Abstract
O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blast�ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.
Introduction
O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros 1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese 2, 3. Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) 1, 4-6 (Figura 1 Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença.
Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase 7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha 12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blast�ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados para calcular o índice pronephric 13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise.
Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele 14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 - 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido.
A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido 15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável 16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 - 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus 18-20.
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Protocol
O seguinte protocolo foi aprovado pela Universidade do Texas Health Science Center em Center em Houston para o Comitê de Animais de Laboratório de Medicina Animal Welfare, que serve como o Cuidado Institucional e Use Committee (protocolo nº: HSC-AWC-13-135).
1. Identificação e Seleção de Blastômeros para injectáveis alvo de rim
- Antes de gerar embriões, o uso de mesa normal de Xenopus 21 Desenvolvimento de compreender a orientação das divisões celulares precoces no embrião. Alternativamente, diagramas de acesso dos primeiros estágios de desenvolvimento de Xenopus em Xenbase 11.
- Acessar os mapas destino celular interativos Xenopus sobre Xenbase 11 para selecionar quais blastomere vai ser alvo de microinjeção.
- Observe que o embrião unicelular tem um pólo animais mais pigmentadas e um pólo vegetal, que é branco e yolky. Note-se que uma membrana de protecção, conhecido como o vitelina envelope, abrange o embrião.
- Note-se que a primeira clivagem ocorre normalmente entre os lados esquerdo e direito do embrião. Estas células contribuem igualmente para a linhagem pronephric.
- Note-se que a segunda clivagem divide dorsal e ventral metades do embrião, levando a um embrião de quatro células. As células dorsais são mais pequenos e têm menos pigmento do que as células ventrais (Figura 2A e a Figura 3A).
- Identificar os blastômeros ventral (V; as células grandes, escuros) nas laterais esquerda e direita, que contribuem mais para o rim em desenvolvimento do que o dorsal (D; células pequenas e leves) blastômeros (Figura 2A).
- Se a injeção em um embrião de 4 células, injetar o blastomere ventral esquerdo para atingir o rim esquerdo (Figura 3A e Seção 3).
- A terceira clivagem bissecta os lados do animal e vegetal, resultando em um embrião de oito células. Neste ponto, há quatro blastômeros animais [esquerda e direita ventral(V1) e dorsal (D1)] e quatro blastómeros vegetais [ventral esquerda e direita (V2) e dorsal (D2)] (Figura 2B e Figura 3B).
- Localize os blastômeros, vegetais ventral (V2). Estes blastómeros contribuir mais para o rim desenvolvimento de quaisquer outras células nesta fase (Figura 2B). Para atingir o rim esquerdo de um embrião de 8 células, injetar no blastomere deixou V2 (Figura 3B e Seção 3).
- Observe que os quarto e quinto clivagens bissetriz os blastômeros animais e vegetais. Dois descendentes são geradas a partir de cada um blastómero, resultando em um embrião de 16 células. As células são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o V2 blast�ero a partir da fase de 8 células dá origem a progénie V2.1 e V2.2 na etapa de 16 células (Figura 2C). A célula V2.2 no estágio de 16 células fornece a maior parte das células que contribuem para o desenvolvimento renal.
- Observe os sexto e sétimo clivagens resultar em uma Embry 32 célulaso. Mais uma vez, dois descendentes são gerados a partir de cada blastomere, que são nomeados após a sua antecessora. Por exemplo, o blast�ero V2.2 a partir do estágio de 16 células dá origem a V2.2.1 e V2.2.2 na fase de 32 células. Existe um sistema de nomenclatura alternativa na fase de 32 células em que as células são identificados em quatro linhas como A, B, C, e D (de animal para vegetal), e em quatro colunas como 1, 2, 3, e 4 ( de dorsal para ventral). Assim, o blastomere V2.2.2, o que mais contribui para as pronephros em desenvolvimento, é chamado C3 sob este sistema de nomeação alternativo (Figura 2D).
2. Preparação de Embriões
- Preparar 50 ml de Solução Dejelly (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0).
- Isolar ambos os testículos de um único rã macho de acordo com protocolos padrão 14. Colocar os testículos em um prato de 60 milímetros de Petri cheio com 10 ml de solução de armazenamento Testículos (1x Marc modificação de Ringer [MMR; 0,1 M de NaCl, KCl 2 mM, MgSO 4 1 mM, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES, pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albumina de soro bovino, 50 ug / ml de gentamicina). Armazenar os testículos a 4 ° C.
Nota: Testículos pode ser armazenado por cerca de 7-10 dias a 4 ° C, mas a eficiência de fertilização irá diminuir o tempo os testículos foram armazenados. - Espremer um sapo fêmea para obter ovos de acordo com protocolos padrão 14. Recolher os ovos em um 100 milímetros placa de Petri. Deitar fora qualquer excesso de água.
- Cortado ¼ de um testículo enquanto ele está em Testes solução de armazenamento usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Transferir o pedaço de testículo para a placa de Petri contendo os ovos. Ajustar o tamanho da porção de testículo usado para contabilizar o tamanho do testículo, quanto tempo o testículo foi armazenado, e quantos os ovos devem ser fertilizado. Geralmente usam ¼ a 1/3 de um testículo recém-dissecados para fertilizar uma ninhada de ovos.
- Corte a parte de testículo em pedaços pequenos usando uma pinça e uma lâmina de barbear. Adicionar o suficiente MMR 0,3x+ 30 mg / ml de gentamicina para a placa de Petri para cobrir os ovos. Agitar o MMR no prato para misturar.
- Aguarde cerca de 30 min para a fertilização ocorra à temperatura ambiente. Note-se que o hemisfério animais (pigmentado do lado do embrião) ficará por cima do embrião sobre a fertilização eficaz. Em seguida, retire a MMR a partir da placa de Petri com uma pipeta de transferência. Adicionar solução Dejelly suficiente para o prato para cobrir os embriões.
- Ao longo dos próximos minutos, rode suavemente o prato de forma intermitente. A agitação vigorosa do prato neste momento pode causar defeitos de eixo. O casaco de geléia sobre os embriões se dissolverá, e os embriões se reúnem no centro do prato durante a roda. Uma vez que os embriões são intimamente tocar uns aos outros no centro do prato, remover a solução Dejelly com uma pipeta de transferência. Não deixe embriões na solução Dejelly por mais de 5 minutos, ou os embriões podem ser danificados.
- Lavar os embriões dejellied 3 - 5 vezes em 0,3XMMR + 30 mg / ml de gentamicina com cuidado derramamento ou pipetagem fora da MMR e enchendo o prato com nova MMR. Não remova todo o MMR do prato, ou os embriões podem ser danificados.
- Remova todos os ovos não fertilizados ou pedaços de testículo da placa de Petri com uma pipeta de transferência.
- Incubar embriões entre 14 e 22 ° C.
Nota: Os embriões cultivados a temperaturas mais baixas desenvolver mais lentamente do que os embriões cultivados a temperaturas mais elevadas. O sincronismo de fases de desenvolvimento pode ser encontrado no Xenbase 22.- Para espaço para o seu desenvolvimento, lugar de metade dos embriões a partir de uma única fertilização em uma placa de Petri mantida a 14 ° C, e a outra metade dos embriões em uma placa de Petri mantida a 18 ° C. Isto permite que dois conjuntos de injecções em embriões de 4-celulares ou células-8 a partir de um único fertilização.
3. Preparação de soluções de injecção e microinjecção de embriões
- Prepare a solução para injecção contendo 0,01ng / nl de proteína ligada à membrana fluorescente vermelha (RFP-MEM) ARNm de 9, enquanto que os embriões estão em desenvolvimento para o estágio de 4 células ou de 8 células. Armazenar a solução injectável em gelo até estar pronto para injetar.
- Carregar um "tubo capilar de vidro de substituição em um extrator de agulhas, com a parte superior do tubo de substituição alinhado com a parte superior da caixa de agulha extrator. Defina o valor de calor # 2 a 800, eo valor de puxar para 650. Pressione o botão" 7 puxe "botão para retirar a agulha. Isto irá criar 2 agulhas de um único 7" tubo capilar de vidro.
- Cortando a ponta de uma agulha puxado com um par de fórceps Dumont.
Nota: Depois de puxar a agulha, a dica é selada e deve ser cortado. Quanto mais próximo da ponta da agulha que é cortada, quanto menor for o diâmetro da ponta da agulha será. Embora o diâmetro da ponta não afectará o volume de injecção com o sistema de microinjecção utilizado aqui, uma ponta com um diâmetro maior é mais susceptível de danificar o embrião. - Deslize o mCollet icropipette na parte de trás da agulha. Em seguida, deslizar o orifício grande junta tórica para a parte de trás da agulha atrás da pinça.
- Encha a agulha com óleo mineral utilizando uma agulha hipodérmica de calibre 27, com cuidado para não obter bolhas de ar na agulha.
- Deslizamento da agulha para o êmbolo da microinjetor, assentando a agulha no orifício grande do espaçador de plástico branco instalado no êmbolo. O êmbolo deve ter um pequeno anel de vedação mais próxima do corpo do microinjetor, seguido pelo espaçador branco, grande furo O-ring, e Collet. Fixe a agulha pelo aperto da pinça. Puxe suavemente a agulha para se certificar de que está devidamente protegidas.
- Pressione e segure o botão "vazio" na caixa de controle microinjetor até há dois sinais sonoros.
- Pipeta 3 uL de solução de injecção sobre um pedaço de Parafilm. Inserir a ponta da agulha para o talão da solução de injecção sobre o Parafilm. Pressione e segure o botão "preencher" no microinjector caixa de controlo para extrair a solução de injecção para dentro da agulha.
- Encher um prato de 60 milímetros de Petri revestidas com 500 micra de malha de poliéster com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Cuidadosamente Pipetar 20 - 30 4-celulares ou células de embriões de 8 no prato.
- Utilizando uma ansa de cabelo 14, manipular os embriões de modo que a blastómero para ser injectado está de frente para a agulha. Para atingir o rim esquerdo, alinhar os embriões de modo que os blastómeros ventral esquerdo de embriões 4-celulares ou as restantes blastómeros V2 de embriões de 8 células enfrentam a agulha.
- Injectar 10 nl de uma solução de injecção no blast�ero seleccionado de cada embrião no prato.
Nota: A malha na parte inferior da placa de Petri estabiliza os embriões e os impede de laminagem, permitindo-lhes ser injectado, sem a utilização de um circuito de cabelo para a estabilização. - Transferência de embriões injectados nos poços de uma placa de cultura que foram preenchidos com 5% de Ficoll em 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar a embriões injectadoss a 16 ° C durante pelo menos uma hora para permitir que os blastómeros injectados para curar.
- Transferir os embriões curadas em poços de uma nova placa de cultura que tenham sido cheios com 0,3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por etapa 9 (antes da gastrulação).
- Incubar os embriões a 14-22 ° C, até atingir os embriões fase 38-40 21.
4. Fixação e imunocoloração de Embriões
- Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnésio / Formaldeído buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldeído].
- Usando uma pipeta de transferência, colocado de 10 - 20 etapa 38 - 40 embriões num frasco de vidro. Adicionar 10 ul de 5% de benzocaína em etanol a 100% para o frasco e do frasco invertido para misturar. Aguarde 10 minutos para anestesiar os embriões.
- Remover o MMR do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Se o processamento de vários frascos ao mesmo tempo, os frascos podem ser mantidos na posição vertical em uma placa de cultura celular de 24 poços.
- Com um tubo de vidroTTE, encher o frasco com MEMFA. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 1 h à temperatura ambiente.
- Remover o MEMFA do frasco utilizando uma pipeta de vidro. Encha o frasco com 100% de metanol. Colocar o frasco numa plataforma oscilante tridimensional durante 10 min à temperatura ambiente. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez, e armazenar os embriões em 100% de metanol durante a noite a -20 ° C.
- Prepare 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato-Albumina de Soro Bovino Triton-(PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Triton X-100.
- Preparar a solução de anticorpo primário: 1x PBT com soro de cabra a 10%, com uma diluição 1: 5 do anticorpo monoclonal de ratinho 4A6 anticorpo (para etiquetar as membranas do intermediário, distais e túbulos de ligação 20), uma diluição de anticorpo monoclonal de ratinho 3G8 01:30 (a etiqueta lúmen dos túbulos proximais 20) e uma diluição 1: 250 de anticorpo policlonal de coelho RFP (para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C.
- Prepare o secondaA solução de anticorpo RY: 1x PBT com soro de cabra a 10%, 1: 500 Alexa IgG 488 de cabra anti-ratinho (concentração de caldo de 2 mg / ml; a etiqueta 4A6 e 3G8), e 1: anti-IgG de coelho 500 Alexa 555 cabra (estoque concentração de 2 mg / ml; para marcar o marcador MEM-RFP). Armazenar a 4 ° C, cobrindo o tubo em folha para proteger da luz.
- Em alternativa, recolher os anticorpos primário e secundário, após coloração, e guardar a 4 ° C para reutilização em experiências futuras. Se o anticorpo é para ser salvo para reutilização, adicionar 0,01% de azida de sódio.
- Imunocoloração os embriões utilizando protocolos estabelecidos 18.
5. Visualização de Embriões e Análise de Targeted Tissue Pronephric
- Peneirar os embriões imunocoradas para verificar que o blast�ero correcto foi injectado através da visualização da fluorescência do marcador fluorescente sob um estereomicroscópio em 1X (para visualizar embrião inteiro) e 5X (para ler rim) de ampliação. embriões lugar em uma placa de vidro multi-bem com o quells cheios com 1x PBT utilizando uma pipeta de transferência com a ponta cortada. Manipular os embriões com um laço de cabelo. Utilizar apenas os embriões que possuem o marcador co-injectado presente nas pronephros no lado esquerdo do embrião (figura 3C, F e Figura 4C, F) para a sobre-expressão do gene ou análise knockdown.
- Alternativamente, limpar os embriões no de Murray claro (2 partes de benzoato de benzilo: uma parte do álcool benzílico), colocando os embriões num frasco de vidro e enchimento do frasco com Murray claro. Visualize os embriões utilizando uma placa de vidro.
Nota: Murray Clear é um solvente orgânico, e devem ser manuseados com cuidado. Usar luvas, e só usar frascos de vidro e pipetas com Murray Clear. - embriões armazenar a 4 ° C em 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para armazenamento a longo prazo de embriões, os embriões desidratar por lavagem duas vezes em 100% de metanol à temperatura ambiente durante 10 min. Armazenar os embriões a -20 ° C em metanol a 100%.
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Representative Results
Microinjeções de 4 e 8 células de embriões de Xenopus com MEM-RFP mRNA mostram diferentes níveis de segmentação para os pronephros. A Figura 4 mostra estágio 40 embriões com MEM-RFP padrões de expressão de mRNA corretas. Os embriões foram injectados na blast�ero ventral esquerdo (Figura 4A), e classificadas para o padrão de expressão adequada de ARNm de MEM-RFP. Além de expressar MEM-RFP no sentido proximal, intermédio e distai ligar túbulos do rim, espera-se que os embriões injectados adequadamente para mostrar fluorescência na epiderme da cabeça, tronco e cauda. Eles também deve mostrar fluorescência na otocyst, glândula cimento, proctodeum, e somitos (Figura 4C). A distribuição da fluorescência MEM-RFP nos rins de embriões 8 adequadamente injectados foi determinado com um estereomicroscópio fluorescente (Figura 4B). Os embriões com altos níveis de expressão MEM-RFP na epidermebloqueou a detecção das regiões de rim foram pontuadas como "ocluso". expressão MEM-RFP foi detectado na proximal, túbulos intermédios, distais e de ligação de todos os embriões que não foram marcados como ocluída. Estereoscópio (Figura 4D-F) e microscopia confocal (Figura 4G-I) foram utilizados para verificar a co-localização de MEM-RFP e tecido renal imunocoradas com 3G8 e 4A6. imagem confocal verificou a co-localização de MEM-RFP com o proximal, túbulos distais e intermédias de ligação do rim, o que indica que a microinjecção de MEM-RFP para o blast�ero ventral esquerdo alvo correctamente o rim.
Os embriões injectados com MEM-RFP ARNm na fase de 8 células (Figura 5A) mostra uma gama mais estreita de tecidos que exibem fluorescência, indicando que as injecções de células-8 reduzir o potencial de efeitos secundários para o rim. Como embriões injectados no estádio de 4 células, EMBRyos injectada na fase de 8 células de fluorescência mostra na proximal,, túbulos distais e intermédias de ligação do rim, assim como os sómitos e proctodeum (Figura 5C-F). Ao contrário dos embriões injectados no estádio de 4-célula, a glândula cimento e otocyst não são rotulados com MEM-RFP. Fora de 10 embriões adequadamente orientados, um embrião mostrou MEM-RFP em quase todos os túbulos proximais e 3 mostraram MEM-RFP em quase todos os túbulos distais e intermédias do rim (Figura 5B). Os túbulos de ligação de 7 embriões foram parcialmente rotulado com MEM-RFP. Além disso, os rins de embriões injectados no estádio de 8 células eram mais fáceis de visualizar, e apenas uma foi pontuado como ocluída. A co-localização de MEM-RFP e anticorpos de rotulagem do rim (3G8 e 4A6) foi determinada usando um estereomicroscópio (Figura 5D-F), e verificada utilizando um microscópio confocal (Figura 5G-I). O proximal, intermediário, distal e conectando tubules do rim foram marcadas com MEM-RFP em embriões injetados na fase de 8 células, demonstrando que tinha como alvo injeção do blastomere V2 etiquetas do rim durante a exibição de fluorescência em menos tecidos de embriões injetados na blastomere ventral esquerdo na célula 4 etapa.
Este ensaio faz uso de um ARNm fluorescente etiquetado como um marcador para indicar que os tecidos foram alvo de microinjecção. É importante para o rastreio embriões para localização do marcador consistente antes da análise, e quaisquer embriões que não exibem o padrão de distribuição do marcador esperada deve ser descartado. A Figura 6 mostra um exemplo de um embrião em fase de 40, que foi alvo de forma incorrecta, com o ARNm MEM-RFP no a fase de 4 células. A expressão de ARNm MEM-RFP está localizado no lado direito do embrião em vez de no lado esquerdo (Figura 6A). Além disso, a maior parte da expressão de ARNm é na pele da parte inferior do tronco e cauda, compouca expressão nos somitos. Nenhuma expressão de ARNm é visto no sentido proximal, intermédio e distai túbulos de ligação (Figura 6B), confirmando a segmentação impróprio do rim. Portanto, este embrião não deve ser utilizado para a análise.
Figura 1:. De rim embrionário de Xenopus Diagrama do rim de uma fase 35 de Xenopus embrião, que mostra as extremidades proximal, intermédio, distal e túbulos de ligação. Com base em Raciti et ai. (2008) 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Xenopus embrionárias Mapas sorte. mapas Destino identificação e designação de blastômeros que contribuem para os pronephros desenvolvimento. A) O destino mapa de um embrião de 4 células. B) O destino mapa de um embrião de 8 células. C) O destino mapa de um embrião de 16 células. D) O destino mapa de um embrião de 32 células. Blastômeros do embrião 32 células também são etiquetados usando um sistema de nomenclatura de blastómeros alternativo. Mapas destino com base em Moody (1987) 8, 9 e Moody e Kline (1990) 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Esquema de injecção para Segmentação do Xenopus Pronephros setas vermelhas indicam a célula para injetar. A) Animal e vistas ventral de um embrião de 4 células mostrando injecção do b ventral esquerdolastomere para direcionar as pronephros esquerda. As setas vermelhas indicam a blastomere ventral esquerda. B) Animal e vistas ventral de um embrião de 8 células mostrando injeção do blastomere V2 esquerda para alvejar os pronephros esquerda. As setas vermelhas indicam a blastomere V2 esquerda. AB) Imagens de embriões tomadas em um estereoscópio com uma ampliação de 4X. Injecções com base no destino Xenopus mapas desenvolvido pela Moody (1987) 8, 9 e Moody e Kline (1990) 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Exemplos de embriões orientadas para o Estágio 4 células estágio imunocoradas 40 embriões de Xenopus mostrando injeção orientada para as pronephros esquerda na fase de 4 células usando MEM-RFP mRNA como marcador. etiquetas MEM-RFPmembranas das células vermelhas. A) esquemático que mostra a injecção de MEM-RFP para o ARNm de blastómeros ventral esquerdo de um embrião de quatro células. B) localização de tecido de fluorescência MEM-RFP nos rins de embriões injectados adequadamente. C) Stage 40 embriões injectados com MEM-RFP na blastomere ventral esquerdo na fase de 4 células. localização MEM-RFP é mostrado em vermelho, enquanto o rim é rotulado verde. ampliação 1X. D) de rim coradas com 3G8 para rotular o lúmen dos túbulos proximais, e 4A6 para etiquetar as membranas das células nos túbulos intermédios, distais e de ligação. ampliação de 5X. E) Alargamento da região ao longo do rim mostrando a localização MEM-RFP. ampliação de 5X. F) Incorporada imagem que mostra a co-localização do marcador MEM-RFP com o rim. ampliação de 5X. CF) Imagens de embriões tiradas com uma câmera Olympus DP71 em um estereoscópio. G) imagem confocal do rim de um segundo embrião corado com 3G8 e 4A6. H) Localização de MEM-RFP no rim e tecido circundante. I) Incorporada sho imagemasa de co-localização de MEM-RFP, 3G8 e 4A6 nos rins. GI) imagens confocal usando projeção máxima com ampliação de 20x. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Exemplos de embriões orientadas para o Estágio de 8 células estágio imunocoradas 40 embriões de Xenopus mostrando injeção orientada para as pronephros esquerda na fase de 8 células usando MEM-RFP mRNA como marcador. MEM-RFP etiquetas membranas celulares vermelho. A) mostra injecção esquemático de MEM-RFP para o ARNm de blastómeros V2 deixou de um embrião de 8 células. B) localização de tecido de fluorescência MEM-RFP nos rins de embriões injectados adequadamente. C) Stage 40 embriões injectados com MEM-RFP na blastomere V2 esquerda na fase de 8 células. MEM-RFP localização é mostradono vermelho, enquanto que o rim é rotulado verde. ampliação 1X. D) de rim coradas com 3G8 para rotular o lúmen dos túbulos proximais, e 4A6 para etiquetar as membranas das células nos túbulos intermédios, distais e de ligação. ampliação de 5X. E) Alargamento da região ao longo do rim mostrando a localização MEM-RFP. ampliação de 5X. F) Incorporada imagem que mostra a co-localização do marcador MEM-RFP com o rim. ampliação de 5X. CF) Imagens de embriões tiradas com uma câmera Olympus DP71 em um estereoscópio. G) imagem confocal do rim de um segundo embrião corado com 3G8 e 4A6. H) Localização de MEM-RFP no rim e tecido circundante. I) fundiram imagem que mostra a co-localização de MEM-RFP, 3G8 e 4A6 nos rins. GI) imagens confocais tomadas usando projeção máxima com ampliação de 20x. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplo de embrião alvo incorretamente na fase de 4 células imunocoradas estágio 40 Xenopus embrião mostrando segmentação incorrecta das pronephros esquerda na fase de 4 células usando MEM-RFP mRNA como marcador.. MEM-RFP etiquetas membranas celulares vermelho. A) Stage 40 embrião mostrando a distribuição inadequada de MEM-RFP indicativo de injecção no blastomere incorreto. Além de ter distribuição do marcador incorrecta indicando injecção no blast�ero incorrecta, esta embrião foi injectado no lado direito. ampliação 1X. B) imagem mesclada do rim, mostrando falta de co-localização de MEM-RFP com anticorpos rotulagem do rim (3G8, 4A6). ampliação de 5X. AB) Imagens de embrião tomada em um estereoscópio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda 18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sobre-expressão nas pronephros esquerda. Neste caso, os controlos adequados, tais como um grupo morfolino controlo incompatíveis ou construção de ARN negativo dominante deve ser usado em adição ao controlo interno contralateral para analisar os resultados das alterações na expressão de genes. Devido à transparência relativa do embrião de Xenopus, defeitos renais pode ser facilmente quantificada utilizando várias técnicas. Por exemplo, silenciamento de genes ou a sobre-expressão pode ser quantificada simplesmente por cálculo do índice de embriões pronephricimunocoradas com anticorpo 3G8 13, que compara o desenvolvimento dos túbulos proximais nos lados injectados e de controlo do embrião. Além de estudar o desenvolvimento pronephric, esta técnica pode ser facilmente adaptada para atingir outros tecidos, seleccionando o blast�ero adequada para injectar usando destino estabelecida mapeia 7-10. Para além de visar outros tipos de tecidos, este protocolo pode também ser utilizada para estudar o desenvolvimento do rim em diferentes fases. Este protocolo olhou para estágio 40 embriões corados com anticorpos 3G8 e 4A6, que detectam tecido renal diferenciada. Embriões menores podem ser imunocoradas com anticorpos diferentes nos rins, ou submetido a hibridação in situ 5, 6, 20. Por exemplo, o anticorpo pode detectar os lim1 pronephros desenvolvimento 21, 22. Da mesma forma, lim1, PAX8, e transcritos de p pode ser hnf1- detectada por meio de hibridação in situ de partida na etapa 12.5 22-24 em hibridização in situ pode ser usado para detectar diferentes regiões do rim em fases posteriores de desenvolvimento. Por exemplo, as sondas concebidas para detectar a expressão de nphs1, clckb, slc5a1, e atp1a1 na Glomus, distal e ligar túbulos, túbulos proximais, e todo o rim, respectivamente, foram descritos 25, 5, 26, 27. A avaliação do rim em vários estágios utilizando anticorpos diferentes ou análise in situ permitiria uma melhor compreensão de como um tratamento altera o desenvolvimento do rim.
Um aspecto fundamental deste protocolo é a correta seleção e identificação do blastomere a ser injetado. Neste protocolo, descrevemos como alvo os pronephros injectando o blastomere V2 esquerda de embriões 8 células ou o blastomere ventral esquerda de embriões de 4 células. Se o blastomere incorreto é injetado, os pronephros não serão correctamente orientada. Portanto,é fundamental para se familiarizar com os de desenvolvimento e de clivagem celular planos de embriões precoces de Xenopus antes da microinjeção 28, 29. Embryo clivagem nem sempre segue as cartas estágio de desenvolvimento estabelecidos, por isso é útil apenas para injetar embriões em que as clivagens celular precoce olhar "normal" e o blast�ero adequada pode ser facilmente identificado. Isto irá diminuir o número de embriões que foram incorrectamente orientadas. Além disso, é também importante para os blastómeros do embrião a ser completamente dividido no momento da injecção. Por exemplo, se a clivagem entre blastómeros V1 e V2 de um embrião de 8 células não é completa antes microinjecção, o traçador pode espalhar em V1, bem como V2. Isto reduziria a eficiência do direccionamento de micro-injecção, e o embrião resultante pode mostrar distribuição do marcador que se parece mais semelhante ao de um embrião injectados no estádio de 4 células, em vez de a fase de 8 células.
Aoutra parte crítica deste protocolo é a verificação de que pronephros foi devidamente orientada por microinjecção. Isso deve ser feito antes de analisar o desenvolvimento pronephric, porque os embriões que não tiveram os pronephros devidamente orientadas podem distorcer o conjunto de dados resultante. Para verificar segmentação adequada, analisar a distribuição do marcador em cada embrião injetado. A (à esquerda) lado injectado do embrião deve exibir a grande maioria do marcador fluorescente. Se o lado de controlo (direita) do embrião mostra uma quantidade substancial de fluorescência, então este embrião deve ser descartado. Se isso ocorrer, ou o blastomere incorreto foi injetado, ou o blastomere injetado não havia completado clivada antes da injecção. Em segundo lugar, a fluorescência do lado injectado (esquerdo) do embrião deve ter como alvo as pronephros correctamente. Se o embrião foi injetado na fase de 8 células, os dorsais e ventrais somites, placa lateral, intestino grosso, proctodeum, a pele do tronco e da crista neural no tronco são esperados para mostrar a gripeorescence além dos pronephros 6, 29. Para além dos tecidos listados para a injecção de 8 células, embriões injectados no estádio de 4 células devem ter uma ampla distribuição do marcador fluorescente na pele e sómitos, assim como a segmentação do glândula cimento, otocyst, lente e plac�io olfativo. Se o embrião não exibir o direccionamento adequado dos tecidos, deve ser eliminado antes da análise (Figura 5).
As injecções segmentados descritos neste protocolo proporcionam um meio de manipular a expressão do gene num tecido desejado. Uma limitação desta técnica é que, embora estas injecções são alvo, eles não influenciam apenas o rim em desenvolvimento. Os 4 e 8 células injeções descritos nesta técnica são mais segmentados do que as injeções feitas na fase de célula única, em que a expressão do gene será alterado em todo o embrião, e as injeções feito no estágio de duas células, onde a metade da embrião exibe alterado expressas geneíon. Eles não, no entanto, alvo apenas um tecido. Embora as injecções em blastómeros ventral de embriões de 4 células e os blastómeros V2 embriões de 8 células alterar a expressão genética nos pronephros, eles também alteram a expressão do gene em outros tecidos. Outros tecidos afetados incluem a pele, somitos, intestino, e crista neural. Portanto, é importante compreender que, embora as injecções de células-4- 8 e são mais específicas do que uma ou duas injecções de células, eles ainda irá alterar a expressão de genes em vários tecidos. Além injectar embriões nos 4 e 8 fases de células, preparações injectáveis também pode ser realizada nas fases 2-, 16-, e 32-celulares. Os embriões injectados no estádio de 2 células terá uma maior variedade de tecidos afectados do que os embriões injectados em fases posteriores. Embora tecnicamente mais desafiadora, embriões injetados nos 16 e 32 células estágios terão uma faixa mais estreita de tecidos afetados do que embriões injetados nas fases de células 8 4 e.
O rastreamento de linhagem MEM-RFPr é usado neste protocolo para verificar a segmentação adequada após microinjeção. MEM-RFP ARNm etiquetas membranas celulares após as células terem traduzido proteína a partir do ARN injectado. A concentração de MEM-RFP linhagem traçador utilizado neste protocolo (0,1 ng de MEM-RFP mRNA em uma injeção nl 10) deve ser modificado conforme necessário para explicar a morte do embrião e intensidade da fluorescência do marcador desejado. Além de modificar a quantidade de marcador de linhagem injectado, um marcador de linhagem diferente, tal como a rodamina-dextrano, quantum dots, ou o β-galactosidase histoquimicamente detectável, podem ser utilizados em vez de MEM-RFP. marcadores de linhagem tornar-se mais diluído como as células dividem-se, fazendo com que os níveis de fluorescência para diminuir à medida que o embrião se desenvolve. Uma aplicação adicional desta técnica é a co-administração de um RNA exógeno ou morfolino com o marcador de linhagem para sobre-expressar ou derrubar a expressão de um gene de interesse. A linhagem traçador é utilizada para verificar a correcta segmentação das pronephros, mas nãopara indicar onde o ARN ou morfolino exógeno co-injectado localiza no embrião. RNA exógeno e morpholinos pode não difundir através do blastómero injectado na mesma taxa como o marcador co-injectado, resultando potencialmente em células filhas que têm o marcador, mas não o ARN exógeno ou morfolino presente 30. Na verdade, temos observado que duas construções de RNA diferentes injetadas em uma única célula nem sempre co-localizados (dados não publicados). Portanto, a presença do marcador em uma célula que não indica necessariamente que o ARN ou morfolino exógeno co-injectado está sempre presente na célula.
Este protocolo detalha um procedimento para a segmentação de microinjeção para os blastômeros que dão origem aos pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus. A expressão genética é frequentemente manipulada em embriões de Xenopus por meio de injecção de morfolinos ou RNA exógeno, ambos os quais podem causar prevenir primeiros anomalias de desenvolvimento, se injectadas em uma ouembriões de duas células. Os embriões injectados no knockdown exibem fase única célula ou a sobre-expressão em todas as células do embrião em desenvolvimento. Se o gene é necessário para os processos iniciais de desenvolvimento apropriadas, o embrião pode não se desenvolver um pronephros. As injecções realizadas em fases posteriores, tais como as injecções de células-8 aqui detalhadas, pode resultar em embriões que se submetem a gastrulação e eventual desenvolvimento pronephric 18. Por conseguinte, as injecções segmentados discutidas aqui podem superar os defeitos gastrulação causadas pela alteração da expressão de alguns genes, permitindo que o embrião para o progresso através do desenvolvimento pronephric. No futuro, este protocolo pode também ser usado para alvejar construções CRISPR para blastômeros desejados.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma National Institutes of Health subvenção NIDDK (K01DK092320) e financiamento de arranque do Departamento de Pediatria da Universidade do Texas McGovern Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
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