विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em> Xenopus</em> किडनी
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
Xenopus laevis (मेंढक), pronephros के भ्रूण गुर्दे एक भी नेफ्रॉन के होते हैं, और गुर्दे की बीमारी के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Xenopus भ्रूण बड़े हैं, बाहर से विकसित करने, और आसानी से microinjection या सर्जिकल प्रक्रियाओं के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है। इसके अलावा, भाग्य नक्शे जल्दी Xenopus भ्रूण के लिए स्थापित किया गया है। व्यक्तिगत blastomere है कि अंततः एक अंग या ब्याज के ऊतकों को जन्म देगा में लक्षित microinjection चुनिंदा overexpress या इस प्रतिबंधित क्षेत्र के भीतर जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक, विकासशील भ्रूण के बाकी हिस्सों में माध्यमिक प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे स्थापित Xenopus भाग्य नक्शे का उपयोग करने के लिए 4 और 8 सेल भ्रूण के विशिष्ट blastomere में विकसित Xenopus गुर्दा (pronephros), microinjection के माध्यम से लक्षित करने का वर्णन है। वंश ट्रेसर इंजेक्शन इंजेक्शन के विशिष्ट लक्ष्य-निर्धारण के सत्यापन की अनुमति देता है।भ्रूण 38 चरण के लिए विकसित किया है के बाद – 40, pronephric विकास कल्पना करने के लिए पूरे माउंट immunostaining प्रयोग किया जाता है, और pronephros को लक्षित कोशिकाओं द्वारा योगदान का आकलन किया जा सकता है। उसी तकनीक pronephros के अलावा अन्य प्रकार के ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
Xenopus भ्रूण गुर्दे, pronephros, गुर्दे की बीमारी के विकास और अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल है। भ्रूण, बाहर से विकसित आकार में बड़े होते हैं, बड़ी संख्या में उत्पादन किया जा सकता है, और आसानी microinjection या सर्जिकल प्रक्रियाओं के माध्यम से छेड़छाड़ कर रहे हैं। इसके अलावा, स्तनधारियों और उभयचर में गुर्दे की विकास शासी जीन संरक्षित कर रहे हैं। स्तनधारी गुर्दे तीन चरणों के माध्यम से प्रगति: pronephros, मेसोनेफ्रॉस, और metanephros 1, जबकि भ्रूण उभयचर एक pronephros है और वयस्क उभयचर एक metanephros है। इन गुर्दे रूपों की बुनियादी इकाई को छानने नेफ्रॉन है, और दोनों स्तनपायी और उभयचर nephrogenesis 2, 3 गुजरना करने के लिए एक ही cascades संकेत और प्रेरक घटनाओं की आवश्यकता होती है। Xenopus pronephros समीपस्थ, मध्यवर्ती बाहर का और नलिकाओं को जोड़ने से बना एक भी नेफ्रॉन होता है, और एक केशिकाजाल (स्तनधारी glomerulus के अनुरूप) 1, 4-6 (चित्रा 1 </strओंग>)। Xenopus pronephros में एकल, बड़े नेफ्रॉन वर्तमान में यह गुर्दे की बीमारी के विकास और प्रक्रियाओं में शामिल जीन के अध्ययन के लिए एक सरल मॉडल के रूप में उपयुक्त बनाता है।
सेल भाग्य नक्शे जल्दी Xenopus भ्रूण के लिए स्थापित किया गया है, और स्वतंत्र रूप से Xenbase 7-11 पर ऑनलाइन उपलब्ध हैं। यहाँ, हम विकसित Xenopus pronephros को लक्षित करने के वंश ट्रेसर के microinjection के लिए एक तकनीक का वर्णन है, हालांकि उसी तकनीक जैसे हृदय या आंखों के रूप में अन्य ऊतकों को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वंश ट्रेसर लेबल है कि एक प्रारंभिक blastomere में इंजेक्ट किया जा सकता है, विकास के दौरान कहा कि सेल की संतान के दृश्य की अनुमति (महत्वपूर्ण रंजक, fluorescently लेबल dextrans, histochemically detectable एंजाइमों, और mRNA फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग सहित) कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल सदस्य आरएफपी mRNA, एन्कोडिंग झिल्ली लक्षित लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 12 एक वंश अनुरेखक के रूप में, का इस्तेमाल करता है। लक्षित microinjection तकनीकयहाँ वर्णित 4 और 8 सेल भ्रूण में अलग-अलग blastomeres के लिए niques morpholinos ब्याज की एक जीन overexpress करने के लिए जीन अभिव्यक्ति, या exogenous शाही सेना के साथ नीचे दस्तक करने के साथ इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जा सकता है। उदर, वनस्पति blastomere में इंजेक्शन लगाने के द्वारा, मुख्य रूप से भ्रूण के pronephros लक्षित किया जाएगा, एक विकासात्मक नियंत्रण के रूप में contralateral pronephros जा रही है। एक अनुरेखक के सह इंजेक्शन की पुष्टि करता है कि सही blastomere इंजेक्ट किया गया था, और पता चलता है जो भ्रूण में ऊतकों इंजेक्शन blastomere से उठी, pronephros के लक्षित कर की पुष्टि करने। pronephros की Immunostaining कितनी अच्छी तरह pronephric नलिकाओं लक्षित किया गया है के दृश्य के लिए अनुमति देता है। Overexpression और पछाड़ना प्रभाव तो भ्रूण है, जो एक विकासात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के contralateral पक्ष के खिलाफ रन बनाए जा सकते हैं, और pronephric सूचकांक 13 गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल भाग्य नक्शे की उपलब्धता इस लक्षित microinjection तकनीक अन्य संगठनों के ऊतकों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता हैएर pronephros, और एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर के सह इंजेक्शन से अनुमति देता है प्रत्येक ऊतक के लिए लक्षित microinjection विश्लेषण करने से पहले सत्यापित किया जाना है।
भ्रूण microinjection के दौरान विकास तापमान कसकर विनियमित किया जाना चाहिए, यह देखते हुए कि Xenopus विकास की यह दर 14 पर बहुत निर्भर है। 4 और 8 सेल इंजेक्शन के लिए – (16 डिग्री सेल्सियस 14) क्योंकि विकास के समय धीमा है भ्रूण कूलर तापमान में incubated किया जाना चाहिए। 22 डिग्री सेल्सियस, चरण 1 (1 सेल) से विकास के समय में मंच के लिए 3 (4 कोशिकाओं), लगभग 2 घंटे का होता है, जबकि 16 डिग्री सेल्सियस के विकास के समय में मंच के लिए 3 लगभग 4 घंटे है। यह 22 डिग्री सेल्सियस पर एक 8-सेल (स्टेज 4) भ्रूण के लिए एक 4 सेल भ्रूण से जाने के लिए लगभग 15 मिनट लगते हैं, लेकिन 16 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट लगते हैं। इसी तरह, 22 डिग्री सेल्सियस पर, यह केवल 30 मिनट के एक 8 सेल भ्रूण के लिए एक 16-सेल भ्रूण (चरण 5) के लिए प्रगति के लिए ले जाता है। इस बार 16 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए बढ़ जाती है।refore, यह भ्रूण 16 सेल चरण के लिए प्रगति से पहले 8 सेल मंच पर इंजेक्शन के लिए पर्याप्त समय सक्षम करने के लिए भ्रूण के विकास दर को धीमा करने के लिए उपयोगी है। इसके अतिरिक्त, विकास तापमान गति या भ्रूण के विकास को धीमा जब तक गुर्दे पूरी तरह से विकसित किया गया है करने के लिए संग्राहक जा सकता है।
मेढक चरण Xenopus भ्रूण की एपिडर्मिस विच्छेदन या ऊतक 15 के समाशोधन के बिना विकासशील pronephros की आसान इमेजिंग के लिए अनुमति अपेक्षाकृत पारदर्शी है। Xenopus भ्रूण के रिश्तेदार पारदर्शिता के कारण, जीवित कोशिका इमेजिंग भी संभव 16,17 है। पूरे माउंट pronephros कल्पना करने के लिए immunostaining स्थापित एंटीबॉडी कि समीपस्थ, मध्यवर्ती बाहर का और मंच के जोड़ने नलिकाओं 38 लेबल के साथ संभव है – 40 भ्रूण कि pronephric विकास के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं Xenopus भ्रूण 18-20 में लक्षित जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के बाद।
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus भ्रूण के विकास की pronephros लक्ष्य निर्धारण की पहचान करने और सही blastomere इंजेक्शन लगाने पर निर्भर करता है। 8 सेल भ्रूण के V2 blastomere इंजेक्शन बाईं pronephros 18 निशाना बनाता है। यह एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralater…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के टेक्सास McGovern मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में बाल रोग विभाग की ओर से स्वास्थ्य NIDDK अनुदान (K01DK092320) और स्टार्टअप धन का एक राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
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