Abstract
Le rein embryonnaire de Xenopus laevis (grenouille), pronéphros, se compose d'un seul néphron, et peut être utilisé comme modèle pour les maladies rénales. Embryons de Xenopus sont grandes, à développer l' extérieur et peuvent facilement être manipulés par micro - injection ou des interventions chirurgicales. En outre, les cartes du destin ont été établis pour les premiers embryons de xénope. microinjection ciblée dans le blastomère individu qui finira par donner naissance à un organe ou d'un tissu d'intérêt peut être utilisé pour surexprimer sélectivement ou renverser l'expression des gènes dans cette région restreinte, ce qui diminue les effets secondaires dans le reste de l'embryon en développement. Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser des cartes de destin Xenopus établies pour cibler le rein en développement Xenopus (les pronéphros), par microinjection dans blastomère spécifique d'embryons 4 et 8 cellules. L'injection de traceurs de lignée permet de vérifier le ciblage spécifique de l'injection.Après les embryons se sont développés à l'étape 38 - 40, toute monture immunocoloration est utilisé pour visualiser le développement pronephrique, et la contribution des cellules ciblées aux pronéphros peut être évaluée. La même technique peut être adaptée pour cibler d'autres types de tissus, en plus des pronéphros.
Introduction
Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l'extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros 1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L'unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse 2, 3. Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , 1, 4-6 (figure 1 Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l'étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie.
Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase 7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro - injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d' autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l'ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente 12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l'injection avec morpholinos pour abattre l'expression des gènes, ou avec de l'ARN exogène pour surexprimer un gène d'intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l'embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d'un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l'embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l'embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l'indice pronephrique 13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d'un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l'analyse.
Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle 14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 - 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l'étape 1 (1 cellule) à l'étape 3 (4 cellules) est d'environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l'étape 3 est d'environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d'un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu'à ce que le rein a pleinement développé.
L'épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu 15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible 16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l' étape 38 - 40 embryons qui permettent d'évaluer le développement pronephrique après manipulation de l' expression du gène ciblé dans les embryons de xénope 18-20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant a été approuvé par l'Université du Texas Health Science Center au centre de Houston pour des animaux de laboratoire Comité de médecine bien-être animal, qui sert de soins en établissement et l'utilisation Comité (protocole #: HSC-AWC-13-135).
1. Identification et sélection des blastomères pour Injections de rein ciblées
- Avant de générer des embryons, utiliser le tableau normal du Xenopus développement 21 pour comprendre l'orientation des divisions cellulaires précoces dans l'embryon. Sinon, l' accès des diagrammes des premiers stades de développement Xenopus sur Xenbase 11.
- Accédez aux Xenopus cartes interactives du destin cellulaire sur Xenbase 11 pour sélectionner blastomère sera ciblée pour la microinjection.
- Observez que l'embryon de cellule unique a un pôle animal sombre pigmentée et un pôle végétal, qui est blanc et yolky. A noter qu'une membrane de protection, connue sous le vitelline envelope, couvre l'embryon.
- Notez que la première coupure se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l'embryon. Ces cellules contribuent également à la lignée pronephrique.
- Notez que le deuxième clivage sépare la partie dorsale et ventrale moitiés de l'embryon, conduisant à un embryon de quatre cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et moins de pigment que les cellules ventrales (figure 2A et la figure 3A).
- Identifier les blastomères ventrales (V, les grandes cellules, sombres) sur les côtés gauche et droit, qui contribuent plus au rein en développement que la dorsale (D; petites cellules, lumière) blastomères (figure 2A).
- Si l' injection dans un embryon 4 cellules, injecter le blastomère ventral gauche pour cibler le rein gauche (figure 3A et la section 3).
- Le troisième clivage bissecte les côtés animales et végétales, résultant en un embryon de huit cellules. À ce stade, il y a quatre blastomères animaux [gauche et à droite ventrale(V1) et dorsale (D1)] et quatre blastomères végétaux [gauche et à droite ventrale (V2) et dorsale (D2)] (figure 2B et la figure 3B).
- Localisez les, blastomères végétales ventrales (V2). Ces blastomères contribuent davantage au développement de rein toutes les autres cellules à ce stade (figure 2B). Pour cibler le rein gauche d'un embryon de 8 cellules, injecter dans le blastomère gauche V2 (figure 3B et la section 3).
- Notez que les quatrième et cinquième clivage bissectrices des blastomères animales et végétales. Deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, résultant en un embryon de 16 cellules. Les cellules sont nommées d'après leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2 à partir du stade de 8 cellules donne lieu à V2.1 , V2.2 et descendants au stade de 16 cellules (figure 2C). La cellule V2.2 au stade 16 cellules fournit la majorité des cellules qui contribuent à l'élaboration du rein.
- Notez que les sixième et septième clivages se traduisent par une 32 cellule embryo. Encore une fois, deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, qui sont nommés suivant leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2.2 à partir du stade 16 cellules donne lieu à V2.2.1 et V2.2.2 au stade 32 cellules. Il existe un système d'attribution de nom alternatif au stade 32 cellules dans lequel les cellules sont identifiées en quatre rangées A, B, C et D (de l'animal à végétale), et quatre colonnes 1, 2, 3 et 4 ( de dorsale ventrale). Ainsi, le blastomère V2.2.2, ce qui contribue le plus aux pronéphros en développement, est appelé C3 dans ce système de nommage alternatif (figure 2D).
2. Préparation d'embryons
- Préparer 50 ml de solution Dejelly (2% de cystéine, NaOH à pH 8,0).
- Isoler les deux testicules d'une seule grenouille mâle selon les protocoles standards 14. Placez les testicules dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de solution de stockage Testicules (Modifié Ringers [MMR 1x Marc; 0,1 M de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES à pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% d' albumine de sérum bovin, 50 ug / ml de gentamycine). Conserver les testicules à 4 ° C.
Remarque: Testicules peut être stocké pendant environ 7-10 jours à 4 ° C, mais l'efficacité de la fertilisation diminuera plus les testicules ont été stockés. - Déposer une grenouille femelle pour obtenir des oeufs selon des protocoles standard 14. Ramassez les oeufs dans une boîte de Pétri de 100 mm. Verser tout excès d'eau.
- Couper ¼ de testis alors qu'il est dans une solution de stockage à l'aide de pinces et Testicules une lame de rasoir. Transférer le morceau de testis à la boîte de Petri contenant des œufs. Ajuster la taille de la partie testiculaire utilisée pour tenir compte de la taille des testicules, combien de temps le testicule a été stocké, et combien d'oeufs doivent être fécondé. Généralement utiliser ¼ à 1/3 d'un testicule fraîchement disséqués pour fertiliser un embrayage d'œufs.
- Couper la partie testiculaire en petits morceaux à l'aide de pinces et d'une lame de rasoir. Ajouter suffisamment 0.3x MMR+ 30 mg / ml de gentamicine à la boîte de Pétri pour couvrir les oeufs. Agiter le MMR dans le plat pour mélanger.
- Attendez environ 30 minutes pour la fécondation ait lieu à la température ambiante. Notez que l'hémisphère animal (le côté pigmentée de l'embryon) sera assis sur le dessus de l'embryon après la fécondation efficace. Ensuite, retirez le MMR de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert. Ajouter la solution Dejelly assez pour le plat pour couvrir les embryons.
- Au cours des prochaines minutes, agiter doucement le plat par intermittence. Une agitation vigoureuse du plat à ce moment peut causer des défauts d'axe. La couche de gelée sur les embryons se dissoudra, et les embryons se rassemblent dans le centre du plat pendant tourbillonnant. Une fois que les embryons sont étroitement en contact entre eux dans le centre de l'assiette, retirer la solution Dejelly avec une pipette de transfert. Ne pas laisser les embryons dans la Solution Dejelly pendant plus de 5 minutes, ou les embryons peuvent être endommagés.
- Laver les embryons dejellied 3 - 5 fois en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicine par le versant avec précaution ou pipetage hors du MMR et en remplissant le plat avec le nouveau vaccin ROR. Ne pas enlever tout le MMR de l'antenne, ou les embryons peuvent être endommagés.
- Retirez tous les œufs non fécondés ou des morceaux de testis de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert.
- Incuber embryons entre 14 et 22 ° C.
Nota: Les embryons cultivés à des températures plus basses se développent plus lentement que les embryons cultivés à des températures plus élevées. Timing des stades de développement peuvent être trouvés sur Xenbase 22.- Pour l'espace sur leur développement, le lieu de la moitié des embryons provenant d'une seule fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 ° C, et l'autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 ° C. Ceci permet d'avoir deux ensembles d'injections dans des embryons de cellules 4 ou 8 cellules à partir d'une seule fécondation.
3. Préparation des solutions d'injection et de micro-injection d'embryons
- Préparer une solution injectable contenant 0,01ng / nl protéine liée à la membrane rouge fluorescent (MEM-RFP) ARNm 9 tandis que les embryons se développent au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conserver la solution d'injection sur la glace jusqu'à ce que prêt à injecter.
- Charger un "tube capillaire en verre de remplacement dans un extracteur d'aiguille, avec la partie supérieure du tube de remplacement aligné avec la partie supérieure du boîtier aiguille de traction. Réglez le # 2 valeur de la chaleur à 800, et la valeur de traction à 650. Appuyez sur la touche" 7 tirer "pour tirer l'aiguille. Cela va créer 2 aiguilles à partir d'un seul 7" tube capillaire en verre.
- Couper la pointe d'une aiguille tirée avec une paire de pinces Dumont.
Remarque: Après avoir tiré l'aiguille, la pointe est scellé fermé et doit être coupé ouvert. Le plus proche de la pointe de l'aiguille qu'il est coupé, plus le diamètre de la pointe de l'aiguille sera. Bien que le diamètre de la pointe ne sera pas affecter le volume d'injection avec le système de microinjection utilisé ici, une pointe avec un plus grand diamètre est plus susceptible d'endommager l'embryon. - Glissez le micropipette virole sur le dos de l'aiguille. Ensuite, glisser le grand joint torique de trou sur le dos de l'aiguille derrière le collet.
- Remplissez l'aiguille avec de l'huile minérale à l'aide d'une aiguille hypodermique de calibre 27, en faisant attention de ne pas obtenir des bulles d'air dans l'aiguille.
- Glissez l'aiguille sur le piston de la micro-injecteur, d'un coin de l'aiguille dans le grand trou du blanc entretoise en plastique installé sur le piston. Le plongeur doit avoir un petit joint torique le plus proche du corps du micro-injecteur, suivie par l'entretoise blanche, grand joint torique de trou, et virole. Fixer l'aiguille en serrant la pince. Tirez doucement sur l'aiguille pour vous assurer qu'il est correctement fixé.
- Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "vide" sur la boîte de contrôle de micro-injecteur jusqu'à ce qu'il ya deux bips.
- Introduire à la pipette 3 pl de solution d'injection sur un morceau de parafilm. Insérer la pointe de l'aiguille dans le talon de la solution d'injection sur le Parafilm. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "remplir" sur le microiboîte njector de commande pour dessiner la solution d'injection dans l'aiguille.
- Remplir une boîte de 60 mm de Pétri bordée de 500 microns maille polyester avec 5% Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Pipetter prudemment 20 - 30 4 cellules ou 8 cellules d'embryons dans le plat.
- En utilisant une boucle de cheveux 14, manipuler les embryons afin que le blastomère à injecter est tournée vers l'aiguille. Pour cibler le rein gauche, aligner les embryons de sorte que les blastomères ventrales gauche d'embryons 4 cellules ou blastomères V2 gauche des embryons à 8 cellules face à l'aiguille.
- Injecter 10 nl de solution d'injection dans le blastomère choisi de chaque embryon dans le plat.
Remarque: Le maillage au fond de la boîte de Petri stabilise les embryons et les empêche de rouler, en leur permettant d'être injectées sans l'utilisation d'une boucle de cheveux pour la stabilisation. - Transfert injecté embryons dans des puits d'une plaque de culture qui ont été remplis avec 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Incuber l'embryon injectés à 16 ° C pendant au moins une heure pour permettre aux blastomères injectés à guérir.
- Transférer les embryons cicatrisées dans les puits d'une nouvelle plaque de culture qui ont été remplis de 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine par étape 9 (avant gastrulation).
- Incuber les embryons à 14-22 ° C jusqu'à ce que les embryons atteignent stade 38 - 40 21.
4. Fixation et immunocoloration des Embryons
- Préparer 50 ml de sulfate de MOPS / EGTA / magnésium / formaldéhyde tampon [MEMFA: 100 mM de MOPS (pH 7,4), 2 mM d' EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldéhyde].
- En utilisant une pipette de transfert, mettre 10 - 20 étape 38 - 40 embryons dans un flacon en verre. Ajouter 10 pi 5% benzocaïne dans 100% d'éthanol dans le flacon et inverti flacon pour mélanger. Attendre 10 min pour anesthésier les embryons.
- Retirer le RMM du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Si le traitement de plusieurs flacons en même temps, les flacons peuvent être maintenus en position verticale dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits.
- Avec un tube de verreTTE, remplir le flacon avec MEMFA. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 1 heure à température ambiante.
- Retirer la MEMFA du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Remplissez le flacon avec 100% de méthanol. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, et de stocker les embryons dans 100% de methanol pendant une nuit à -20 ° C.
- Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate-sérum-albumine bovine-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml de sérum-albumine bovine, 0,1% de Triton X-100.
- Préparer la solution d'anticorps primaire: 1x PBT avec 10% de sérum de chèvre à une dilution 1: 5 de l' anticorps monoclonal de souris 4A6 anticorps (pour marquer les membranes des tubules intermédiaires distale et de liaison 20), une dilution à 01:30 d' un anticorps monoclonal de souris 3G8 (à la lumière de l' étiquette des tubules proximaux 20), et une dilution 1: 250 d'anticorps polyclonal de lapin de RFP (pour étiqueter le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C.
- Préparer le secondasolution d'anticorps de ry: 1x PBT avec du sérum de chèvre 10%, 1: 500 Alexa 488 chèvre anti-IgG de souris (concentration en stock 2 mg / ml, à l'étiquette 4A6 et 3G8), et 1: 500 Alexa 555 chèvre anti-IgG de lapin (stocks concentration de 2 mg / ml, pour marquer le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C, recouvrant le tube en aluminium pour protéger de la lumière.
- Vous pouvez également recueillir les anticorps primaires et secondaires après coloration, et enregistrer à 4 ° C pour une réutilisation dans des expériences futures. Si l'anticorps doit être sauvegardé pour réutilisation, ajouter l'azide de sodium à 0,01%.
- Immunocoloration les embryons en utilisant des protocoles établis 18.
5. Visualisation des embryons et l'analyse des tissus ciblés pronephrique
- Tamiser les embryons immunohistochimique pour vérifier que le bon blastomère a été injecté en affichant la fluorescence du traceur fluorescent sous un stéréomicroscope à 1X (pour voir l'embryon entier) et 5X (pour voir rein) grossissement. Placer les embryons dans une plaque de verre multi-bien avec le nouslls remplis 1x PBT à l'aide d'une pipette de transfert avec la pointe coupée. Manipuler les embryons avec une boucle de cheveux. Utiliser uniquement les embryons qui ont la co-injecté traceur présent dans le pronéphros sur le côté gauche de l'embryon (figure 3C, et la figure 4C F, F) pour une surexpression du gène ou de l' analyse knock - down.
- Vous pouvez également effacer les embryons dans Murray Effacer (2 parties de benzoate de benzyle: 1 partie alcool benzylique) en plaçant les embryons dans un flacon en verre et remplir le flacon avec Murray Clear. Visualisez les embryons en utilisant une plaque de puits de verre.
Remarque: Murray Clear est un solvant organique, et doit être manipulé avec précaution. Porter des gants, et utiliser uniquement des flacons en verre et pipettes avec Murray Clear. - embryons Conserver à 4 ° C dans 1x PBT pendant 2 - 3 semaines. Pour le stockage à long terme des embryons, les embryons déshydrater en lavant deux fois dans 100% de methanol à la température ambiante pendant 10 min. Conserver les embryons à -20 ° C dans 100% de méthanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microinjections de 4 et 8 cellules d' embryons de xénope avec MEM-RFP ARNm montrent différents niveaux de ciblage pour les pronéphros. La figure 4 montre la scène 40 embryons avec des motifs appropriés d'expression de l' ARNm MEM-DP. Les embryons ont été injectés dans le blastomère ventral gauche (figure 4A), et triés pour le motif d'expression correcte du MEM-DP ARNm. En plus d'exprimer MEM-RFP dans le proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules du rein, les embryons correctement injectés devraient montrer une fluorescence dans l'épiderme de la tête, du tronc et de la queue. Ils devraient également montrer la fluorescence dans le otocyste, la glande de ciment, proctodeum et somites (Figure 4C). La distribution de la fluorescence MEM-DP dans les reins de 8 embryons injectés correctement été déterminée avec un microscope stéréoscopique fluorescent (figure 4B). Embryons avec des niveaux élevés d'expression MEM-DP dans l'épiderme quibloqué la détection des régions de rein ont été marqués comme "occlus". l'expression MEM-DP a été détectée dans les parties proximale, intermédiaire tubules, distale et de connexion de tous les embryons qui ne sont pas marqués comme occlus. Stereoscope (Figure 4D-F) et microscopie confocale (Figure 4G-I) ont été utilisés pour vérifier la co-localisation de MEM-DP et les tissus rénaux immunocoloration avec 3G8 et 4A6. l'imagerie confocale a vérifié la co-localisation de MEM-DP à l'extrémité proximale, intermédiaire, tubules distaux et de raccordement du rein, ce qui indique que la micro-injection de MEM-RFP dans le blastomère ventral gauche cible correctement le rein.
Embryons injectés avec MEM-RFP ARNm au stade 8 cellules (figure 5A) montrent une gamme plus étroite des tissus présentant une fluorescence, indiquant que les injections 8 cellules réduisent le potentiel d'effets secondaires sur les reins. Comme embryons injectés au 4 cellules stade, embryos injecté à l'émission de fluorescence de stade 8-cellulaire dans la partie proximale,, tubules distaux et intermédiaires de liaison du rein, ainsi que les somites et proctodeum (Figure 5C-F). Contrairement embryons injectés au stade 4 cellules, la glande de ciment et otocyste ne sont pas étiquetés avec MEM-DP. Sur les 10 embryons bien ciblés, un embryon a montré MEM-RFP dans presque tous les tubules proximaux et 3 a montré MEM-RFP dans presque tous les tubules intermédiaires et distales du rein (figure 5B). Les tubules de connexion de 7 embryons ont été partiellement étiquetés avec MEM-DP. En outre, les reins des embryons injectés au stade 8 cellules étaient plus faciles à visualiser, et un seul a été marqué comme occlus. Co-localisation de MEM-RFP et des anticorps étiquetage du rein (3G8 et 4A6) a été déterminée en utilisant un stéréomicroscope (Figure 5D-F), et vérifiée à l' aide d' un microscope confocal (Figure 5G-I). Le proximal, intermédiaire, distale et tu connecterbules du rein ont été marquées avec MEM-RFP dans les embryons injectés au stade 8 cellules, démontrant que vise l'injection du blastomère V2 étiquettes du rein tout en affichant la fluorescence dans moins de tissus que les embryons injectés dans le blastomère ventral gauche à la cellule 4 étape.
Cet essai utilise une fluorescence étiquetée ARNm comme marqueur pour indiquer quels tissus ont été ciblés par microinjection. Il est important de dépister les embryons pour cohérente traceur localisation avant l'analyse, et tous les embryons pour ne pas afficher le modèle de distribution du traceur attendu doit être jetée. La figure 6 montre un exemple d'une étape 40 embryon qui a été mal ciblée avec MEM-RFP ARNm au le stade 4 cellules. MEM-DP expression de l' ARNm est située sur le côté droit de l'embryon au lieu du côté gauche (figure 6A). En outre, la plupart de l'expression de l'ARNm est à la peau de la partie inférieure du tronc et de la queue, avecpeu d'expression dans les somites. Aucune expression de l' ARNm est visible dans les parties proximale, intermédiaire et distale et tubules de liaison (figure 6B), ce qui confirme le ciblage impropre du rein. Par conséquent, cet embryon doit pas être utilisé pour l'analyse.
Figure 1:. Xenopus Embryonic Kidney Diagramme du rein d'un embryon de Xenopus stade 35, montrant la partie proximale, intermédiaire, distal, et reliant tubules. Sur la base de Raciti et al. (2008) 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Xenopus embryonnaires Cartes Destin. cartes Destin identifier et nommer les blastomères qui contribuent aux pronéphros en développement. A) carte destin d'un embryon 4 cellules. B) carte destin d'un embryon de 8 cellules. carte C) Le destin d'un embryon de 16 cellules. carte D) Le destin d'un embryon de 32 cellules. Blastomères de l'embryon de 32 cellules sont également marquées à l'aide d'un système blastomère de désignation alternative. Cartes Destin basé sur Moody (1987) 8, 9 et Moody et Kline (1990) 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Schéma d'injection pour le ciblage du Xenopus pronéphros Les flèches rouges indiquent la cellule à injecter. A) des animaux et des vues ventrales d'un embryon 4 cellules montrant l'injection de la gauche b ventralelastomere pour cibler les pronéphros gauche. Les flèches rouges indiquent le blastomère ventral gauche. B) des animaux et des vues ventrales d'un embryon de 8 cellules montrant l'injection du blastomère V2 gauche pour cibler les pronéphros gauche. Les flèches rouges indiquent la blastomère V2 gauche. AB) Images d'embryons prélevés sur un stéréoscope à 4X grossissement. Injections basé sur le sort Xenopus maps développées par Moody (1987) 8, 9 et Moody et Kline (1990) 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Des exemples de Embryons ciblés au stade 4 cellules stade immunocolorée 40 embryons de xénope montrant l' injection ciblée aux pronéphros gauche au stade 4 cellules en utilisant MEM-RFP ARNm comme traceur. étiquettes MEM-DPmembranes des globules rouges. A) Schéma montrant l'injection de MEM-RFP ARNm dans le blastomère ventral gauche d'un embryon à 4 cellules. B) localisation tissulaire de fluorescence MEM-RFP dans les reins d'embryons correctement injectés. C) Etape 40 embryon injecté avec MEM-RFP dans le blastomère ventral gauche au stade 4 cellules. MEM-RFP localisation est indiquée en rouge, tandis que le rein est étiqueté vert. grossissement 1X. D) rein colorées avec 3G8 pour marquer la lumière des tubules proximaux et 4A6 pour étiqueter les membranes des cellules dans les tubes intermédiaires et distaux de connexion. grossissement 5X. E) L'élargissement de la région sur le rein montrant MEM-RFP localisation. grossissement 5X. l'image F) Fusionné montrant la co-localisation du traceur MEM-RFP avec le rein. grossissement 5X. CF) Images d'embryons prises avec un appareil photo Olympus DP71 sur un stéréoscope. G) l'image confocale du rein d'un deuxième embryon coloré avec 3G8 et 4A6. H) Localisation du MEM-RFP dans le rein et les tissus environnants. I) Fusionné l'image shoaile co-localisation de MEM-RFP, 3G8, et 4A6 dans le rein. GI) images confocale utilisant la projection maximale à un grossissement de 20x. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Des exemples de Embryons ciblés au stade de 8 cellules stade immunocolorée 40 embryons de xénope montrant l' injection ciblée aux pronéphros gauche au stade 8 cellules en utilisant MEM-RFP ARNm comme traceur. MEM-RFP étiquettes membranes cellulaires rouge. A) montrant l'injection schématique du MEM-RFP ARNm dans le blastomère V2 gauche d'un embryon de 8 cellules. B) localisation tissulaire de fluorescence MEM-RFP dans les reins d'embryons correctement injectés. C) Etape 40 embryon injecté avec MEM-RFP dans le blastomère V2 gauche au stade 8 cellules. MEM-RFP localisation est représentéeen rouge, tandis que le rein est étiqueté vert. grossissement 1X. D) rein colorées avec 3G8 pour marquer la lumière des tubules proximaux et 4A6 pour étiqueter les membranes des cellules dans les tubes intermédiaires et distaux de connexion. grossissement 5X. E) L'élargissement de la région sur le rein montrant MEM-RFP localisation. grossissement 5X. l'image F) Fusionné montrant la co-localisation du traceur MEM-RFP avec le rein. grossissement 5X. CF) Images d'embryons prises avec un appareil photo Olympus DP71 sur un stéréoscope. G) l'image confocale du rein d'un deuxième embryon coloré avec 3G8 et 4A6. H) Localisation du MEM-RFP dans le rein et les tissus environnants. image I) Fusionné montrant la co-localisation de MEM-RFP, 3G8, et 4A6 dans le rein. GI) images confocale prises avec la projection maximale à un grossissement de 20x. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Exemple d'embryon mal ciblé au stade 4 cellules immunocolorée stade 40 Xenopus embryon montrant le ciblage incorrect des pronéphros gauche au stade 4 cellules en utilisant MEM-RFP ARNm comme traceur.. MEM-RFP étiquettes membranes cellulaires rouge. A) Etape 40 embryon montrant la distribution inadéquate de MEM-RFP indicative de l'injection dans le blastomère incorrect. En plus d'avoir la distribution du traceur incorrect indiquant l'injection dans le blastomère incorrect, cet embryon a été injecté sur le côté droit. grossissement 1X. B) l'image Fusionné du rein montrant un manque de co-localisation de MEM-RFP avec des anticorps d'étiquetage du rein (3G8, 4A6). grossissement 5X. AB) Images de l' embryon pris un stéréoscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cibler les pronéphros de développer des embryons de xénope repose sur l' identification et l' injection de la bonne blastomère. L' injection de la blastomère V2 des embryons à 8 cellules cible les pronéphros gauche 18. Cela laisse les pronéphros controlatérale droite comme un contrôle interne. Si morpholino knockdown ou d'ARN surexpression est utilisé pour modifier le développement du rein, les pronéphros controlatérale droite peuvent être utilisés pour comparer les effets de knockdown de gène ou surexpression sur les pronéphros gauche. Dans ce cas, des contrôles appropriés tels qu'un morpholino de contrôle incompatibles ou dominante construction d'ARN négatif devraient être utilisés en plus du contrôle interne controlatéral pour analyser les résultats des altérations de l'expression génique. En raison de la relative transparence de l'embryon de Xenopus, des anomalies rénales peuvent être facilement quantifiés en utilisant plusieurs techniques. Par exemple, knockdown de gènes ou surexpression peuvent être simplement quantifiées en calculant l'indice pronephrique d'embryonsimmunocolorées avec l' anticorps 3G8 13 qui compare le développement des tubules proximaux sur les côtés injectés et de contrôle de l'embryon. En plus d'étudier le développement pronephrique, cette technique peut être facilement adaptée pour cibler d' autres tissus en sélectionnant le blastomère propre à injecter en utilisant le sort établi des cartes 7-10. En plus de cibler d'autres types de tissus, ce protocole peut aussi être utilisé pour étudier le développement du rein à différents stades. Ce protocole a regardé à l'étape 40 embryons colorés avec des anticorps 3G8 et 4A6, qui détectent le tissu rénal différencié. Les jeunes embryons pourraient être immunocoloration avec des anticorps différents rénaux, ou soumis à une hybridation in situ 5, 6, 20. Par exemple, l'anticorps Lim1 peut détecter les pronéphros en développement 21, 22. De même, lim1, PAX8 et transcriptions ß hnf1- peut être détectée avec l'hybridation in situ départ à l' étape 12.5 22-24 dans d' autres marqueurs d'hybridation in situ peut être utilisé pour détecter les différentes régions du rein à des stades de développement ultérieurs. Par exemple, des sondes conçues pour détecter l' expression de NPHS1, ClCKb, slc5a1 et atp1a1 dans la glomus distale et la connexion des tubules, des tubules proximaux, et l'ensemble du rein, respectivement, ont été décrits 25, 5, 26, 27. L' évaluation du rein à travers plusieurs étapes en utilisant différents anticorps ou analyse in situ permettrait une meilleure compréhension de la façon dont un traitement modifie le développement du rein.
Un aspect critique de ce protocole est la sélection et l'identification du blastomère correct à injecter. Dans ce protocole, nous décrivons comment cibler les pronéphros en injectant le blastomère V2 gauche embryons à 8 cellules ou le blastomère ventral gauche d'embryons 4 cellules. Si le blastomère incorrect est injecté, les pronéphros ne seront pas correctement ciblés. Par conséquent, ilil est essentiel de se familiariser avec les plans de développement et de clivage des cellules d'embryons précoces Xenopus avant microinjection 28, 29. Embryo clivage ne suit pas toujours les cartes de stade de développement établies, il est donc utile de seulement injecter des embryons dans lesquels les clivages cellulaires précoces semblent «normal» et le blastomère approprié peut être facilement identifié. Cela réduira le nombre d'embryons qui ont été mal ciblées. En outre, il est également important pour les blastomères de l'embryon d'être complètement divisés au moment de l'injection. Par exemple, si le clivage entre les blastomères V1 et V2 d'un embryon à 8 cellules ne sont pas complète avant la microinjection, le traceur peut se répandre dans V1 ainsi que V2. Cela permettrait de réduire l'efficacité du ciblage de la micro-injection, et l'embryon résultant peut montrer la distribution du traceur qui ressemble davantage à celle d'un embryon injecté au stade 4 cellules plutôt que le stade de 8 cellules.
Unautre élément essentiel de ce protocole est de vérifier que pronéphros a été correctement ciblés par microinjection. Cela doit être fait avant d'analyser le développement pronephrique, parce que les embryons qui n'ont pas eu les pronéphros bien ciblées peuvent fausser le jeu de données résultant. Pour vérifier un ciblage approprié, analyser la distribution du traceur dans chaque embryon injecté. Le côté (gauche) injecté de l'embryon doit afficher la grande majorité du traceur fluorescent. Si le côté commande (à droite) de l'embryon présente une quantité importante de fluorescence, alors cet embryon doit être jeté. Si cela se produit, le blastomère incorrect a été injecté, ou le blastomère injecté avait pas terminé clivé avant l'injection. Deuxièmement, la fluorescence sur le côté (gauche) injecté de l'embryon doit correctement cibler les pronéphros. Si l'embryon a été injecté au stade 8 cellules, les dorsales et ventrales somites, plaque latérale, hindgut, proctodeum, la peau du tronc et la crête neurale dans le coffre sont censés montrer la grippeorescence en plus des pronéphros 6, 29. En plus des tissus énumérés pour l'injection de 8 cellules, les embryons injectés au stade 4 cellules devraient avoir une plus large distribution du traceur fluorescent dans la peau et des somites ainsi que le ciblage de la glande de ciment, otocyste, lentille et placode olfactif. Si l'embryon ne montre pas le ciblage de tissu propre, il doit être jeté avant l'analyse (Figure 5).
Les injections ciblées décrites dans le présent protocole constituent un moyen de manipulation de l'expression génique dans un tissu souhaité. Une limitation de cette technique est que, bien que ces injections sont destinées, elles n'influencent non seulement le rein en développement. Les 4 et 8 cellules injections décrites dans cette technique sont plus ciblés que les injections effectuées au stade unicellulaire, où l'expression des gènes sera modifiée dans l'ensemble de l'embryon, et les injections effectuées au stade de deux cellules, où la moitié de la embryon affiche express du gène modifiéion. Ils ne sont cependant pas, cibler un seul tissu. Bien que les injections dans les blastomères ventrales des embryons 4-cellules et les blastomères V2 des embryons à 8 cellules modifient l'expression des gènes dans les pronéphros, ils modifient également l'expression des gènes dans d'autres tissus. D'autres tissus affectés comprennent la peau, somites, intestin, et la crête neurale. Par conséquent, il est important de comprendre que, bien que les injections de 4 et 8 cellules sont plus ciblées que d'une ou deux cellules injections, ils vont encore modifier l'expression des gènes dans de nombreux tissus. En plus de l'injection d'embryons au stade de 4 et 8 cellules, les injections peuvent également être effectuées au stade 2, 16 et 32 cellules. Embryons injectés au stade 2 cellules auront un plus large éventail de tissus affectés que les embryons injectés à des stades ultérieurs. Bien que techniquement plus difficile, les embryons injectés aux stades 16 et 32 cellules auront une gamme plus étroite de tissus affectés que les embryons injectés aux stades 4 et 8 cellules.
La lignée trace MEM-RFPr est utilisé dans ce protocole pour vérifier le ciblage approprié après microinjection. MEM-RFP ARNm étiquettes membranes cellulaires après les cellules se sont traduites par des protéines à partir de l'ARN injecté. La concentration de MEM-RFP lignée traceur utilisé dans ce protocole (0,1 ng de MEM-RFP ARNm dans une injection nl 10) devrait être modifié au besoin pour tenir compte de la mort des embryons et l'intensité de la fluorescence du traceur souhaité. En plus de modifier la quantité de traceur injecté lignée, une lignée traceur différent, tel que la rhodamine-dextrane, les points quantiques, ou la β-galactosidase détectable histochimiquement, peut être utilisé à la place du MEM-DP. Traceurs Lineage deviennent plus diluée que les cellules se divisent, ce qui provoque les niveaux de fluorescence à diminuer à mesure que l'embryon se développe. Une application supplémentaire de cette technique est de co-injecter un ARN exogène ou morpholino avec le traceur de lignage pour surexprimer ou éteindre l'expression d'un gène d'intérêt. Le traceur de la lignée est utilisée pour vérifier le ciblage correct des pronéphros, mais paspour indiquer où l'ARN exogène ou morpholino co-injecté localise dans l'embryon. ARN et morpholinos exogènes ne peuvent pas se propager à travers le blastomère injecté au même rythme que le traceur de co-injecté, entraînant potentiellement des cellules filles qui ont le traceur , mais pas l'ARN exogène ou morpholino présente 30. En fait, nous avons observé que deux constructions d'ARN différentes injectées dans une seule cellule ne sont pas toujours co-localize (données non publiées). Par conséquent, la présence du marqueur dans une cellule ne signifie pas nécessairement que l'ARN exogène ou morpholino co-injecté est toujours présent dans cette cellule.
Ce protocole décrit en détail une procédure de ciblage microinjection les blastomères qui donnent lieu à pronéphros de développer des embryons de Xenopus. L' expression du gène est souvent manipulé dans des embryons de Xenopus par injection d'ARN exogène ou morpholinos, les deux pouvant empêcher causer des anomalies du développement précoce si elle est injectée dans une ouembryons à deux cellules. Embryons injectés à l'exposition unique knockdown ou surexpression de stade de cellule dans toutes les cellules de l'embryon en développement. Si le gène est nécessaire pour les processus de développement précoce appropriés, l'embryon ne peut pas développer un pronéphros. Injections effectuées à des stades ultérieurs, tels que les injections de 8 cellules détaillées ici, peuvent entraîner des embryons qui subissent la gastrulation et le développement pronephrique éventuelle 18. Par conséquent, les injections ciblées discutées ici peuvent surmonter les défauts de gastrulation provoqués par une altération de l'expression de certains gènes, ce qui permet à l'embryon de progresser à travers le développement pronephrique. À l'avenir, ce protocole peut également être utilisé pour cibler CRISPR constructions à blastomères souhaités.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health subvention NIDDK (K01DK092320) et le financement de démarrage du département de pédiatrie à l'Université du Texas Medical School McGovern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/ml | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27 G Monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 ml Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron Polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm Screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell Culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D Mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label kidney tubules. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 Cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional - for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional - for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R.
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
