xenopus con MEM-RFP mRNA mostrano diversi livelli di targeting ai pronephros. Figura 4 spettacoli 40 embrioni con MEM-RFP pattern di espressione di mRNA corretti. Gli embrioni sono stati iniettati nel blastomere ventrale sinistro (Figura 4A), e ordinati per il corretto pattern di espressione di MEM-RFP mRNA. Oltre ad esprimere MEM-RFP nel prossimale, intermedio, distale e collegando tubuli del rene, embrioni correttamente iniettati dovrebbero mostrare fluorescenza nell'epidermide della testa, tronco e coda. Essi dovrebbero anche mostrare la fluorescenza nella otocyst, ghiandola cemento, proctodeum, e somiti (Figura 4C). La distribuzione di MEM-RFP fluorescenza nei reni di 8 embrioni correttamente iniettati stata determinata con uno stereomicroscopio a fluorescenza (Figura 4B). Gli embrioni con alti livelli di espressione MEM-RFP nell'epidermide chebloccato il rilevamento delle regioni renali sono stati segnati come "occluso". espressione MEM-RFP è stato rilevato nel prossimale, tubuli intermedi, distali e di collegamento di tutti gli embrioni che non sono stati segnati come occlusa. Stereoscope (Figura 4D-F) e microscopi confocale (Figura 4G-I) sono stati utilizzati per verificare la co-localizzazione di MEM-RFP e tessuto renale immunostained con 3G8 e 4A6. confocale verificato la co-localizzazione di MEM-RFP con prossimale, intermedio, tubuli distali e di collegamento del rene, che indica che la microiniezione di MEM-RFP nella blastomere ventrale sinistro si rivolge correttamente il rene.
Embrioni iniettati con MEM-RFP mRNA allo stadio 8 cellule (Figura 5A) mostrano una gamma ristretta di tessuti visualizzazione a fluorescenza, indicando che le iniezioni 8 celle riducono la potenzialità di effetti secondari al rene. Come embrioni iniettati a 4 celle fase, embryo iniettato a 8 cellule esposizione della fase di fluorescenza nel prossimale, intermedio, tubuli distali e collegamento del rene, nonché i somiti e proctodeum (Figura 5C-F). A differenza di embrioni iniettati nella fase 4 celle, la ghiandola cemento e otocyst non sono etichettati con MEM-RFP. Su 10 embrioni mirate, un embrione mostrato MEM-RFP in quasi tutti i tubuli prossimali e 3 mostrato MEM-RFP in quasi tutti i tubuli intermedi e distali del rene (Figura 5B). I tubuli di collegamento di 7 embrioni sono stati parzialmente etichettati con MEM-RFP. Inoltre, i reni di embrioni iniettati nella fase 8 cellule erano più facili da visualizzare, e solo uno è stato ottenuto come occlusa. Co-localizzazione di MEM-RFP e anticorpi etichettatura del rene (3G8 e 4A6) è stato determinato utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 5D-F), e verificato utilizzando un microscopio confocale (Figura 5G-I). Il prossimale, intermedio, distale e collegamento tubules del rene sono stati etichettati con MEM-RFP in embrioni iniettati allo stadio di 8 cellule, dimostrando che aveva come obiettivo l'iniezione del blastomero V2 etichette rene durante la visualizzazione di fluorescenza in un minor numero di tessuti di embrioni iniettati nel blastomere ventrale sinistro al 4 celle palcoscenico.
Questo metodo usa una fluorescenza etichettato mRNA come tracciante per indicare quali tessuti sono stati bersaglio di microiniezione. E 'importante per lo screening degli embrioni per la localizzazione tracciante coerente prima dell'analisi, e gli eventuali embrioni che per non visualizzare il modello di distribuzione del tracciante previsto deve essere eliminata. La figura 6 mostra un esempio di uno stadio 40 embrione che è stato erroneamente preso di mira con MEM-RFP mRNA a la fase 4 celle. Espressione dell'mRNA MEM-RFP si trova sul lato destro dell'embrione anziché sul lato sinistro (figura 6A). Inoltre, la maggior parte del mRNA è nella pelle del tronco inferiore e coda, conpoco espressione nei somiti. Nessuna espressione mRNA è visto nel prossimale, intermedio, distale e tubuli collegamento (figura 6B), confermando il targeting improprio del rene. Pertanto, questo embrione non deve essere utilizzato per l'analisi.
Figura 1:. Xenopus embrionale del rene Schema del rene di una fase embrionale di Xenopus 35, che mostra la prossimale, intermedio, distale, e il collegamento tubuli. Sulla base Raciti et al. (2008) 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Xenopus embrionali mappe destino. Fate mappe identificare e denominare i blastomeri che contribuiscono alle pronephros in via di sviluppo. A) Il destino mappa di un embrione a 4 celle. B) Il destino mappa di un embrione a 8 celle. C) Il destino mappa di un embrione di 16 cellule. D) Il destino mappa di un embrione di 32 cellule. Blastomeri dell'embrione a 32 cellule sono etichettati utilizzando un sistema di denominazione blastomeri alternativo. Mappe Fate basate su Moody (1987) 8, 9 e Moody e Kline (1990) 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Schema di iniezione per il targeting la Xenopus pronephros frecce rosse indicano la cella per iniettare. A) degli animali e vista ventrale di un embrione a 4 celle che mostra l'iniezione di sinistra ventrale blastomere di indirizzare i pronephros sinistra. Le frecce rosse indicano il blastomeri ventrale sinistro. B) degli animali e vista ventrale di un embrione di 8 cellule che mostra l'iniezione del blastomero V2 sinistra di indirizzare il pronephros sinistra. Le frecce rosse indicano il blastomeri V2 sinistra. AB) Immagini di embrioni taken on uno stereoscopio a 4X ingrandimento. Iniezioni basate sul destino Xenopus le mappe sviluppate da Moody (1987) 8, 9 e Moody e Kline (1990) 7. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Esempi di embrioni mirati alla fase 4 celle fase immunostained 40 embrioni di Xenopus che mostrano l'iniezione mirata alle pronephros sinistra nella fase 4 celle utilizzando MEM-RFP mRNA come tracciante. etichette MEM-RFPmembrane dei globuli rossi. A) Schema che mostra l'iniezione di MEM-RFP mRNA nel blastomere ventrale sinistro di un embrione di 4 celle. B) Tessuto localizzazione del MEM-RFP fluorescenza nei reni di embrioni correttamente iniettati. C) Fase 40 embrioni iniettati con MEM-RFP nel blastomere ventrale sinistro nella fase 4 celle. localizzazione MEM-RFP è mostrato in rosso, mentre il rene è etichettato verde. ingrandimenti 1X. D) del rene colorato con 3G8 per etichettare il lume dei tubuli prossimali, e 4A6 per etichettare le membrane delle cellule nei tubuli intermedi, distale e di collegamento. ingrandimento 5X. E) L'allargamento della regione sopra il rene che mostra la localizzazione MEM-RFP. ingrandimento 5X. immagine F) uniti mostrando co-localizzazione del tracciante MEM-RFP con il rene. ingrandimento 5X. CF) Immagini di embrioni scattate con una fotocamera Olympus DP71 su uno stereoscopio. G) immagine confocale del rene di un secondo embrione macchiato con 3G8 e 4A6. H) Localizzazione di MEM-RFP nel rene e tessuto circostante. I) è fusa immagine shoala co-localizzazione di MEM-RFP, 3G8, e 4A6 nel rene. GI) immagini confocale utilizzando la massima proiezione a 20X di ingrandimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:. Esempi di embrioni mirati alla Fase 8 celle fase immunostained 40 embrioni di Xenopus che mostrano l'iniezione mirata alle pronephros sinistra allo stadio di 8 cellule utilizzando MEM-RFP mRNA come tracciante. MEM-RFP etichette membrane cellulari rosso. A) Schema che mostra l'iniezione di MEM-RFP mRNA nel blastomere V2 sinistra di un embrione a 8 celle. B) Tessuto localizzazione del MEM-RFP fluorescenza nei reni di embrioni correttamente iniettati. C) Fase 40 embrioni iniettati con MEM-RFP nel blastomere V2 sinistra allo stadio di 8 cellule. localizzazione MEM-RFP è mostratoin rosso, mentre il rene è etichettato verde. ingrandimenti 1X. D) del rene colorato con 3G8 per etichettare il lume dei tubuli prossimali, e 4A6 per etichettare le membrane delle cellule nei tubuli intermedi, distale e di collegamento. ingrandimento 5X. E) L'allargamento della regione sopra il rene che mostra la localizzazione MEM-RFP. ingrandimento 5X. immagine F) uniti mostrando co-localizzazione del tracciante MEM-RFP con il rene. ingrandimento 5X. CF) Immagini di embrioni scattate con una fotocamera Olympus DP71 su uno stereoscopio. G) immagine confocale del rene di un secondo embrione macchiato con 3G8 e 4A6. H) Localizzazione di MEM-RFP nel rene e tessuto circostante. I) è fusa immagine che mostra co-localizzazione di MEM-RFP, 3G8, e 4A6 nel rene. GI) immagini confocale scattate con la massima proiezione a 20X di ingrandimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempio di embrione in modo non corretto mirato allo stadio di 4 cellule immunostained fase 40 di Xenopus embrione che mostra il targeting non corretta dei pronephros sinistra nella fase 4 celle utilizzando MEM-RFP mRNA come tracciante.. MEM-RFP etichette membrane cellulari rosso. A) Fase 40 embrioni che mostra la distribuzione impropria di MEM-RFP indicativo di iniezione nel blastomero errato. Oltre ad avere distribuzione del tracciante errato indicando iniezione nel blastomere corretto, questo embrione è stato iniettato sul lato destro. ingrandimenti 1X. B) immagine fusa del rene che mostra una mancanza di co-localizzazione di MEM-RFP con anticorpi etichettatura rene (3G8, 4A6). ingrandimento 5X. AB) Immagini di embrioni assunto uno stereoscopio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Targeting le pronephros di sviluppo di embrioni di Xenopus si basa sull'identificazione e iniettare la blastomeri corretta. L'iniezione del blastomero V2 di embrioni 8 celle obiettivi dei pronephros sinistra 18. Questo lascia i pronephros controlaterale destra come un controllo interno. Se morpholino knockdown o RNA sovraespressione è usato per alterare lo sviluppo del rene, i pronephros controlaterale destra possono essere utilizzati per confrontare gli effetti di knockdown gene o sovraespressione sulle pronephros sinistra. In questo caso, controlli appropriati come un morfolino controllo corrispondenti o dominante costrutto RNA negativo dovrebbero essere utilizzati in aggiunta al controllo interno controlaterale per analizzare i risultati di alterazioni nell'espressione genica. A causa della relativa trasparenza dell'embrione Xenopus, difetti renali possono essere facilmente quantificati utilizzando più tecniche. Ad esempio, silenziamento genico o sovraespressione possono essere facilmente quantificato calcolando l'indice pronephric di embrioniimmunoistochimica con anticorpi 3G8 13, che confronta lo sviluppo dei tubuli prossimali sui lati iniettati e controllo dell'embrione. Oltre a studiare sviluppo pronephric, questa tecnica può essere facilmente adattato per indirizzare altri tessuti selezionando il corretto blastomere iniettare utilizzando destino stabilito atlanti 7-10. Oltre al targeting altri tipi di tessuto, questo protocollo potrebbe anche essere usato per studiare sviluppo renale in diverse fasi. Questo protocollo guardò fase 40 embrioni colorate con anticorpi 3G8 e 4A6, che rilevano tessuto renale differenziata. Embrioni più piccoli possono essere immunoistochimica con differenti anticorpi renali, o sottoposti a ibridazione in situ 5, 6, 20. Per esempio, l'anticorpo Lim1 può rilevare i pronephros sviluppo 21, 22. Analogamente, LIM1, PAX8 e trascrizioni beta hnf1- può essere rilevata con partenza in situ ibridazione in fase 12,5 22-24 in marcatori di ibridazione in situ può essere utilizzato per rilevare diverse regioni del rene nelle fasi di sviluppo successive. Ad esempio, le sonde progettati per rilevare l'espressione di NPHS1, clckb, slc5a1 e atp1a1 nel glomo, distale e collegamento tubuli, tubuli prossimali, e l'intero organo rispettivamente, sono stati descritti 25, 5, 26, 27. La valutazione del rene in più fasi utilizzando anticorpi diversi o analisi in situ consentirebbe una migliore comprensione di come un trattamento altera sviluppo renale.
Un aspetto fondamentale di questo protocollo è la corretta selezione e identificazione del blastomere da iniettare. In questo protocollo, si descrive come bersaglio le pronephros iniettando il blastomeri sinistra V2 di embrioni 8 celle o sinistra blastomeri ventrale di embrioni a 4 celle. Se il blastomere errato viene iniettato, le pronephros non saranno mirati in modo corretto. Pertanto,è fondamentale per acquisire familiarità con lo sviluppo e la scissione delle cellule piani di primi embrioni di Xenopus prima microiniezione 28, 29. scissione degli embrioni non segue sempre le classifiche fase di sviluppo stabiliti, quindi è utile solo iniettare gli embrioni in cui le divisioni cellulari primi guardano "normale" e blastomero adeguata può essere facilmente identificato. Questo riduce il numero di embrioni che sono stati impropriamente mirati. Inoltre, è importante anche per i blastomeri dell'embrione essere completamente divisi al momento dell'iniezione. Ad esempio, se la scissione tra blastomeri V1 e V2 di un embrione di 8 cellule non è completa prima microiniezione, il tracciante può diffondere in V1 e V2. Ciò diminuirebbe l'efficienza di targeting della microiniezione, e l'embrione risultante può mostrare distribuzione del tracciante che sembra più simile a quella di un embrione iniettato nella fase 4 celle piuttosto che la fase 8 cellule.
Undall'altra parte critica di questo protocollo è la verifica che pronephros è stato adeguatamente presi di mira da microiniezione. Questo deve essere fatto prima di analizzare lo sviluppo pronephric, perché gli embrioni che non hanno avuto i pronephros correttamente mirati possono inclinare il set di dati risultante. Per verificare il corretto targeting, analizzare la distribuzione del tracciante in ogni embrione iniettato. L'iniettato (sinistra) lato dell'embrione dovrebbe visualizzare la stragrande maggioranza del tracciante fluorescente. Se il controllo (destra) dell'embrione mostra una notevole quantità di fluorescenza, allora questo embrione deve essere eliminata. In questo caso, sia il blastomeri errato è stato iniettato, o il blastomeri iniettato non avevano completato spaccati prima dell'iniezione. In secondo luogo, la fluorescenza sul (sinistra) lato dell'embrione iniettato deve correttamente indirizzare le pronephros. Se l'embrione è stato iniettato allo stadio di 8 cellule, i dorsali e ventrali somiti, piastra laterale, hindgut, proctodeum, sono attesi pelle del tronco e cresta neurale nel bagagliaio di mostrare l'influenzaorescence oltre ai pronephros 6, 29. Oltre ai tessuti incluso l'iniezione 8 celle, embrioni iniettati nella fase 4 celle dovrebbero avere una più ampia distribuzione del tracciante fluorescente nella pelle e somiti nonché il targeting del ghiandola cemento, otocyst, lente e placode olfattiva. Se l'embrione non visualizza targeting tissutale adeguata, deve essere eliminata prima dell'analisi (Figura 5).
Le iniezioni mirate descritte in questo protocollo forniscono un mezzo per manipolare l'espressione genica in un tessuto desiderato. Una limitazione di questa tecnica è che, sebbene queste iniezioni sono mirati, non influiscono solo rene sviluppo. Il 4 e 8-cell iniezioni descritto in questa tecnica sono più mirate di iniezioni fatte allo stadio unicellulare, in cui l'espressione genica sarà alterato in tutta la dell'embrione, e le iniezioni fatte allo stadio di due cellule, dove la metà della embrione display alterata del gene espliciteionico. Essi non, tuttavia, riguardano un solo tessuto. Anche se le iniezioni nei blastomeri ventrali di embrioni a 4 celle e dei blastomeri V2 di embrioni 8 celle alterano l'espressione genica nelle pronephros, hanno anche alterano l'espressione genica in altri tessuti. Altri tessuti colpiti sono la pelle, somiti, intestino, e cresta neurale. Pertanto, è importante capire che, sebbene iniezioni 4 e 8 cellule sono più mirato di una o due cellule iniezioni, saranno comunque alterare l'espressione genica in diversi tessuti. Oltre a iniettare embrioni ai 4 e 8 celle fasi, iniezioni possono anche essere eseguite nelle fasi 2-, 16 e 32 cellule. Gli embrioni iniettati nella fase 2-cellule avranno una più ampia gamma di tessuti colpiti di embrioni iniettati nelle fasi successive. Anche se più tecnicamente impegnativo, gli embrioni iniettati alle 16 e 32 celle tappe avranno una gamma più ristretta di tessuti colpiti di embrioni iniettati nelle fasi 4 e 8 celle.
La traccia stirpe MEM-RFPR è utilizzato in questo protocollo per verificare il corretto il targeting dopo la microiniezione. MEM-RFP mRNA etichette membrane cellulari dopo che le cellule hanno tradotto la proteina dalla RNA iniettato. La concentrazione di MEM-RFP lignaggio tracciante utilizzato in questo protocollo (0,1 ng del MEM-RFP mRNA in una iniezione nl 10) deve essere modificato in base alle esigenze per tenere conto per la morte degli embrioni e l'intensità del tracciante di fluorescenza desiderato. Oltre a modificare la quantità di lineage tracciante iniettato, una diversa lineage tracciante, come rodamina-destrano, punti quantici, o istochimicamente rilevabile β-galattosidasi, può essere usato al posto di MEM-RFP. traccianti Lineage diventano più diluita come le cellule si dividono, causando i livelli di fluorescenza a diminuire con l'embrione si sviluppa. Un ulteriore applicazione di questa tecnica è quello di co-iniezione di un RNA esogeno o morfolino con il tracciante lignaggio iperespressione o abbattere l'espressione di un gene di interesse. Il tracciante stirpe viene utilizzato per verificare il corretto orientamento dei pronephros, ma nonper indicare dove co-iniettata RNA esogeno o morfolino localizza nell'embrione. RNA esogeno e Morpholinos non possono diffondersi attraverso il blastomero iniettato alla stessa velocità come il tracciante co-iniettata, potenzialmente con conseguente cellule figlie che hanno il tracciante, ma non l'RNA esogeno o morfolino presenti 30. Infatti, abbiamo osservato che due diversi costrutti di RNA iniettato in una singola cella non sempre co-localizzare (dati non pubblicati). Pertanto, la presenza del tracciante in una cella non indica necessariamente che l'RNA esogeno co-iniettata o morfolino è sempre presente in quella cella.
Dettagli Questo protocollo di una procedura per il targeting microiniezione per i blastomeri che danno origine alle pronephros di sviluppo di embrioni di Xenopus. Espressione genica è spesso manipolato in embrioni di Xenopus mediante iniezione di Morpholinos o RNA esogeno, entrambi i quali possono impedire causare prime anomalie dello sviluppo, se iniettata in uno oembrioni due celle. Embrioni iniettati al singolo mostra knockdown fase cella o sovraespressione in tutte le cellule di embrioni. Se il gene è necessario per il corretto processi di sviluppo precoce, l'embrione non può sviluppare un pronephros. Le iniezioni eseguite in fasi successive, come le iniezioni 8 celle dettagliate qui, può portare a embrioni che subiscono gastrulazione e eventuale sviluppo pronephric 18. Pertanto, le iniezioni mirate discusse qui in grado di superare i difetti gastrulazione causati da alterazioni dell'espressione di alcuni geni, che consente l'embrione di progredire attraverso lo sviluppo pronephric. In futuro, questo protocollo può essere utilizzato anche per indirizzare costrutti CRISPR di blastomeri desiderati.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health NIDDK concessione (K01DK092320) e il finanziamento di avvio del Dipartimento di Pediatria presso l'Università del Texas Medical School McGovern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
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